Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Trekke membran nanorør fra gigantiske Unilamellar blemmer

Published: December 7, 2017 doi: 10.3791/56086
Automatic Translation
*1,2,3, *1,4, 1,4, 1,5
1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, CNRS UMR168, 2Department of Genetics and Complex Diseases, T. H. Chan School of Public Health, Harvard Medical School, 3Department of Cell Biology, Harvard Medical School, 4Sorbonne Universités, UPMC University Paris 06, 5Center for Studies in Physics and Biology, The Rockefeller University
* These authors contributed equally

Summary

Mange proteiner i cellen forstand og indusere membran kurvatur. Vi beskriver en metode for å trekke membran nanorør fra lipid blemmer å studere samspillet av proteiner eller et kurvatur-aktiv molekyl med buet membraner i vitro.

Abstract

Omforming av cellemembranen er en integrert del av mange mobilnettet fenomener, som endocytose, menneskehandel, dannelsen av filopodia, etc. Mange ulike proteiner knytte buet membraner på grunn av deres evne til å forstand eller indusere membran kurvatur. Vanligvis innebærer disse prosessene en rekke proteiner gjør dem for komplisert å studere kvantitativt i cellen. Vi beskriver en protokoll for å gjeninnføre en buet membran i vitro, etterligne en buet cellestruktur, som endocytic halsen. En gigantisk unilamellar vesicle (GUV) brukes som en modell av en celle membran, som intern trykk og overflatespenning kontrolleres med brønnene aspirasjon. Bruk et punkt trekke kraft på GUV ved hjelp av optisk pinsett oppretter en nanotube høy svingtype koblet til en flat membran. Denne metoden er tradisjonelt brukt til å måle de grunnleggende mekaniske egenskapene av lipid membraner, for eksempel bøying stivhet. De siste årene, har den blitt utvidet til å studere hvordan proteiner sammen med membran kurvatur og hvordan de påvirker formen og mekanikken i membraner. Systemet kombinerer micromanipulation, microinjection, optisk pinsett og AC confocal mikroskopi tillater måling av membran kurvatur, membran spenning og overflate tettheten av proteiner, samtidig. Fra disse målingene, kan mange viktige mekanisk og morfologiske egenskaper av protein-membranen utledes. I tillegg legger vi ut en protokoll for å skape GUVs i nærvær av fysiologiske saltkonsentrasjon, og en metode for å kvantifisere overflaten tettheten av proteiner på membranen fra fluorescens intensiteter etiketter proteiner og lipider.

Introduction

Mange mobilnettet prosesser, for eksempel endocytose, menneskehandel, dannelsen av filopodia, infeksjon, etc., er ledsaget av en dramatisk endring i form av celle membraner1,2. I cellen delta en rekke proteiner i disse prosessene ved binding til membranen og endre fasongen. De mest kjente eksemplene er medlemmer av Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR) protein familien, som inneholder en karakteristisk egentlig buet BAR domene,3,,4,,5,,6,,7. Vanligvis samhandler de med membran ved å følge BAR domenet til overflaten, og i mange tilfeller også lav å sette inn amphipathic helikser i bilayer. Form, størrelse og kostnad på BAR domenet og antall amphipathic helikser bestemmer: (1) retning av membran kurvatur (dvsom de vil indusere invaginations eller utstikkende deler), og (2) omfanget av membran kurvatur5,8. Av notatet, er her positiv kurvatur definert som den konvekse siden buet membranen, dvs, bule mot samspill partikkelen, og negative ellers. Videre kvantitative studier av BAR proteiner avdekket at deres effekt på membranen er avhengig av en rekke fysiske parametere: overflaten tettheten av proteiner, membran spenning og membran form (flat versus rørformede versus sfærisk figur)7. Avhengig av parameterne BAR proteiner kan: (1) fungere som sensorer membran kurvatur (2) bøye membraner og (3) induserer membran scission7.

På grunn av det store antallet komponenter involvert i membranen omforming i cellen, studere kvantitative aspekter av fenomener, som endocytose, er i vivo ekstremt utfordrende. In vitro rekonstituering minimal komponenter mimicking buet membraner i cellen gir midler til å få en mekanistisk forståelse av hvordan membran-buede proteiner operere. Denne artikkelen beskriver en protokoll for å gjeninnføre en membran nanotube i vitro micromanipulation, AC confocal mikroskopi og optisk pinsett. Tilnærming kan brukes til å studere, i en kvantitativ måte, hvordan proteiner og lipider små molekyler samhandle med buet membraner. Lipid GUVs brukes som modeller av en celle membran, der kurven er ubetydelig i forhold til størrelsen på samspill membran-buede molekyler. De er forberedt bruker electroformation metoden9 som blemmer er dannet av fuktighetsgivende en lipid film og hevelse det i GUVs under en vekselstrøm (AC)10. De vanligste substratene som GUVs er vokst er enten semi ledende platene belagt med indium tinn oksid (ITO) eller platina ledninger (Pt-ledninger)11. I dette arbeidet, er GUVs dyrket på Pt-ledninger som denne metoden har vist seg å fungere mye bedre enn alternativet å GUVs i nærvær av salter i bufferen12. Selv om electroformation protokollen er beskrevet her i tilstrekkelig detalj å gjengi den, henvise vi leseren til tidligere artikler som lignende metoder for å lage GUVs har blitt beskrevet i detalj13,14. I våre hender, har electroformation på Pt-ledninger ble gitt GUVs fra en blanding av syntetisk lipider eller naturlig lipid ekstrakter i en buffer som inneholder ~ 100 mM NaCl. Videre var det også mulig å innkapsle proteiner i GUVs under vekst. Et eksempel electroformation kammeret er vist i figur 1A; Den består av to ~ 10 cm lang Pt-ledninger settes inn i en holder laget av polytetrafluoroethylene (PTFE) som kan forsegles på begge sider med glass coverslips ~ 1-2 cm fra hverandre (figur 1A).

