Summary
Küçük Ubikuitin ilgili değiştirici (SUMO) aile proteinler hedef proteinlerin çeşitli hücresel süreçler düzenleyen lizin kalıntıları Birleşik. Bu kağıt Retinoblastom (Rb) protein SUMOylation insan hücrelerinde endojen ve eksojen koşullarda tespiti için bir protokolünü açıklar.
Abstract
Translasyonel modifikasyonlar proteinlerin hücre içi sinyal iletimi uygun düzenlenmesi için kritik öneme sahiptir. Bu değişiklikler arasında küçük Ubikuitin ilgili değiştirici (SUMO) hedef proteinlerin hücresel süreçler, gen transkripsiyon, DNA tamiri, protein gibi düzenlemek için çeşitli lizin artıkları kovalent bağlı olduğu bir Ubikuitin benzeri proteindir etkileşim ve bozulması, hücre altı taşıma ve sinyal iletimi. Protein SUMOylation tespit için en yaygın yaklaşım ifade ve bırakmak için basit ve uygun mekanik adresleme için bir vitro biyokimyasal reaksiyon bakteri, rekombinant tagged proteinlerin saflaştırılması dayanır sorular. Ancak, SUMOylation vivosürecinin karmaşıklığı nedeniyle, öyle algılamak ve protein SUMOylation hücrelerde endojen koşullar ne zaman altında özellikle çözümlemek için daha zor. Bu kağıt yazarlar tarafından yapılan bir çalışmada endojen Retinoblastom (Rb) protein, hücre döngüsü ilerleme olumsuz düzenlenmesi çok önemlidir bir Tümör baskılayıcı özellikle SUMOylated erken G1 aşamasında saptandı. Bu kağıt algılama ve Rb SUMOylation çözümleme insan hücrelerinde endojen ve eksojen koşullarda protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı SUMO-değişiklik Rb, aynı zamanda birçok diğer SUMO hedefli protein, insan hücrelerinde phenotypical ve fonksiyonel incelenmesi için uygundur.
Introduction
Ökaryotik hücrelerde hücre döngüsü progresyon doğru kontrolü belirli olaylar gerçekleşecek bir sıralı şekilde1,2sağlar sıkı bir düzenleyici ağ temel alır. Retinoblastom (Rb) protein, ilk klonlanmış Tümör baskılayıcı1,3bu ağda önemli oyuncularından biri. Rb protein S faz geçiş ve tümör büyüme4,5G0/G1 için özellikle hücre döngüsü progresyon negatif bir regülatör olduğu düşünülmektedir. Ya doğrudan Rb işlev başarısız olur, çocuklarda en sık görülen göz içi malignite için Retinoblastom, ya da kanser5diğer birçok türde katkı sağlıyor. Ayrıca, Rb hücre farklılaşması, Kromatin remodeling ve mitokondri-aracılı apoptosis3,6,7de dahil olmak üzere birçok hücresel yollar ilgilenmektedir.
Translasyonel modifikasyonlar RB işlevi8,9yönetmelikte önemli bir rol oynamaktadır. Fosforilasyon böyle bir değişiklik olduğunu ve genellikle Rb inactivation için yol açar. Durgun G0 hücrelerde, Rb düşük fosforilasyon düzeyiyle etkindir. İlerleme G0/G1 evresi boyunca hücreleri Rb sırayla hiper-fosforile siklin bağımlı protein kinaz (CDKs) ve Rb devre dışı bırakın ve hücre döngüsü bastırmak yeteneğini ortadan siklinlere, siklin E/CDK2 ve siklin D/CDK4/6 gibi bir dizi olduğu gen ifadesi4,10ile ilgili. RB da küçük Ubikuitin ilgili değiştirici (SUMO)11,12,13tarafından değiştirilmiş olabilir.
SUMO hedef proteinlerin çeşitli kovalent bağlı bir Ubikuitin benzeri proteindir. Hücre döngüsü Yönetmeliği de dahil olmak üzere çeşitli hücresel süreçler için önemlidir, transkripsiyon, protein Hücrede yerleşimi ve bozulması, taşıma ve DNA tamir14,15,16, 17 , 18. SUMO konjugasyon yolu dimerik SUMO E1 aktive enzim SAE1/UBA2, tek E2 conjugating enzim Ubc9, birden çok E3 ligazlar ve SUMO özgü proteaz oluşur. Genel olarak, yeni doğmakta olan SUMO proteinler proteolytically olgun formu oluşturmak için işlenmesi gerekir. Olgun SUMO E1 heterodimerdir tarafından etkinleştirilir ve E2 enzim Ubc9 transfer. Son olarak, SUMO C-terminal glisin kovalent bir substrat hedef lizin Birleşik ve bu işlem genellikle E3 ligazlar tarafından yönetilir. SUMO protein değiştirilmiş substrat belirli proteaz tarafından kaldırılabilir. Bu kağıt yazarlar tarafından bir önceki çalışma Rb SUMOylation hiper-fosforilasyon için erken G1 faz, hücre döngüsü ilerleme13için gerekli olan bir işlem önde gelen CDK2, onun bağlama artırır saptandı. Biz de Rb SUMOylation bir azalma hücre çoğalması kaybolmasına neden olduğunu gösterdi. Ayrıca, son zamanlarda Rb SUMOylation Rb protein proteasomal işlemlerinden, böylece artan Rb protein hücreleri19düzeyini korur gösterilmiştir. Bu nedenle, SUMOylation çeşitli hücresel süreçler Rb işlevinde önemli bir rol oynar. İleri çalışmalar için işlev sonucu ve Rb SUMOylation, fizyolojik alaka Rb insan hücreleri veya hasta dokuların SUMO durumunu analiz etmek için etkili bir yöntem geliştirmek için önemli.