Figure 1
Figur 1: eksperimentelle oppsett. (A) GUV electroformation kammeret elektriske kontakter knyttet til Pt-ledninger. (B) venstre: eksperimentell systemet viser mikroskopet, eksperimentelle kammeret over målet og to Mikropipetter (venstre og høyre) knyttet til micromanipulators og settes inn i det eksperimentelle kammeret for rør trekke og protein injeksjon. Høyre: et nærbilde av eksperimentelle kammeret montert over målsettingen viser tips av aspirasjon og injeksjon Mikropipetter satt inn. (C) en sprøyte utstyrt med en tynn dispenser inn brønnene på baksiden slutten. Bunnen er et nærbilde av dispenser i brønnene med blå stiplet linje disponering av brønnene. Dette systemet brukes til å fylle brønnene med kasein å passivate glassoverflaten og tilbake fyll med mineralolje ved behov. (D) en systemet brukes inneholder µL mengder protein løsningen. Nålen er koblet til en sprøyte og rør som er koblet til injeksjon brønnene. Brønnene spissen er nøye nedsenket i protein løsningen og pustende så for å fylle brønnene spissen. Brønnene er så tilbake fylt med mineralolje bruker systemet vist i panel C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

En membran nanotube, alt i radius fra 7 nm å flere hundre nm, kan trekkes fra en GUV med en ekstern makt. Denne metoden ble først utviklet for å måle elastiske egenskaper for celle membraner og blemmer, for eksempel bøying stivhet15,16. I de siste verk, ble metoden utvidet til å studere samspillet av proteiner med buet membraner av microinjecting proteiner nær de trakk nanotube7,17. Andre metoder har blitt utviklet for å studere membran-buede proteiner. I en metode, er proteiner ruges med annerledes størrelse liposomer bundet til en paddivert overflate. AC confocal mikroskopi brukes til å måle protein bindingen som en funksjon av liposome diameter, som kan angi kurvatur-indusert sortering18,19. I en annen metode, er proteiner injisert nær en mikro pustende GUV å måle evnen til å indusere spontant tubuli20,21. Metoden beskrevet i denne protokollen er unikt tilpasset å studere membran-buede proteiner involvert i endocytose, hvor de fleste proteiner vanligvis møter preformed membran nanorør koble Last inneholder membran invagination med den underliggende flatskjerm plasma membran. Videre i denne metoden, er i motsetning til i analysen med bundet liten liposomer, membran nanotube kontinuerlig koblet til membranen; Derfor er det i mekanisk likevekt med GUV, en situasjon som forventet i vivo. Derfor grunnleggende membran fysikk gjelder og vi kan antyde en overflod av mekaniske egenskaper fra våre målinger22,23,24.

For en full implementering av denne metoden inkluderer nødvendig utstyr AC confocal mikroskop, optisk pinsett og en eller to Mikropipetter koblet til en vanntank (figur 1B). Ved å kombinere alle tre, er det mulig å samtidig måle membran spenning, membran kurvatur, overflate tetthet av proteiner, og rør force25. Brønnene aspirasjon er viktig og det er enkelt konstruert ved å sette inn glass brønnene i en holder som er koblet til en vanntank, som via hydrostatisk trykk, kontrollerer aspirasjon press26. Brønnene og holder, kontrolleres av en micromanipulator, og helst i én retning av en piezo-aktuator for presisjon bevegelse. Trekke en nanotube, er microaspirated GUV kort fast en mikron-størrelse perle deretter trakk skape en nanotube. I denne implementeringen holdes perlen av optisk pinsetter, som kan konstrueres ved å følge en publisert protokollen27. Det er mulig å dispensere optisk pinsett og trekke nanorør på forskjellige måter, men på bekostning av nøyaktig force målinger. Hvis det er for vanskelig å bygge en optisk felle eller hvis makt målingene er ikke avgjørende, som hvis man bare ønsker du foretrekker proteiner buet membraner, kan en tube trekkes bruker en perle pustende på spissen av en andre brønnene28. Det er også mulig å trekke rør med gravitasjonskraft29 eller flyte30,31. Videre er AC confocal mikroskopi ikke avgjørende enten; Imidlertid er det foretrukket så å måle overflate tettheten av proteiner. Det kan også måle nanotube radius fra fluorescens intensiteten av lipider i røret, dermed uavhengig av membran kraft og spenning. Inferring tube radius fra fluorescens er spesielt viktig hvis forholdet mellom disse antallene avviker fra veletablerte ligninger på grunn av tilstedeværelsen av membran-overholdt proteiner25. Viktigere, dispensere ikke en av både optisk felle og AC confocal mikroskopi, som det ikke vil være mulig å måle ryggsøylens rør.

Metoden som beskrevet i denne protokollen er brukt til å studere kurvatur-indusert sorteringen av ytre membran på nanorør, hovedsakelig de den BAR familie25,32,33,34 . Det ble også vist at conically formet transmembrane kalium kanalen KvAP er anriket på buet nanorør på samme måte som BAR proteiner35. Ved å optimalisere metoden for å innkapsle proteiner i GUVs, har samspillet av proteiner med negative kurvatur nylig blitt undersøkt som godt36. Videre, denne metoden er brukt å belyse dannelsen av protein stillaser25,37 og studere mekanismen av membran scission enten linje spenning38, protein dynamin39, eller BAR proteiner40,41. I tillegg til proteiner, kan små molekyler eller ioner også indusere kurvatur. Bruker denne metoden, ble kalsiumioner vist å indusere positiv kurvatur under salt-fri forhold42. Interessant, har det også vist at lipider kan gjennomgå kurvatur sortering, men bare for komposisjoner som er nær en demixing punkt43,44. I sum, metoden kan brukes av forskere interessert i å undersøke hvordan enten integrert membran komponenter (f.eks, lipider eller transmembrane proteiner) eller perifert bindende molekyler (enten innenfor eller utenfor GUVs) samhandle med cylindrically buet membraner, fra mekanisk eller kvantitativ synsvinkler. Det er også ment for interesserte i å måle de mekaniske egenskapene av membranen selv22,23,45.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse av GUVs av Electroformation på Pt-ledninger

  1. Rengjøre electroformation kammeret (se introduksjon og figur 1A) og Pt-ledninger med en organisk løsemiddel som etanol eller aceton å vaske bort av lipider og med vann å vaske bort salter.
    Merk: Vi anbefaler grundig tørke bort resten med etanol-gjennomvåt vev og sonicating i aceton, etanol og vann, for 5 min.
  2. Forberede en lipid blanding av en ønsket lipid komposisjon ved 1 mg/mL i kloroform. Blandingen skal inneholde ~ 0,05% molar brøkdel av en lipid konjugert med biotin (f.eks, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]) og ~ 0,5% molar brøkdel av en lipid konjugert med en fluorophore ( f.eksBODIPY-TR-C5-ceramide).
    Merk: I vår erfaring, det var vanskelig å produsere GUVs på en høy avkastning mer enn 30 prosent ladet lipider.
    FORSIKTIG: Kloroform bør håndteres innenfor kjemisk hette bruk passende hansken.
  3. Sett inn et par Pt-ledninger i electroformation kammeret. Innskudd lipid blandingen på Pt-ledninger i dråper med ~ 2-3 mm (totalt ~ 4 µL av miksen).
  4. Tørr ledninger under vakuum for 30-60 minutter ved romtemperatur.
  5. Forsegle bunnen av kammeret ved å følge dekkglassvæske over kammeret bruker silisium fett. Fyll kammer med en bufferløsning som inneholder NaCl, sukrose, og en bufring agent (f.eks, 70 mM NaCl, 100 mM sukrose og 10 mM Tris, ved pH 7.4). Dette mediet blir inne GUVs på eksperimentet. Det er viktig at osmolaritet i dette mediet passer osmolaritet av eksperimentelle medium i ~ 10%. Bruk sukrose for å justere osmolaritet. Legge proteiner til løsningen på en ønsket konsentrasjon hvis målet er å kapsle dem i GUVs.
    FORSIKTIG: Ulike salter og sukker i bufferen kan påvirke bøying stivhet og spontan kurvatur av membraner24,42,46,47.
  6. Forsegle toppen av kammeret ved å følge en dekkglassvæske med silisium fett å sikre minimum luften inne i kammeret. Bruke en sinus AC gjeldende gjennom Pt-ledningene på 500 Hz og 280 mV.
    Merk: Vekst tid og temperatur må optimaliseres avhengig av lipid sammensetning og følsomheten til protein. Når du bruker naturlig lipid ekstrakter, og også når innkapsle proteiner i GUVs, best utbytte ble oppnådd ved vokser GUVs 4 ° C over natten. I fravær av proteiner og syntetisk lipid komposisjoner, vekst ved romtemperatur for ~ 2t var tilstrekkelig.

2. forberedelse av eksperimentelle kammeret og Mikropipetter

  1. For å forberede Mikropipetter, trekke en glass kapillær bruker en pipette avtrekker. Det anbefales for å bruke en glass kapillær med interne og eksterne radier, henholdsvis, 0,7 mm og 1 mm. Deretter avgrense spissen av brønnene slik at indre diameter er 5-7 µm, ved hjelp av en microforge. Hvis proteiner eller andre molekyler injiseres i eksperimentet, trekke en annen brønnene og avgrense sine tips til indre diameter 8-15 µm.
  2. Konstruere en eksperimentell kammer ved å plassere to rektangulære mikroskopi coverslips på en metallisk base som vist i figur 1. Coverslips bør skilles med ~ 1 mm. Kammeret må åpninger langs langsider (se figur 1). Åpne sidene skal passe spissen av brønnene der spissen bør nå minst midten av kammeret.
  3. Forberede den eksperimentelle bufferen som osmolaritet ikke bør avviker med mer enn 10% fra bufferen til å vokse GUVs. Justere osmolaritet med glukose. Et eksempel på en eksperimentell buffer som ble brukt til å studere samspillet av endophilin med nanorør er 100 mM NaCl, 40 mM glukose, buffered med Tris til pH 7.4. En kombinasjon av sukrose inne / glukose utenfor sikrer: (a) tilstrekkelig kontrast til å observere GUVs med lyse feltet mikroskopi og (b) høyere tetthet inne i GUVs som forårsaker slå seg ned på bunnen av kammeret. Justere saltkonsentrasjon basert på eksperimentell krav.
    Merk: I tillegg til påvirker membranens mekaniske egenskaper, i vår erfaring, høy glukose konsentrasjon (> 300 mM) negativt påvirker etablering av streptavidin-biotin obligasjoner, må trekke en nanotube. Videre for lite salt hemmer streptavidin-biotin obligasjoner, mens for høyt av en konsentrasjon skjermer protein-membran interaksjoner. Ved protein innkapsling, med svært høy saltkonsentrasjon i eksterne buffer (f.eks> 200 mM NaCl) kan brukes som knep for å koble proteiner fra ytre pakningsvedlegget36. Det er nødvendig å eksperimentere med en rekke salt konsentrasjon for å finne de optimale bindende betingelsene for molekylet rundt.
  4. 30-60 minutter før innsamling GUVs for eksperimentet, passivate glassflater ved å fylle både eksperimentelle kammeret og aspirasjon brønnene med en 5 mg/mL løsning på en svært ren β-kasein (f.eksoppløst i eksperimentell buffer). Β-kasein skaper et beskyttende lag på glassoverflater, forebygge GUVs å følge for sterkt som ville føre dem til å sprekke. Inkuber med β-kasein i 30-60 minutter.
    Merk: Det bør være noen bobler i brønnene som ville forstyrre kontrollere membran spenning.
    1. For å bygge en dispenser for å fylle Mikropipetter, bryte en sprøyte nål nær plast-kontakt og lim inn en tynn silica kapillær (som dem anvendt for flytende kromatografi) (figur 1 c).
  5. Under inkubasjonen med β-kasein, montere kammeret på mikroskopet og Midtstiller den over målsettingen. Stikk aspirasjon brønnene gjennom åpningen langs langsiden og bringe spissen over mikroskopet målsettingen. Juster tank vannstanden slik at aspirasjon trykket er nær null (det skal være ingen tunge flyt til eller fra pipette, som kan sees under mikroskopet).
  6. I tilfelle proteiner eller andre molekyler injiseres under eksperimentet, fyll injeksjon brønnene med ønsket molekylet oppløst i eksperimentell bufferen i en konsentrasjon av valg, montere brønnene i en micromanipulator, og Sett inn gjennom den motsatte siden av eksperimentelle kammeret.
    1. For å bruke et minimum av proteiner, fyll bare brønnene spissen med protein av aspirasjon. For å gjøre det, vikle slutten av en nål knyttet til en sprøyte med plast slangen. Slangen inn baksiden av injeksjon brønnene.
    2. Nøye dyppe spissen av brønnene i protein løsningen og Sug opp slik at det fyller spissen av av brønnene.
      Merk: Denne enkel setup er vist i figur 1 d og i vår erfaring, kan aspirating fra så lite som et par µL av protein løsningen.
    3. Etterfylle resten av injeksjon brønnene med mineralolje å hindre blanding av protein løsningen og vann fra vannbeholderen (med oppsettet i figur 1 c).
    4. Ta vare ikke for å innføre luftbobler i injeksjon pipette, som det vil indusere ustabil injeksjon press. Alternativt hvis protein antallet er tilstrekkelig, fyll brønnene med proteiner slik fylling med β-kasein som beskrevet i trinn 2.4. Justere tank vann for å minimere aspirasjon trykket i injeksjon pipette.
      Merk: Konsentrasjonen av den injiserte molekyl eller ion nær nanotube kommer til å bli lavere grunnet fortynning og det kan anslås ved å måle fluorescens intensitet nedgangen som en funksjon av avstanden fra pipette Avslutt42. Det er imidlertid viktig å vite bilayer-bundet tettheten av den injiserte molekylet, som kan måles nøyaktig (se Seksjon 4).
  7. Etter inkubasjon med β-kasein, fjerne løsningen fra kammeret og skyll med eksperimentelle bufferen flere ganger. Fyll med eksperimentelle bufferen.
  8. Stopp electroformation av GUVs og samle dem direkte fra Pt-ledninger. Legge til et par µL av GUV løsningen eksperimentelle kammeret. Bruk bare ferskt tilberedte GUVs.
  9. Legge til et par µL av streptavidin-belagt perler eksperimentelle kammeret til en siste konsentrasjon av perlene i kammeret på rundt 0,1 x 10−3% (w/v) eller mindre. Polystyren perler ~ 3 µm i diameter er anbefalt (polystyren perler i vann har en nesten optimal brytningsindeks kontrast med hensyn til maksimere gradient makt når det gjelder spredning styrken i optisk felle). Bead konsentrasjon kan bli justert basert på eksperimentet: en svært lav konsentrasjon gjør det vanskelig å finne dem i kammeret, og en for høy konsentrasjon løper risikoen for flere perler falle i optisk pinsett.