SUMOylation tersine çevrilebilir, son derece dinamik bir süreçtir. Böylece, genellikle tamamen endojen koşullar altında SUMO modifiye proteinleri tespit etmek zordur. Bu kağıt endojen Rb SUMOylation tespit etmek için bir yöntem sunar. Ayrıca eksojen Rb SUMOylation vahşi tipi Rb ve SUMO-eksik mutasyon11algılamak gösterilmiştir. Özellikle, Jacobs ve ark. özellikle Ubc9 füzyon Yönetmen: SUMOylation (UFDS)20tarafından verilen bir substrat SUMO modifikasyonu artırmak için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem üzerinde bağlı olarak, bu iletişim kuralını zorla SUMOylation Rb ve fonksiyonel sonuçları analiz açıklar. Verilen bu SUMO yüzeylerde yüzlerce daha önce tarif var ve daha fazla sözde SUMO yüzeylerde birçok proteomik tabanlı deneyleri tespit edilmiştir, bu iletişim kuralı bu proteinler insan hücrelerinde SUMO modifikasyonu analiz etmek için uygulanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. algılama, endojen Rb SUMOylation erken G1 faz
- hücre kültür ve hücre döngüsü eşitleme.
- Büyüme orta Dulbecco içeren hücrelerde korumak HEK293 ' s % 1 kalem-Strep ve % 10 fetal sığır serum (FBS) 37 ° C ve % 5 CO 2 bir kuluçka adlı ile takıma modifiye kartal orta (DMEM).
- HEK293 hücreleri G0 aşamasında eşitleyin.
- Sayısı 15 cm hemasitometre ve tohum ~1.5 x 10 7 hücreleri kullanarak HEK293 hücreleri ile tedavi öncesi 24 h için 25 ml büyüme orta çanağı. Orta ve yıkama % 70 - % 80, aspiratı izdiham ulaştıktan sonra hücreleri iki kez 5 mL ile fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) prewarmed.
- Ekle 25 mL % 1'i içeren DMEM penisilin-streptomisin ve 72 h. yıkamak için hücreleri 3 mL buz gibi PBS kullanarak plaka dışına 37 ° C'de hücreler kuluçkaya. Hücreleri yeni bir 5 mL tüp içine transfer.
- Akış Sitometresi (Adım 1.2) tarafından hücre döngüsü analizi için hücreleri küçük bir bölümünü konu; 200 x g oda sıcaklığında 5 min için de Santrifüjü tarafından kalan çoğunluk hücre toplama ve sonra onları analiz kadar bir ultra-düşük sıcaklık dondurucuda saklayın Rb SUMOylation,.
- G1-faz elde etmek için hücreleri G0 eşitleme işleminin sonunda DMEM kaldırın ve geri taze büyüme orta, böylece HEK293 hücreleri hücre döngüsü yeniden girmek izin ekleyin. Daha sonra farklı G1 aşamaları, hücreleri toplamak (erken G1: 30 dk; G1: 2 h) analizi ve daha fazla SUMO hücre döngüsü için tahlil.
- HEK293 hücre çift-timidin blok yöntemini kullanarak S aşamasında eşitleyin.
- Bir confluency % 50 ve yıkama hücrelere büyümek HEK293 hücre prewarmed PBS ile. Daha sonra büyüme orta ile 2.5 mM timidin 18 h (ilk blok) için takıma ekleyin.
- Timidin içeren orta kaldırın ve sonra hücreleri iki kez prewarmed PBS ile yıkayın. Taze büyüme orta hücreleri serbest bırakmak 14 h için eklemek.
- Bir pipet ile orta atmak ve hücre döngüsü ve Rb SUMOylation analizini gerçekleştirmeden önce büyüme orta 2.5 mM timidin için başka bir 18 h (ikinci blok) ile takıma ekleyin.