3. trekke en membran Nanotube fra en GUV

  1. La til GUVs og perler bosette til bunnen av kammeret. Tømming av GUVs ved å la litt eksperimentell bufferstørrelsen fordamper, for ca ~ 15 min. Deflating GUVs er avgjørende for å produsere noen overflødig område som kan være aspirated med av brønnene. GUVs bør synlig undulate (dvs., vises floppy) under lys mikroskop. Hvis de vises spent, tillate mer fordampning tid.
    Merk: Osmolaritet endre prisen avhenger av avdamping areal, temperatur, etc., og bør nøye overvåket. I prinsippet osmolaritet forskjellen kan angis fra start ved å justere sukrose/glukose konsentrasjonen, men forsiktighet bør utvises ikke å indusere en osmotisk sjokk.
  2. Finn en floppy GUV og Sug opp den i pipette. Lengden på aspirasjon tungen (del av membranen inne pipette) burde være lik eller større enn pipette radius for teoretisk analyse skal gjeldende15,16,22,()23 Figur 2). Prøv flere GUVs. Hvis ingen av GUVs kan være aspirated for å produsere en lang nok tunge, vente noen minutter. Hvis GUVs er floppy nok, går du til neste trinn.
  3. Forsegle kammeret med mineralolje, å hindre ytterligere fordampning av bufferen. Gjøre det ved nøye pipettering olje langs åpne kantene av eksperimentelle chamber.
  4. Sette nullstillingen aspirasjon press, først se etter en perle i kammeret og plassere avkjørselen aspirasjon pipette nær perlen. Juste høyden på vannbeholderen slik at perlen er sugd i verken blåst bort av aspirasjon pipette. Selv om mineralolje hindrer fordampning og derfor ytterligere forandrer lufttrykket inne i kammeret, null aspirasjon trykket før måling hver GUV.
  5. Finn en GUV og Sug opp den. Flytte brønnene opp og ut av fokus (å holde GUV fra overflaten der det kan bli trukket ut av pipette av skjæring stress når kammeret er flyttet).
  6. Se etter en perle nøye beveger kammeret. Bardus beveger kan løses GUV. Felle den med optisk pinsett på avstand ~ 20 µm fra bunnen kammer. Kontroller at regionen rundt er rent uten andre perler eller membraner i sikte. Noe fallende i optisk pinsett enn perlen vil forstyrre målingen.
  7. Bringe GUV tilbake i fokus, og fra perle med brønnene linje med optisk fellen (figur 2).
  8. Registrer bevegelsen av perlen i 1-2 min å måle likevekt stillingen (nødvendig for force mål).
  9. Redusere trykket i brønnene som mulig uten å miste GUV for å redusere spenningen membran. Forsiktig bringe GUV i kontakt med perlen for rundt et sekund, etablere streptavidin-biotin obligasjoner, og trekk forsiktig tilbake oppretter en nanotube. Bevegelse GUV mot eller bort fra perlen bør ideelt gjøres med en piezo-aktuator å forstyrre minimal perlen i optisk pinsett.
    Merk: Hvis nanotube ikke utgjør, kan det være på grunn av dårlig streptavidin belegg av perlen, utilstrekkelig mengde biotinylated lipider i GUV, utilstrekkelig konsentrasjon av salt eller overdreven konsentrasjon av glukose i eksperimentell bufferen eller membranen spenning i GUV er for høy48.
  10. Øke aspirasjon trykket for å gjenskape aspirasjon tungen. Juster røret å ligge i aksen av aspirasjon pipette og maksimalt fokus på røret (figur 2).
  11. Kontroller at GUV ekvator og røret er i fokus. Registrerer bevegelsen av perle med lyse feltet mikroskopi i noen minutter (her, kameraet oppkjøpet hastighet er 30 Hz). Registrere høyden, h, i vanntanken forhold til nullstillingen. Ta noen AC confocal bilder av systemet (figur 2).
  12. Gjenta det forrige trinnet på ulike aspirasjon press, implisitt membran spenninger. Typisk spenning er 0.015-0,2 mN/m, steg størrelse rundt 0.02 mN/m.
  13. Hvis injeksjonsbruk proteiner eller molekyler i systemet, bringe injeksjon brønnene nær nanotube, sørge for at perlen i optisk fellen ikke opprørt. Forsiktig injisere til et trykk rundt 1-2 Pa.
  14. Etter protein bindingen har equilibrated (fluorescens intensiteten av injisert protein på membran forblir konstant på GUV), gjenta step-wise målinger som med nakne membranen (trinn 3.11 og 3.12).
    Merk: Siden målingene utføres mens injeksjonsbruk proteiner nær GUV på konstant press, bulk konsentrasjonen av protein er omtrent uendret nær GUV; dermed bør protein desorpsjon være ubetydelig under målingen.
    1. Alternativt er det mulig å ruge GUVs sammen med proteiner før du utfører tube-rykk eksperimenter for å sikre en konstant protein bulk konsentrasjon. Gitt at relative membran brøkdel av proteiner på røret og GUV måles, påvirker ikke måten proteiner leveres kurvatur-sortering beregningen (se Seksjon 4).

Figure 2
Figur 2: Tube-rykk eksperimentet. (A) skjematisk av eksperimentet. (B) en AC confocal bilde av en trakk rør som beskrevet i denne protokollen. Skala bar = 2 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

4. mål og dataanalyse

  1. Måle membran spenning
    1. Beregn det hydrostatisk trykket for hvert trinn ved konstant streben trykk:
      ΔP = pgh
      hvor p er vannet tetthet, g gravitasjonsakselerasjonen, og h høyden på vannbeholderen fra trinn 3.11.
    2. Fra AC confocal bilder, måle radius GUV, rGUV, og radius av aspirasjon pipette, rpip (figur 2).
    3. Beregne membran spenningen, σ, bruker Laplace likning49:
      Equation 1
  2. Måle membran kraft
    1. Bestemme stivhet av optisk pinsett, k, ved hjelp av flere kalibrering metoder27. Måle k å bruke tyktflytende dra metoden27i dette oppsettet.
    2. Beregne likevekt stillingen perlen, 0som et gjennomsnitt fra et mål før trekke røret (trinn 3.8).
    3. For hver konstant spenning måling beregne likevekt membran, F, fra Hookes lov:
      F = k(en - 0)
      der en er den gjennomsnittlige plasseringen av perlen under som måling.
  3. Måle tube radius
    1. Ved en nakne membran (ingen ekstra membran-buede molekyler), beregner du tube radius, R, fra styrke som:
      R = F/(4πσ)
      (refererer til22,23).
    2. For å måle tube radius i nærvær av membran-buede molekyler og uavhengig av trinn 4.3.1, først registrere lipid fluorescens intensiteten langs røret, jegbadekar, og langs GUV kontur, jegGUV. Måle gjennomsnittlig fluorescens intensiteten av en fluorophore i eller grense membranen som en gjennomsnittlig intensitet langs smarteste et rør eller en GUV kontur. Velg en rektangulær boks som inneholder en horisontal del av GUV konturen eller røret og beregne summen av fluorescens intensiteten av hver vannrett linje i boksen.
      1. Dele hver sum av antall piksler på den horisontale linjen (dvs., boksen bredden). Merk at i den merkede boksen, skal ingen andre membraner stede. Fluorescens intensitet profilen langs den merkede boksen oppnås.
      2. Fratrukket bakgrunn intensiteten, ta gjennomsnittlig pixel fluorescens intensiteten fra den smarteste linjen. Rør radius gjelder lineært forholdet mellom fluorescens langs kontur av røret og GUV som:
        R = Kbadekarjegbadekar/jegGUV
        der Kbadekar er en kalibrering faktor25.
        Merk: Denne metoden kan brukes til å måle tube radius i området 10 – 80 nm (når røret er smal nok til å ligge innenfor en AC confocal voxel bredde) og med litt større usikkerhet i 80 nm og høyere serien. Følsomheten til målingen, avhengig av oppsettet.
    3. Bestemme Kbadekar ved utfører uavhengige radius målinger i trinn 4.3.1 og 4.3.2 på en enkelt membran komposisjon med uncharged lipider. Slike enkle membranen komposisjon sikrer at radius og force har enkel forholdet i trinn 4.3.1. Gjenta eksperimentet flere ganger og plotte R, utledet fra styrke (trinn 4.3.1) versus jegbadekar/jegGUV (trinn 4.3.2). Beregne Kbadekar fra passer. I dette oppsettet, Kbadekar = 200 ± 50 nm ved hjelp av egg L-α-phosphatidylcholine (egg-PC) membran og en fluorescerende lipid som fluorescens minimal avhengig av polarisering25.
      Merk: Kbadekar må måles for forskjellige mål, på grunn av ulike AC confocal voxel volumene. Lipid fluorophore bør ikke arbeide med injisert proteiner/molekyler. Den fluoriserende lipid anbefalt her, BODIPY St ceramide, forventes ikke å ha eventuelle samhandlinger med proteiner. Denne antagelsen ble bekreftet med tidligere studier av BAR og -BAR domener25,36,37, som har vist at på høy protein dekning, rør radius er løst av proteiner, uavhengig av den spenning i GUV. Hvis proteiner samhandle med lipid-fluorophore, vil en nedbryting eller berikelse av fluorophore bli observert i røret på varierte høy protein overflaten fraksjoner.
  4. Måle overflate tettheten av proteiner
    1. Forberede lipid blander bruker en enkel uncharged lipid (f.eks, egg-PC) med fem forskjellige muldvarp brøkdeler av et fluorescerende lipid (på samme bølgelengde som fargestoff som merket protein, f.eks BODIPY-FLC5-hexadecanoyl-phosphatidylcholine (HPC *) for eksempel, Alexa488-merket protein) i området: XHPC * = 0,01-1%. Klargjør GUVs i 100 mM sukrose ved electroformation på ITO plater (Følg trinn 1 i en tidligere publikasjon13).
    2. Samle GUVs og overføre til en eksperimentell chamber paddivert med β-kasein. Bruk f.eks100 mM glukose for eksperimentell løsningen. Vent noen minutter GUVs å bosette seg.
    3. Ta AC confocal fluorescens bilder av GUVs og registrere gjennomsnittlig fluorescens intensiteten langs GUV konturene som en funksjon av muldvarp brøkdel av fluorescerende lipid (se trinn 4.3.2). Hver komposisjon, beregne området tettheten av fluorescerende lipid, φHPC*. For eksempel ved å anta at området per lipid er 0,7 nm2φHPC* = 1,43 x 106 XHPC * per brosjyre. Plot HPC * fluorescens intensitet i GUV, IHPC, GUV, versus φHPC*. Tilpass gir kalibrering konstanten, A, gitt av φHPC* = AIHPC, GUV. A avhenger mikroskopi innstillingene, slik som laser makt og detektor følsomheten (i.e.gevinst), derfor registrerer A for forskjellige brukte mikroskopi innstillinger (se eksemplet i Figur 3).
    4. Forbered flere løsninger av HPC * oppløst i vaskemiddel, f.eksnatrium dodecyl-sulfat (SDS), i ulike konsentrasjoner i området fra ~ 1 til 10-50 µM registrere fluorescens intensiteten av hver løsning i bulk og beregne skråningen av intensitet versus konsentrasjon (Figur 3). Gjenta målingen med fluorophore som vil bli bøyd til proteinet i mange lignende konsentrasjon (se eksemplet med Alexa488 i Figur 3). Dette målet er nødvendig å forholde seg til fluorescens intensiteter av protein etiketten og lipid etiketten, jegA488, bulk / jegHPC, bulk, som de ikke kan nødvendigvis avgir på samme måte på samme bulk konsentrasjonen.
    5. Måle antall fluorophores per protein molekyl med en fluorospectrometer. For eksempel for tilfelle av Alexa488, kan hvor mange Alexa488 molekyler per protein, nA488, beregnes på følgende forhold:
      n A488 = (A494/εA488) / ((A280 - 0,11en494) / εbeskytte)
      der A494 og A280 er absorbansen verdier per enheten lengde på 494 nm og 280 nm henholdsvis og εA488 og εbeskytte molekylær absorpsjon koeffisientene av Alexa488 og protein, henholdsvis.
    6. Beregne overflaten tettheten av protein på GUV, φprot, GUV, i henhold til følgende formel:
      Equation 2
      Holde i tankene polymerisasjon protein. For eksempel BAR proteiner dimerize, derfor beregnet tetthet vil være av BAR monomer per område hvis bruker utryddelse koeffisient skjemaet monomerisk.