- G2/M için senkronizasyon, plaka ~1.5 × 10 7 HEK293 hücreleri ile 25 mL büyüme orta 24 h için 15 cm çanak için. 400 ng/mL nihai bir konsantrasyon elde edilir kadar nocodazole Orta olarak ekleyin. Son olarak, hücre döngüsü ve Rb SUMOylation analizini gerçekleştirmeden önce 16 h için hücreleri kuluçkaya.
- Hücre döngüsü analizi Akış Sitometresi ile.
- Eşitlenmiş HEK293 PBS içinde yeniden askıya alma ve buz gibi % 70 etanol için 2 h 4'te kullanarak hücre süspansiyon düzeltin Bu hücre kümeleme en aza indirmek için hücre süspansiyon dropwise son bir konsantrasyon elde etmek için buz gibi % 100 etanol ekleyin unutmayın ° C. Yavaşça vortexing ise % 70 etanol.
- Hücreleri, 500 x g, 5 min için santrifüj kapasitesi sonra dikkatle süpernatant atmak ve hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. Santrifüj adımı yineleyin.
- Ekle 500 µL PBS içeren 50 µg/mL nükleik asit propidium iyodür, %0,1 Triton X-100 ve 1 µg/mL RNase A hücrelere leke ve iyice karıştırın. 15 dk 37 için hücreleri kuluçkaya ° C.
- 4 ° C'de örnekleri analiz kadar Akış Sitometresi tarafından depolamak.
- Immunoprecipitation endojen Rb protein.
- Hazırla HEK293 hücre lysates.
- Lyse yavaşça onları buz gibi radyo-immunoprecipitation tahlil (RIPA) lizis arabellek (Tablo 1) 1 ml taze içeren yeniden askıya eşitlenmiş HEK293 hücreleri 20 mM N-Ethylmaleimide, olabilir bir isopeptidase inhibitörü eklendi SUMO proteaz engellemek ve SUMO conjugates stabilize.
- Daha fazla buz Dounce Homojenizasyon, sonication veya sadece 10 kat 2 mL şırınga üzerinde bağlı 21 G iğne üzerinden geçerek hücrelerdeyse lunaparkçı. Sonra buz 5 dakika süreyle hücrelerdeyse kuluçkaya
Not: Rb protein ve diğer arasında kovalent olmayan etkileşim türetilir belirsiz SUMO sinyal ortadan kaldırmak gibi RIPA arabellekte Anyonik deterjan Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) Rb-SUMO, daha sonra belirlenmesi için çok önemlidir Non-Rb türler-SUMO.
- Hücre lysates 18.000 x g 30 dk için de 4'te santrifüj kapasitesi ° C. Transfer supernatants yeni 1,5 mL mikro-santrifüj tüpleri için.
Not: Protokol burada duraklatılmış. Proteinler-80 ° C'de en az 6 ay süreyle saklanabilir. - Her örnek giriş denetimi daha sonra Western blot için hazırlamak için yukarıda açıklanan süpernatant küçük bir bölümünü kurtarmak-e doğru yeni tüp ve-80 mağazasında ° C.
- Yukarıdaki supernatants için 1 µg G non-spesifik fare immünglobulin (IgG) aynı tür ve izotip monoklonal Rb antikor ve 20 µL % 50 protein A/G-sepharose Bulamaç ekleyin. O zaman, nazik rotasyon ile 4 ° C'de 1 h için kuluçkaya.
- Santrifüj kapasitesi 3000 x g 3 dk de örnekleri 4'te ° C. dikkatle supernatants boncuk bozmadan toplamak ve yeni 1,5 mL mikro-santrifüj tüpleri için aktarabilirsiniz. Her örnekleri, 5 µL Rb birincil antikor ve 40 µL % 50 protein A/G-sepharose Bulamaç ekleyin. Sonra bir gecede nazik rotasyon ile 4 ° C'de kuluçkaya.
- Boncuk Santrifüjü 3000 x g 4 ° C'de 3 dk de tarafından toplamak ve dikkatli bir şekilde süpernatant pipetting tarafından çıkarın. Boncuk kaybını önlemek için dikkat edin, boncuk kuru Aspire değil.
- Boncuk dört kez RIPA arabelleği 1 mL ile yıkayın. Her zaman, tüpler de onlara 4 ° C'de 15 dakika süreyle toplamak döndürme tarafından düşük hızlı Santrifüjü 3000 x g 4 ° C'de 3 dk de tarafından boncuk mix ve supernatants atın.
- Supernatants son yıkama servisinden kaldırdıktan sonra Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) yükleme arabellek (Tablo 1) x 30 µL 1 boncuk yeniden askıya alma ve iyice karıştırın.