Figure 3
Figur 3: eksempel av protein overflaten tetthet kalibreringen. Målt er HPC * lipid fluorescens intensiteten i bulk (venstre) og GUVs (midten). Også målt er bulk fluorescens intensiteten av Alexa488 (bundet til et BAR-domene) (høyre). Fluorescens intensitet skalerer lineært med konsentrasjon. Målinger vises for spesifikke gjenkjennings gevinst og laser utgangseffekt. Plotter generert basert på data fra referanse37. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rør-rykk eksperimentet kan gi viktig mekanisk informasjon om membranen. I fravær av proteiner eller andre molekyler som par med membran kurvatur, membranen tvinge og rør radius kan relateres med membran spenning ved å bruke Canham-Helfrich Hamiltonian ligningen slik trakk fra en GUV50,51

Equation 3(Formel 1)

hvor Equation 4 er membran gratis energi av røret, K membran bøying stivhet, r og R0 er henholdsvis gjennomsnittet og de spontane radier svingtype, σ membran spenning, A området av røret, L lengden av røret, og f poenget makt utøves av røret på perle. Likevekt, r er rør radius, som R, og f blir tube-retraksjon styrken, F, i.e., en likevekt kraft som røret trekker perlen i optisk fellen. For å beregne F og R, vi minimere Equation 4 forhold til L og r, gir22,23

Equation 5(Formel 2)

Equation 6(Formel 3)

R 0 er forsømt hvis begge brosjyrer av membranen har samme sammensetning, selv om det er spekulert på at andre faktorer, som gratis repulsions kan indusere noen spontan kurvatur42. Kraft og radius målene på rør trukket fra 100% DOPC GUVs er utmerket avtale med teoretisk spådommer i ligningen 2 og formel 3 (Figur 4). To målene er uavhengige styrken er målt fra forskyvning av perlen i optisk fellen og radius fra fluorescens intensitet, derfor gir to måter å beregne membranen bøying stivhet. Passende ligning 2 og formel 3 å vises data avkastningen: K = (25,1 ± 1.4) (gjennomsnittlig ± SD) kBT og (22,1 ± 1.5) kBT, henholdsvis som tidligere målt42 .

Hvis eksperimentering med kurven-koplingen proteiner, det er foreslått å bruke mer avanserte Hamiltonians ligningen enn den i Formel 1, som Formel 1 bare utgjør en effektiv spontan kurvatur og ikke høyde for de effekten av proteiner på membranens mekaniske egenskaper eller mulig protein-protein interaksjoner. Se, f.eks25,35,36,52,53. Selv om avanserte teoretiske modeller er avgjørende for en grundig forståelse av et bestemt protein-membran-system, uten å ty til dem, er det fortsatt mulig å få veldig nyttig informasjon fra metoden tube-rykk.

For eksempel for å teste om proteiner forstand kurvatur, målt den relative intensiteten av proteiner på røret sammenlignet med GUV, som regnes som flat. Samspillet med positiv kurvatur er studert ved å injisere proteiner i nærheten av røret med andre brønnene25. Samspillet med negative kurvatur eller virkemåten til transmembrane proteiner er studert av ESP eller gjenoppbygge proteiner under GUV formasjon35,36. Relativ anriking av BAR og KvAP proteiner på membran rør over de underliggende GUVs angir at de foretrekker buet membraner (figur 5). For å være mer kvantitativ, denne berikelse kan beregnes som en sortering koeffisient, S, i henhold til:

Equation 7(Formel 4)

der jegprot, badekar og jegprot, GUV er fluorescens intensiteten av proteiner på røret og GUV, henholdsvis, og jegleppe, badekar og jegleppe, GUV er fluorescens intensiteten av lipider på røret og GUV, henholdsvis.

Et annet eksempel er måling tube styrken som protein binder til membranen. Figur 5B, C viser at en N-BAR protein endophilin A2 gradvis reduserer tube styrken, redusere den til null, indikerer at det har dannet en tredimensjonal struktur som holder røret stabile, som kalles et stillas. Slike strukturer spille viktige roller i endocytose, ved å feste tuben radius, men også la scission7,41. Måling av S, samt de mekaniske og morfologiske effektene som proteiner pålegge membraner gir viktig innsikt i hvordan de opererer i membran-bøying fenomener i cellen.

Figure 4
Figur 4: representant resultatene av mekanisk målinger i fravær av proteiner. Vist er linearisert kraft og rør radius avhengighet av membran spenning for en 100% DOPC membran, fra tre uavhengige målinger, publisert tidligere42. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: representant resultatene av krumning sensing og stillaset dannelsen av BAR proteiner. (A) kurvatur sensing av-BAR protein IRSp53. Protein sanser negative membran kurvatur og er bundet på innsiden av GUV, med ubetydelig mengde protein tilstede på ytre membran brosjyre. Skala bar = 5 µm. Reprinted fra36, under Creative Commons CC-BY-lisens, Copyright 2015, natur Publishing Group. (B) danner en protein stillaset av N-BAR protein endophilin. Proteiner er injisert i nærheten av røret og er derfor bundet på ytre membran brosjyren. Som beskrevet i37, endophilin binder til rørets base og danner et stillas som kontinuerlig vokser langs røret fra GUV mot optisk fellen (OT, hvit sirkel). (C) en kymogram av endophilin stillaset vekst fra GUV til perle, med lipid og protein kanalene kledde. Plottet viser rør kraft, F, som en funksjon av tid, t. Tidsskalaene i kymogram og handlingen er like (x-aksen er delt). B og C, skala bar = 2 µm. Reprinted med tillatelse fra referanse37, Copyright (2016) National Academy of Sciences. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden trekke rør fra GUVs gir rik informasjon på membran-protein systemet, som det er ikke bare betyr å måle de grunnleggende mekaniske egenskapene av membranen, men det hjelper for å belyse koblingen mellom proteiner og membran kurvatur. Som omtalt i innledningen, andre teknikker finnes for å måle effekten av membran-buede proteiner, ved rugende proteiner med sub-mikron liposomer bundet til en paddivert overflate18,19 eller observere den spontan formasjonen av tubules i brønnene pustende GUVs ved injeksjon av protein20,21. Metoden beskrevet her direkte geometriske forbindelse endocytose og er unik i å gi viktige fysiske målinger av systemet samtidig, som protein tetthet, membran spenning og membran kraft.