10 dk santrifüj kapasitesi için örnekleri boncuk cips için 1 dakika için 12.000 x g de
- Incubate bir sıcakta 100 ° C'de tüpler engelleyin. Dikkatle supernatants boncuk bozmadan toplamak ve 1,5 mL mikro-santrifüj tüpleri için transfer.
- Analiz örnekleri tarafından % 4 - % 20 degrade SDS-sayfası jel ve Western blot veya bunları-20 ° c daha sonra kullanmak üzere saklamak.
- Hazırla HEK293 hücre lysates.
2. 6XHis öğesini eksojen Rb SUMOylation insan hücrelerinde analizi
- hücre kültür ve transfection.
- Tohum ~ 6 × 10 6 HEK293 hücreleri 10 cm çanak ve % 75-%85 Konfluent hücreleri elde etmek için normal hücre kültür koşullarda büyüme ortamda 24 h için kuluçkaya. Transfection önce büyüme orta kaldırmak ve prewarmed düşük serum orta 6 mL ekleyin (Tablo malzemeleri görmek) ve bulaşık kuluçka makinesi geri yerleştirin.
- İçin Rb bünye SUMOylation tahlil, eklemek 6XHis öğesini Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT ve Ubc9-C93S Plazmidler her 15 µg içinde 500 µL düşük serum 1,5 mL mikro-santrifüj tüpler, ortamda anılan sıraya göre.
SUMO-konjugasyon vahşi türü Rb ve onun SUMOylation-arızalı mutant analiz etmek, ya da 6XHis öğesini Rb-WT veya Rb-K720R plazmid GFP-SUMO1 birlikte 10 µg mix
- (10 µg) 500 µL serum ortamda 1,5 mL mikro-santrifüj azaltılmış 13 tüpler.
- Bu arada, ayrı bir tüp içinde 50 µL transfection reaktif mix (Tablo malzemeleri görmek) 500 µL serum orta azaltılmış ve 5 dakika süreyle oda sıcaklığında kuluçkaya
- Tam olarak yukarıda açıklanan iki ayrı tüp birleştirmek ve 15 dk. Ekle transfection oda sıcaklığında reaktif/plazmid kompleksleri hücrelere kuluçkaya ve kültür 8 için devam 37 ° c de % 5 CO 2 s
- İle büyüme orta düşük serum orta yerine ve hücreler normal kültür koşullar için 48 saat altında transfection sonra kuluçkaya.
- Nikel 6XHis öğesini Rb protein benzeşme yıkmak.
- Transfected HEK293 hücreleri parçalayıcı ve toplam protein açıklanan bölüm 1.3.1 ayıklamak.
- Santrifüj hücre lysates 18.000 x g de 30 dk 4 ° C. dikkatle supernatants toplamak ve temiz tüpler transfer.
Not: Protein bu noktada-80, 6 aydan fazla donmuş olabilir ° C. - Her örnek giriş denetimi daha sonra Western blot için hazırlamak için yeni tüp ve-80 mağazasında için yukarıda açıklanan supernatants küçük bir bölümünü kaydedin ° C.
- Yıkama 25 µL % 50 nitrilotriacetic asit (Ni-NTA) özel boncuk RIPA arabelleği iki kez her örnek için bir 1,5 mL mikro-santrifüj tüpü ile nikel. 4 3 dk 3000 x g de Santrifüjü tarafından boncuk toplamak ° C.
- Ekleyin 1 M imidazole 10 mM son bir konsantrasyon elde etmek için her örnek için. Sonra her örnek hazır Ni-NTA özel boncuk içeren tüp ekleyin.
- Boncuk ve nazik rotasyon ile 4 ° C'de 2 h için lysates kuluçkaya. Boncuk 3000 x g 4 ° C'de 3 dk de spin ve pipetting tarafından supernatants dikkatli bir şekilde çıkarın. Boncuk kayıplarını önlemek için boncuk kuru Aspire edin değil.
- Boncuk yıkama arabelleği 20 mM imidazole (Tablo 1) içeren 1 mL ile yıkayın. Her zaman, tüpler de rotasyon 15 dk. toplamak için 4 ° C'de tarafından boncuk iplik 4 ° C'de 3 dk 3000 x g de tarafından karıştırın ve supernatants atın.
- Son yıkama sonra elüsyon 30 µL arabellek içeren 250 mM imidazole (Tablo 1) her örnek için ekleyin ve karıştırarak hafifçe vur. O zaman, proteinler elute 4 ° c 20 dk için kuluçkaya.
- Her örnek 6 × SDS-sayfa yükleme arabellek (Tablo 1) ile karıştırın. Sonra bir ısı blok için 10 dk. içinde 100 ° C'de tüpler kuluçkaya
- Santrifüj 12.000 x g boncuk cips için 1 dakika için. Dikkatle supernatants boncuk bozmadan toplamak ve örnekleri 1,5 ml mikro-santrifüj tüpleri için transfer. Western blot tarafından analiz veya daha sonra kullanmak için-20 ° C'de depolanan örnekleri.