En viktig begrensning av metoden er at det ikke er trivielt å konstruere og kalibrere alle komponentene i analysen. Men mens en kombinasjon av AC confocal mikroskopi, optisk pinsett, og micromanipulation gir maksimal informasjon, noen komponenter kan erstattes som beskrevet i innledningen, avhengig av informasjonen trenger å lære om den system. Minimal komponenter kreves for å kunne undersøke kurvatur koblingen av et protein, eller noen andre potensielle kurvatur-kombinert molekyl, er en brønnene aspirator og en AC confocal mikroskop, med optisk pinsett er unnværlig. Viktigere, kreves mange av kalibreringer (for eksempel kalibrering for membran tube radius og bestemme protein overflaten tetthet) bare vanligvis utføres én gang. En annen begrensning av metoden er at det kan måle eneste GUV på et tidspunkt, beløper seg til to til tre GUVs per time (med praksis); men hver måling gir et vell av data.

For høyere gjennomstrømming målinger eller hvis det er viktig å studere samspillet av proteiner med sfærisk og ikke rør geometrier, må andre analyser bli utforsket eller utviklet. Arbeidet vil bli viet til: (1) designe et høyere gjennomstrømming system som kunne flere rør (fra flere GUVs) trakk og målt samtidig, og (2) integrering super-oppløsning mikroskopi for å studere detaljer om protein stillaset som skjemaer på nanorør.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Benoit Sorre, Damien Cuvelier, Pierre Nassoy, François Quemeneur og Gil Toombes for deres viktige bidrag til å etablere metoden nanotube i gruppen. P.B. gruppen hører til CNRS konsortiet CellTiss, Labex CelTisPhyBio (ANR-11-LABX0038) og til Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). F.-C. Tsai ble finansiert av EMBO langsiktige fellesskap (ALTF 1527-2014) og Marie Curie handlinger (H2020-MSCA-hvis-2014, prosjektet membran-ezrin-utgangen). M.S. er Junior Fellow ved Simons samfunn av Fellows.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC) Avanti 850375 Example lipid used in data for Figure 3
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin] Avanti 880129 biotinylated lipid
BODIPY-TR-C5-ceramide Molecular Probes (ThermoFisher) D7540 fluorescent lipid
BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*) Molecular Probes (ThermoFisher) fluorescent lipid for protein density calibration
egg L-α-phosphatidylcholine (eggPC) Avanti 840051 used for calibrating the tube radius constant
β-casein from bovine milk (>99%) Sigma Aldrich C6905 used for passivating the micropipette and the experimental chamber
Sucrose Sigma Aldrich S7903
D(+) glucose Sigma Aldrich G7021
NaCl Sigma Aldrich S7653
Tris Sigma Aldrich 10708976001
osmometer Loser n/a
Pt-wires, 0.5 mm diameter, 99.99% pure Goodfellow USA PT005139 used for GUV electroformation
function generator n/a used to create current for GUV electroformation
putty sealant Vitrex (from CML France) CRIT 140013 used to seal the electroformation chamber
bath sonicator n/a useful to clean the electroformation chamber, but not crucial
Nikon TE2000 inverted microscope, eC1 confocal system (Nikon), with two laser lines (λ = 488 nm and 543 nm); optical tweezers induced by a 5 W ytterbium fiber continuous wave laser (λ > 1070 nm; IPG GmBH Germany) an example of a confocal microscopy system equipped with optical tweezers
micromanipulators n/a
borosilicate capillaries (with internal and external radii of 0.78 mm and 1 mm, respectively) Harvard apparatus 30-0036
micropipette puller Sutter Instrument P-2100
microforge Narishige MF-800
piezoelectric actuator Physik Instrumente n/a
polystyrene streptavidin coated beads (diameter 3.2 µm) Spherotech SVP-30-5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
  2. Johannes, L., Wunder, C., Bassereau, P. Bending "on the rocks"--a cocktail of biophysical modules to build endocytic pathways. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).
  3. Dawson, J. C., Legg, J. A., Machesky, L. M. Bar domain proteins: a role in tubulation, scission and actin assembly in clathrin-mediated endocytosis. Trends Cell Biol. 16 (10), 493-498 (2006).
  4. Mim, C., Unger, V. M. Membrane curvature and its generation by BAR proteins. Trends Biochem Sci. 37 (12), 526-533 (2012).
  5. Qualmann, B., Koch, D., Kessels, M. M. Let's go bananas: revisiting the endocytic BAR code. EMBO J. 30 (17), 3501-3515 (2011).
  6. Rao, Y., Haucke, V. Membrane shaping by the Bin/amphiphysin/Rvs (BAR) domain protein superfamily. Cell Mol Life Sci. 68 (24), 3983-3993 (2011).
  7. Simunovic, M., Voth, G. A., Callan-Jones, A., Bassereau, P. When Physics Takes Over: BAR Proteins and Membrane Curvature. Trends Cell Biol. 25 (12), 780-792 (2015).
  8. Safari, F., Suetsugu, S. The BAR Domain Superfamily Proteins from Subcellular Structures to Human Diseases. Membranes (Basel). 2 (1), 91-117 (2012).
  9. Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Progress in Colloid and Polymer Science Vol. 89: Trends in Colloid and Interface Science VI. Helm, C., Lösche, M., Möhwald, H. 89, Steinkopff. Ch. 29 127-131 (1992).
  10. Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).
  11. Montes, L. R., Alonso, A., Goni, F. M., Bagatolli, L. A. Giant unilamellar vesicles electroformed from native membranes and organic lipid mixtures under physiological conditions. Biophys J. 93 (10), 3548-3554 (2007).
  12. Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field. Biophys J. 70 (3), 1112-1121 (1996).
  13. Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology. J Vis Exp. (76), (2013).
  14. Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies. J Vis Exp. (95), e52281 (2015).
  15. Hochmuth, R. M., Evans, E. A. Extensional flow of erythrocyte membrane from cell body to elastic tether. I. Analysis. Biophys J. 39 (1), 71-81 (1982).
  16. Hochmuth, R. M., Wiles, H. C., Evans, E. A., McCown, J. T. Extensional flow of erythrocyte membrane from cell body to elastic tether. II. Experiment. Biophys J. 39 (1), 83-89 (1982).