3. Western Blot
- immunoprecipitation yük veya % 4-20 degrade SDS-sayfa jelleri üzerine önceki adımlardan gelen elde edilen örnekler aşağı çekin. Elektroforez 120 V proteinler ayırmak 90 dk için kuralları.
- Transfer proteinler jel bir polivinilidin difluoride (PVDF) membran tarafından electroblotting vasıl 300 mA tank aktarım yöntemini kullanarak 4 ° C'de 90 dk için. Oda sıcaklığında 1 h için %5 yağsız süt (Tablo 1) içeren blok arabellekte PVDF membran engellemek.
- Incubate membran ile birincil antikor antikor seyreltme arabelleği % 3 sığır serum albumin (BSA) (Tablo 1) içeren bir 4 ° C'de gecede Birincil antikorlar için bir çalışma konsantrasyonu olarak 0,5 µg/mL (anti-SUMO1 antikor) veya 1:2000 (anti-Rb ve anti-tübülin antikorları) veya 1:5,000 (anti-GFP ve anti-O'nun antikor) bir seyreltme kullanın.
- Yıkama membran 3 x 10 dk 1 x tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik ile ara (TBST) tampon (Tablo 1) kullanarak her zaman için. Membran türler belirli Horseradish peroksidaz HRP Birleşik ikincil antikorlar seyreltilmiş 1:5,000 %5 yağsız süt (Tablo 1) içeren blok arabelleği ile kuluçkaya. Membran 3 yıkama x 10 dk 1 x TBST tampon kullanarak her zaman için.
- Membran çözüm çalışma gelişmiş Kemiluminesan ile (ECL) kuluçkaya. Plastik wrap ile membran kapak ve sinyal gücüne bağlı olarak X-ray film maruz kalmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hücre döngüsü ilerleme sırasında endojen Rb SUMOylation algılamak için bu çalışma ilk HEK293 hücreleri hücre döngüsü (G0, erken G1, G1, S ve G2/M) beş farklı aşamalarında bu kağıt Protokolü bölümünde açıklandığı gibi senkronize. Eşitleme kalitesini nükleik asit leke Akış Sitometresi Analizi (şekil 1) tarafından takip propidium iyodür kullanılarak doğrulandı. Daha sonra hücreleri toplanmış ve RIPA arabellek denaturing tarafından lysed. SUMO proteaz inhibitörü, N-Ethylmaleimide, 20 mM yerli SUMO sinyal deneyler sırasında korumak için son bir konsantrasyon eklenmiştir. Sonra immunoprecipitation denaturing kovalent olmayan belirsiz etkileşim ve bir anti-SUMO1 antikor kullanarak aşağıdaki western blot engellemek için koşullar altında endojen Rb türlerin SUMO sinyal varlığı özellikle de algılandı erken G1 evresi (Şekil 2). Her ne kadar küresel SUMOylation S/G2/M aşamasında zaman noktası, Rb SUMOylation adlı, geliştirilmiş oldu (Şekil 2, giriş paneli) değişiklik olmamıştı. Bu bulgu Rb SUMOylation sade bir şekilde değiştirilmiş küresel SUMO konjugasyon faaliyet sonucu olmadığını göstermektedir. Böylece, bu makalede açıklanan analiz protein immunoprecipitation ve Western blot aşağıdaki sonuçları gösterir SUMOylation endojen Rb protein tespiti için izin verir.
Rb protein, oluşturulan bu çalışmada zorla SUMOylation algılamak için bir kurucu SUMOylated Rb oluşturmak Ubc9, onun C-terminal verimli ve seçici SUMOylation, Rb için (şekil 3A) izin vermek için tek SUMO E2 ligaz eritme tarafından. Ubc9, C93S, işlev kaybı mutasyon aynı zamanda C-Terminal bir denetimi (şekil 3A) hizmet için Rb, eritilmiş olan. Daha fazla SUMO-Rb sinyal özgüllük güçlendirmek için Ubc9 yalnız olmayan erimiş de inşa edildi. 20 mM ile N-Ethylmaleimide takıma RIPA arabelleği lysed önce O'nun öğesini Plazmid dört 48 h HEK293 hücre içine transfected. Tüm proteinler sonra tahlil, yıkmak için bu kağıt Protokolü bölümünde açıklandığı gibi tabi tutuldu. Eluted Rb proteinler Western blot tarafından analiz edildi. Ubc9 fusion yönetmen-Ubc9 arızalı mutasyon, C93S, bu sinyali üretmek başarısız oldu, ancak Rb SUMOylation bir anti-SUMO1 antikor (şekil 3B, SUMO1 paneli), kullanarak tespit edildi. Not bile daha yüksek molekül ağırlıklı Wataha götürür Ubc9-füzyon tarafından neden olduğu yüksek verimli SUMO değişikliği doğrudan Rb antikor kullanarak tespit edilebilir ve SUMO sinyal (şekil 3B, Rb paneli) karşılık gelir. Ayrıca, Ubc9 yalnız herhangi bir SUMO konjugasyon daha fazla Rb özel SUMOylation (şekil 3B) teyit neden olmadı.
SUMO1 Rb protein11720 lizin Birleşik çünkü Rb SUMOylation daha ileri düzeyde çözümlemek için bu çalışmada bir SUMO-eksik mutasyon bir arginin (K720R) ile bu lizin kalıntı değiştirerek oluşturulur. SUMO-fiil iki geçici ifade Rb proteinlerin algılama kolaylaştırmak için bir GFP-SUMO1 yapısı hücre içi SUMO sinyal artırmak için eklendi. Etiketli onun yaban türü veya mutant Rb HEK293 hücrelere GFP-SUMO1, tahlil ve Rb-SUMO1 fiil yeteneği analiz aşağı çekme ardından birlikte ortak transfected. Gibi K720R mutant Rb Rb SUMOylation (şekil 4) tespit etmek için önerilen yöntemin yeteneği daha da güçlendirilmesi, SUMO modifikasyonu tamamen kaldırıldı.
Resim 1 : Hücre döngüsü eşitleme tahlil Akış Sitometresi tarafından doğrulanmasını. HEK293 hücreler kültürlü ve G0, erken G1 G1, S ve G2/M aşamaları hücre döngüsünün bu protokol için açıklanan senkronize. Hücre döngüsü Dağılımları (FACS) sıralama Floresans aktif hücre tarafından belirlenmiştir. Kantitatif analiz FACS testin bir örneği temsil veri gösterilir (n = 1). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Rb's SUMOylated erken G1 aşamasında. HEK293 hücreleri hücre döngüsünün farklı aşamalarında bu protokol için açıklandığı gibi senkronize. Hücreleri toplanmış ve 20 mM ile N-Ethylmaleimide takıma RIPA tampon lysed. Giriş denetimleri üzerinde bir % 4 - % 20 SDS-sayfa degrade jel dolu, transfer ve anti-SUMO1 ve anti-tübülin ile belirtildiği şekilde deyimiyle. Kalan hücre lysates sonra 1: 200 bir dilüsyonu anti-Rb antikor kullanılarak immunoprecipitation tabi tutuldu. Elde edilen eluents % 4 - % 20 SDS-sayfa degrade jel ve anti-SUMO1 antikor ve anti-Rb antikor kullanarak immunoblotted tarafından ayrı kaldık. Bu deney ile aynı sonucu iki kez tekrarlandı. Bu rakam izni13ile değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Rb-Ubc9 füzyon protein SUMO modifikasyonu tespiti. Ubc9 fusion Yönetmen: SUMOylation (UFDS) yapıları, Rb. (B) kurucu SUMOylation, UFDS tarafından neden olduğu Rb,(a)diyagramı. HEK293 hücreleri geçici onun etiketli UFDS yapıları ile transfected RIPA arabelleği 20 mM N-Ethylmaleimide ile lysed. Her örneği lysate toplam O'nun öğesini Rb-Ubc9 füzyon protein veya (negatif kontrol kullanılan), Ubc9 sırasıyla aşağı çekmek için Ni-NTA özel boncuk ile inkübe. Saf protein % 4 - % 20 SDS-sayfa degrade jel ve immunoblotted anti-SUMO1 ve anti-O'nun antikorlar tarafından ayrı kaldık. O'nun-Rb: Rb-Ubc9 füzyon protein 6XHis öğesini; O'nun-Ubc9: 6XHis Ubc9 sadece etiketledi. RB-Ubc9: değiştirilmemiş Rb-Ubc9; RB-Ubc9-S: SUMOylated Rb-Ubc9; Hyper-sorun-Ubc9: hiper fosforile Rb-Ubc9. Şekilde gösterilen üç bağımsız denemelerin temsilcisi sonuçlarıdır. Bu rakam izni13ile değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Rb SUMOylation SUMO-eksik K720R mutasyon azaltır. HEK293 hücreleri geçici işbirliği GFP-SUMO1 birlikte vahşi türü veya mutant Rb-O'nun yapıları ile transfected. Hücreleri toplanmış ve 20 mM ile N-Ethylmaleimide takıma RIPA tampon lysed. Lysates küçük bir bölümünü doğrudan Western tarafından analiz edildi leke giriş denetimi. Lysates kalan bu protokol için açıklandığı gibi O'nun öğesini Rb proteinler aşağı çekmek için Ni-NTA özel boncuk ile inkübe ve anti-SUMO1 ve anti-O'nun antikorlar ile immunoblotted idi. Rb 720, lizin arginin mutasyon tot NotAlly bu proteinin SUMO modifikasyonu onuntemsilcilerini yasakladı Deneme bir kez buna benzer bir sonuç daha önce11rapor ile yapılmıştır. Bu rakam izni13ile değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Çözüm | Bileşenleri | Yorumlar |
| RIPA lizis arabellek | 50 mM Tris, pH = 8.0; 150 mM NaCl; % 1 NP-40; % 1 sodyum deoxycholate; %0.1 SDS | Proteaz inhibitörü kokteyl ve N-ethylmaleimide kullanımdan hemen önce ekleyin. |
| Yıkama arabellek | 50 mM NaH2PO4 pH 8.0; = 300 mM NaCl; 20 mM imidazole | Sadece tahlil çekme için kullanılan |
| Elüsyon arabellek | 50 mM NaH2PO4 pH 8.0; = 300 mM NaCl; 250 mM imidazole | Sadece tahlil çekme için kullanılan |
| Arabellek yükleme x 6 | 0,5 M Tris, pH 6.8; = % 30 gliserol; % 10 SDS; %5 β-mercaptoethanol; %0.1 bromphenol mavi | Mağaza-20 ° c |
| Arabellek çalıştıran x 10 | 0.25 M Tris, pH 8,6; 1.9 M glisin; % 1 SDS | 1 x çalışan tampon yapmak için: 100 ml 10 çalışan arabellek x 900 mL GKD2ile O karıştırmak |
| 10 x Aktarım arabellek | 0.25 M Tris, pH 8.3, 1.9 M glisin | 1 x Aktarım arabellek yapmak için: 100 mL 10 x 200 ml metanol ile Aktarım arabellek ve 700 mL GKD2O karıştırmak |
| 10 x TBS arabellek | GKD2O: 24,08 g Tris pH 7.4 1 L içinde; 80 gr NaCl | 1 x TBST tampon yapmak: 900 mL GKD2O ve ara-20 1 mL 100 mL 10 x TBS arabellek karıştırın |
| Arabellek engelleme | %1 5 yağsız kuru süt ile x TBST | Arabellek kullanımdan hemen önce hazırlamak |
| Antikor seyreltme arabellek | 1 ile %3 BSA ve %0.02 sodyum azid x TBST | Bu arabellek 4 ° C'de en az 6 ay için saklanan olabilir |
Tablo 1: Çözümler ve arabellekleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu kağıt algılayabilir ve Rb endojen SUMOylation insan hücrelerinde çözümlemek için bir protokol açıklar. Bu yöntem özellikle küresel sinyal SUMO ile ilgili herhangi bir değişim olmadan endojen Rb protein üzerinde duruldu gibi Rb-SUMO değişiklik tamamen doğal fizyolojik koşullar altında soruşturma için önemli bir araçtır.
Bu amaca ulaşmak için unutmayın ki bu: 1) SUMO dört izoformlarının (SUMO1-4, her farklı genler tarafından kodlanmış) ubiquitination ile karşılaştırıldığında kapsar rağmen SUMO türler daha az bol; 2) çoğu SUMO hedef proteinler için verilen bir protein yalnızca küçük bir bölümünü sabit devlet, SUMO konjugasyon ilgili enzimler arasında sürekli rekabet sonucu ve14,21deconjugation SUMOylated olduğunu; ve 3) SUMO hedefler SUMOylation ve deSUMOylation hızlı döngüleri tabi. Örneğin, son veri geçerli bu kağıt yazarlar tarafından elde Rb-SUMO1 sadece SUMOylation13 tersine çevrilebilir, son derece dinamik bir süreç olduğunu anlayışı ile tutarlıdır erken G1 aşamasında zaman çok kısa bir pencere için var olduğunu göstermek . Tüm bu gerçekler doğrudan verilen bir protein endojen SUMOylation tespit etmek zor olsun. Böylece, başarılı bir şekilde bu algılamak için kesin şartlar altında bu değişiklik oluşur tanımlamak önemlidir. Örneğin, önerilen bu protokol için hücre döngüsü Eşitleme zamanlaması Rb SUMOylation tespiti için çok önemlidir. En iyi duruma getirilmiş deneysel bir işlem için verilen bir protein alt düzey SUMO-modified tür algılama başarılı da önemlidir. Örneğin, uygun sonication veya geçen aracılığıyla iğneler yapışkan ve yapışkan bileşenleri genomik DNA nedeniyle oluşumu engelleyebilir, böylece uygun sonication toplam protein ayıklama kolaylaştırabilir. Ayrıca, hedef protein yüksek afinite ile iyi bir Monoklonal antikor miktarı ve immunoprecipitation özgüllüğü artırmak için yardımcı olabilir. Özet olarak, önerilen yöntem daha da altında endojen Rb SUMOylated, hangi aşağıdaki overexpression tabanlı fonksiyonel testin öncül olduğunu fizyolojik şartlarda keşfetmek için önemlidir.
Belirli bir protein SUMO sinyal yükseltmek için co-overexpress yanı sıra diğer SUMO kaynaklı proteinler (genellikle Ubc9 ve SUMO protein) hücrelerde bu protein için yaygındır. Bir antikor substrat karşı kullanarak basit bir Western blot daha yüksek molekül ağırlıklı, bu proteinin SUMOylated formu bulmak için en kolay yolu olsa da, biz bu yöntemle SUMO-Rb sinyali algılamak başarısız oldu. Böylece, bu kağıt sadece zarlarını eksojen Rb protein SUMO değişimini algılamak için bir yöntem üzerinde duruldu. Ayrıca, bu yöntem nasıl yapay olarak geliştirmek veya SUMO-konjugasyon Rb, ortadan kaldırmak için nitelendirdi. Tek E2 ligaz doğrudan SUMO belirli hedefleri22' ye aktarmak için Ubc9 bulundu. Böylece, Rb C terminaline eritme tarafından Ubc9 önemli ölçüde SUMO-modifikasyonu Rb. bu yöntemi kullanarak teşvik etmektedir, bu kağıt yazarlar başarıyla Rb SUMOylation yeterince onun bağlama artırarak kendi fosforilasyon terfi gösterdi CDK213için. Ayrıca, Rb SUMOylation kaybı fonksiyonel sonuçları çalışmaya, daha önce bildirilen11bir SUMO-eksik Rb yapı yazarlar oluşturulan. Bu geçerli raporda önerilen yöntem kullanarak, bu SUMO-Rb normal hücre döngüsü ilerleme ve Hücre proliferasyonu13için gerekli olduğunu gösterilmiştir.
SUMO1 ek olarak, SUMO2 ve SUMO3 aynı zamanda protein SUMOylation14,17önemli rol oynarlar. Çünkü onlar yakından ilgilidir ve % 97'si kimlik paylaşmak SUMO2 ve SUMO3 SUMO2/3 anılır. SUMO1% 50 benzerlik SUMO2/3 ile paylaşır. Bu yaygın olarak SUMO-2/3 ağırlıklı olarak hücre stres yanıt-e doğru15,17,23' te, söz konusu ise SUMO1 normal hücre fizyolojik fonksiyonları ve bakım, sorumlu olduğunu kabul edilir 24. Rb da bilinmeyen fonksiyon12ile SUMOylated SUMO2/3 tarafından olabilir olduğunu göz önüne alındığında, bu çalışmada önerilen yöntem hala algılama ve Rb bu değişiklik analizi için uygundur. RB ek olarak, yöntem tanımlamak burada yaygın olarak algılama ve hedef proteinler çeşitli SUMOylation fonksiyonel analiz için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu çalışmada bilim ve teknoloji Komisyonu Shanghai (Grant No. 14411961800) ve Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (Grant No. 81300805) gelen hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Triton X-100 | AMRESCO | 694 | |
| RNase A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E3876 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | AMRESCO | M107 | |
| Nonidet P-40 Substitute (NP-40) | AMRESCO | M158 | |
| protease inhibitor | Roche | 5892970001 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Rb antibody | Cell Signaling Technology | #9309 | |
| Protein A/G-Sepharose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| Lipofectamine-2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads | Qiagen | 30230 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| 4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel | BIO-RAD | 4561096 | |
| Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Tween-20 | AMRESCO | M147 | |
| Tubulin antibody | Abmart | M30109 | |
| SUMO1 antibody | Thermo Fisher Scientific | 33-2044 | |
| GFP antibody | Abmart | M20004 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| enhanced chemiluminescence (ECL) Kit | Thermo Fisher Scientific | 32106 |
References
- Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
- Massague, J. G1 cell-cycle control and cancer. Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).
- Weinberg, R. A. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 81 (3), 323-330 (1995).
- Giacinti, C., Giordano, A. RB and cell cycle progression. Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).
- Burkhart, D. L., Sage, J. Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene. Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).
- Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion. Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).
- Hilgendorf, K. I., et al. The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria. Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).
- Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct. Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).
- Macdonald, J. I., Dick, F. A. Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function. Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).
- Ezhevsky, S. A., et al. Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).
- Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor. Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).
- Li, T., et al. Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways. J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).
- Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase. Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).
- Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. Concepts in sumoylation: a decade on. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).
- Flotho, A., Melchior, F. Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease. Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).
- Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
- Wilkinson, K. A., Henley, J. M. Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation. Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).
- Sharma, P., Kuehn, M. R. SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization. Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).
- Jakobs, A., et al. Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation. Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Saitoh, H., Hinchey, J. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3. J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).
- Ayaydin, F., Dasso, M. Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues. Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).