  17. Bassereau, P., Sorre, B., Levy, A. Bending lipid membranes: experiments after W. Helfrich's model. Adv Colloid Interface Sci. 208, 47-57 (2014).
  18. Hatzakis, N. S., et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature chemical biology. 5 (11), 835-841 (2009).
  19. Bhatia, V. K., et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. EMBO J. 28 (21), 3303-3314 (2009).
  20. Shi, Z., Baumgart, T. Membrane tension and peripheral protein density mediate membrane shape transitions. Nat Commun. 6, 5974 (2015).
  21. Chen, Z., Shi, Z., Baumgart, T. Regulation of membrane-shape transitions induced by I-BAR domains. Biophys J. 109 (2), 298-307 (2015).
  22. Cuvelier, D., Derenyi, I., Bassereau, P., Nassoy, P. Coalescence of membrane tethers: experiments, theory, and applications. Biophys J. 88 (4), 2714-2726 (2005).
  23. Derenyi, I., Julicher, F., Prost, J. Formation and interaction of membrane tubes. Phys Rev Lett. 88 (23), 238101 (2002).
  24. Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Adv Colloid Interface Sci. 208, 225-234 (2014).
  25. Sorre, B., et al. Nature of curvature coupling of amphiphysin with membranes depends on its bound density. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 173-178 (2012).
  26. Evans, E., Rawicz, W. Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes. Phys Rev Lett. 64 (17), 2094-2097 (1990).
  27. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  28. Capraro, B. R., Yoon, Y., Cho, W., Baumgart, T. Curvature sensing by the epsin N-terminal homology domain measured on cylindrical lipid membrane tethers. J Am Chem Soc. 132 (4), 1200-1201 (2010).
  29. Bo, L., Waugh, R. E. Determination of bilayer membrane bending stiffness by tether formation from giant, thin-walled vesicles. Biophys J. 55 (3), 509-517 (1989).
  30. Rossier, O., et al. Giant Vesicles under Flows: Extrusion and Retraction of Tubes. Langmuir. 19 (3), 575-584 (2003).
  31. Borghi, N., Rossier, O., Brochard-Wyart, F. Hydrodynamic extrusion of tubes from giant vesicles. EPL (Europhysics Letters). 64 (6), 837 (2003).
  32. Zhu, C., Das, S. L., Baumgart, T. Nonlinear sorting, curvature generation, and crowding of endophilin N-BAR on tubular membranes. Biophys J. 102 (8), 1837-1845 (2012).
  33. Ramesh, P., et al. FBAR syndapin 1 recognizes and stabilizes highly curved tubular membranes in a concentration dependent manner. Sci Rep. 3, 1565 (2013).
  34. Knorr, R. L., et al. Membrane morphology is actively transformed by covalent binding of the protein Atg8 to PE-lipids. PLoS One. 9 (12), e115357 (2014).
  35. Aimon, S., et al. Membrane shape modulates transmembrane protein distribution. Dev Cell. 28 (2), 212-218 (2014).
  36. Prévost, C., et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nat Commun. , (2015).
  37. Simunovic, M., et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (40), 11226-11231 (2016).
  38. Allain, J. M., Storm, C., Roux, A., Ben Amar, M., Joanny, J. F. Fission of a multiphase membrane tube. Phys Rev Lett. 93 (15), 158104 (2004).
  39. Morlot, S., et al. Membrane shape at the edge of the dynamin helix sets location and duration of the fission reaction. Cell. 151 (3), 619-629 (2012).
  40. Renard, H. F., et al. Endophilin-A2 functions in membrane scission in clathrin-independent endocytosis. Nature. 517 (7535), 493-496 (2015).
  41. Simunovic, M., et al. Friction Mediates Scission of Tubular Membranes Scaffolded by BAR Proteins. Cell. 170 (1), 172-184 (2017).
  42. Simunovic, M., Lee, K. Y., Bassereau, P. Celebrating Soft Matter's 10th anniversary: screening of the calcium-induced spontaneous curvature of lipid membranes. Soft Matter. 11 (25), 5030-5036 (2015).
  43. Sorre, B., et al. Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5622-5626 (2009).
  44. Heinrich, M., Tian, A., Esposito, C., Baumgart, T. Dynamic sorting of lipids and proteins in membrane tubes with a moving phase boundary. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7208-7213 (2010).
  45. Dasgupta, R., Dimova, R. Inward and outward membrane tubes pulled from giant vesicles. Journal of Physics D: Applied Physics. 47 (28), 282001 (2014).
  46. Vitkova, V., Genova, J., Mitov, M. D., Bivas, I. Sugars in the aqueous phase change the mechanical properties of lipid mono- and bilayers. Molecular Crystals and Liquid Crystals. 449, 95-106 (2006).
  47. Bouvrais, H. Mechanical properties of giant vesicle membranes investigated by flickering technique. , University of Southern Denmark. (2011).
  48. Koster, G., Cacciuto, A., Derenyi, I., Frenkel, D., Dogterom, M. Force barriers for membrane tube formation. Phys Rev Lett. 94 (6), 068101 (2005).
  49. Kwok, R., Evans, E. Thermoelasticity of large lecithin bilayer vesicles. Biophys J. 35 (3), 637-652 (1981).
  50. Helfrich, W. Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments. Z Naturforsch C. 28 (11), 693-703 (1973).
  51. Canham, P. B. The minimum energy of bending as a possible explanation of the biconcave shape of the human red blood cell. J Theor Biol. 26 (1), 61-81 (1970).
  52. Marcerou, J. P., Prost, J., Gruler, H. Elastic Model of Protein-Protein Interaction. Nuovo Cimento Della Societa Italiana Di Fisica D-Condensed Matter Atomic Molecular and Chemical Physics Fluids Plasmas Biophysics. 3 (1), 204-210 (1984).
  53. Leibler, S. Curvature Instability in Membranes. J Phys-Paris. 47 (3), 507-516 (1986).

Tags

Mikrobiologi problemet 130 membran kurvatur membran nanotube biofysikk vesicle optisk pinsett AC confocal mikroskopi kurvatur sortering i vitro rekonstituering BAR proteiner endocytose
Trekke membran nanorør fra gigantiske Unilamellar blemmer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Prévost, C., Tsai, F. C.,… More

Prévost, C., Tsai, F. C., Bassereau, P., Simunovic, M. Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (130), e56086, doi:10.3791/56086 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter