Summary
Liten ubiquitin-relaterade modifierare (SUMO) familj proteiner konjugeras till lysin resthalter av målproteiner att reglera olika cellulära processer. Detta dokument beskriver ett protokoll för detektion av retinoblastom (Rb) protein SUMOylation under endogena och exogena förhållanden i mänskliga celler.
Abstract
De post-translationella modifieringar av proteiner är avgörande för korrekt reglering av intracellulära signaltransduktion. Bland dessa ändringar är små ubiquitin-relaterade modifierare (SUMO) en ubiquitin-liknande protein som är kovalent kopplad till lysin resthalter av en mängd målproteiner att reglera cellulära processer, såsom transkription av gener, DNA-reparation, protein interaktion och nedbrytning, subcellulär transport och signaltransduktion. Den vanligaste metoden att upptäcka protein SUMOylation baseras på uttryck och rening av rekombinanta märkta proteiner i bakterier, vilket möjliggör en in vitro- biokemisk reaktion som är enkla och lämpar sig för adressering mekanistiska frågor. Det är dock på grund av komplexiteten i processen för SUMOylation i vivo, svårare att upptäcka och analysera protein SUMOylation i celler, särskilt när villkor endogena. En färsk studie av författarna till detta dokument visade att endogena retinoblastom (Rb) protein, en tumörsuppressor som är avgörande för negativ reglering av Cellcykelprogression, specifikt SUMOylated på den tidiga G1-fasen. Detta dokument beskriver ett protokoll för detektering och analys av Rb SUMOylation under både endogena och exogena förhållanden i mänskliga celler. Detta protokoll är lämpliga för fenotypiska och funktionell undersökning av SUMO-ändring av Rb, liksom många andra SUMO-riktade proteiner, i mänskliga celler.
Introduction
Noggrann kontroll av cellcykelns förlopp i eukaryota celler är baserad på ett tight regulatoriska nätverk, vilket säkerställer att särskilda händelser äga rum i en ordnad sätt1,2. En av de viktigaste aktörerna i detta nätverk är proteinet retinoblastom (Rb), det första klonade tumör suppressor1,3. Rb proteinet tros vara en negativ regulator av cellcykelns förlopp, särskilt för G0/G1 S fasövergång, och tumör tillväxt4,5. Misslyckande av Rb funktion leder antingen direkt till de vanligaste intraokulära malignitet hos barn, retinoblastom, eller bidrar till utvecklingen av många andra typer av cancer5. Rb är dessutom involverad i många cellulära vägar, inklusive celldifferentiering, kromatin remodeling och mitokondrier-medierad apoptos3,6,7.
Post-translationella modifieringar spelar en central roll i regleringen av RB funktion8,9. Fosforylering är en sådan ändring, och det leder vanligtvis till Rb inaktivering. I quiescent G0 celler är Rb aktiv med en låg fosforylering nivå. Som cellerna framsteg genom G0/G1-fasen, är Rb sekventiellt hyper-fosforyleras av en serie av cyklin-beroende proteinkinaser (CDKs) och cyclins, till exempel cyklin E/CDK2 och cyklin D/CDK4/6, som inaktivera Rb och eliminera dess förmåga att undertrycka cellcykeln relaterade gen uttryck4,10. RB kan också ändras genom små ubiquitin-relaterade modifierare (SUMO)11,12,13.
SUMO är en ubiquitin-liknande protein som är kovalent kopplad till en mängd målproteiner. Det är avgörande för olika cellulära processer, inbegripet cellcykelns reglering, transkription, protein cellulär lokalisering och nedbrytning, transport och DNA reparation14,15,16, 17 , 18. the SUMO konjugation pathway består av dimeriskt SUMO E1 aktiverande enzymet SAE1/UBA2, enda E2 konjugera enzymet Ubc9, flera E3 ligases och SUMO-specifika proteaser. Allmänhet, begynnande SUMO proteiner måste bearbetas proteolytically för att generera mogen form. Den mogna SUMO aktiveras av den E1 heterodimer och överförs sedan till E2 enzymet Ubc9. Slutligen, den C-terminal glycin av SUMO är kovalent konjugerad med den mål lysin av substrat, och denna process underlättas vanligtvis av E3 ligases. SUMO proteinet kan tas bort från den modifierade substraten av specifika proteaser. En tidigare studie av författarna till detta dokument visade att SUMOylation av Rb ökar dess bindning till CDK2, leder till hyper-fosforylering på den tidiga G1-fasen, en process som är nödvändig för cellcykeln progression13. Vi har också visat att förlusten av Rb SUMOylation orsakar en minskad cellproliferation. Det var dessutom nyligen visat att SUMOylation av Rb skyddar Rb proteinet från proteasomen omsättning, vilket ökar nivån av Rb protein i cellerna19. Därför spelar SUMOylation en viktig roll i Rb-funktionen i olika cellulära processer. Fortsätta att undersöka de funktionella konsekvens och fysiologiska relevansen av Rb SUMOylation, det är viktigt att utveckla en effektiv metod för att analysera SUMO status för Rb i mänskliga celler eller vävnader som patienten.
SUMOylation är en reversibel, högdynamiska process. Det är således vanligtvis svårt att upptäcka de SUMO-modifierade proteinerna helt endogena villkor. Detta dokument presenterar en metod för att upptäcka endogena Rb SUMOylation. Dessutom visar den hur man upptäcker exogena Rb SUMOylation av både vildtyps-Rb och dess SUMO-brist mutation11. I synnerhet beskrivs Jacobs et al. en metod för att öka SUMO modifiering av ett visst substrat specifikt av Ubc9 fusion-riktade SUMOylation (UFDS)20. Baserat på denna metod, beskriver det här protokollet hur du analyserar Tvingad SUMOylation av Rb och dess funktionella konsekvenser. Med tanke på att hundratals SUMO substrat har beskrivits tidigare och mer förmodad SUMO substrat har identifierats från många proteomiska-baserade analyser, kan detta protokoll användas för att analysera SUMO-modifiering av dessa proteiner i mänskliga celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. identifiering av endogena Rb SUMOylation på den tidiga G1-fasen
- Cell kultur och cellcykeln synkronisering.
- Hålla HEK293 celler i odlingsmedium som innehåller Dulbecco ' s ändrad Eagle Medium (DMEM) kompletteras med 1% penna-Strep och 10% fetalt bovint serum (FBS) vid 37 ° C och 5% CO 2 i en inkubator.
- Synkronisera HEK293 cellerna fasen G0.
- Count HEK293 cellerna med hjälp av en hemocytometer och utsäde ~1.5 x 10 7 celler i en 15 cm skålen med 25 ml odlingsmedium för 24 h före behandling. Efter att ha nått ett sammanflöde av 70% - 80%, aspirera på medellång och tvätta cellerna två gånger med 5 mL föruppvärmd fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Tillsätt 25 mL DMEM innehållande 1% Penicillin-Streptomycin och inkubera cellerna vid 37 ° C för 72 h. Tvätta cellerna av plattan med 3 mL iskallt PBS. Överför cellerna till en ny tub 5 mL.
- Som omfattas av en liten del av celler cellcykeln analys av flödescytometri (steg 1.2); samla återstående majoriteten av cellerna genom centrifugering vid 200 x g under 5 minuter i rumstemperatur, och sedan lagra dem i en ultra-lägre temperatur frys tills analysen. av Rb SUMOylation.
- För att erhålla G1-fas celler, i slutet av synkroniseringsprocessen G0 ta bort DMEM och Lägg tillbaka färska odlingsmedium, vilket gör att de HEK293 cellerna att återinträda på cellcykeln. Sedan samla celler på olika G1 faser (tidig G1: 30 min; G1: 2 h) för cellcykeln analys och ytterligare SUMO assay.
- Synkronisera HEK293 celler i S-fas med metoden dubbel-tymidin block.
- Växa HEK293 celler till en konfluens av 50% och tvätta cellerna med förvärmd PBS. Lägg sedan till odlingsmedium som kompletteras med 2,5 mM tymidin för 18 h (första blocket).
- Bort Tymidinanalog-med mediet och sedan tvätta cellerna två gånger med förvärmd PBS. Lägga till färska odlingsmedium för 14 h att släppa cellerna.
- Kasta medlet med en pipett och lägga till odlingsmedium som kompletteras med 2,5 mM tymidin för en annan 18 h (andra block) innan du utför en analys av cellcykeln och Rb SUMOylation.
- För the G2/M synkronisering, plattan ~1.5 × 10 7 HEK293 celler till en 15 cm skålen med 25 mL odlingsmedium för 24 h. Lägg sedan till nocodazole medlet tills en slutlig koncentration på 400 ng/mL erhålls. Slutligen, inkubera cellerna för 16 h innan du utför analysen av cellcykeln och Rb SUMOylation.
- Cellcykeln analys av flödescytometri.
- Slamma den synkroniserade HEK293 i PBS, och sedan fixa cellsuspension med iskall 70% etanol för 2 h vid 4 ° C. Observera att minimera cell klustring, Lägg till cellsuspensionen droppvis och iskall 100% etanol att erhålla en slutlig koncentration 70% etanol medan försiktigt vortexa.
- Centrifugera cellerna under 5 minuter vid 500 x g, sedan försiktigt avlägsna supernatanten och tvätta cellerna två gånger med PBS. Upprepa detta centrifug.
- Lägga till 500 µL PBS som innehåller 50 µg/mL nukleinsyra fläcken propidium jodid, 0,1% Triton X-100 1 µg/mL RNase A till cellerna och blanda väl. Inkubera cellerna under 15 minuter vid 37 ° C.
- Lagra proverna vid 4 ° C tills analys med flödescytometri.
- Immunoprecipitation endogena Rb protein.
- Förbereda HEK293 cell lysates.
- Lyse synkroniserade HEK293 cellerna genom försiktigt åter att avbryta dem i 1 mL iskallt radio-immunoprecipitation assay (RIPA) lyseringsbuffert (tabell 1) med nyaktiverad lagt till 20 mM N-Ethylmaleimide, en isopeptidase-hämmare som kunde blockera SUMO proteaser och stabilisera SUMO konjugat.
- Ytterligare homogenisera cellerna på is av Dounce homogenisering, ultraljudsbehandling eller helt enkelt passerar genom 10 gånger genom en 21 G nål fäst på en 2 mL spruta. Sedan, inkubera cellerna på is för 5 min.
Obs: De anjoniska tvättmedel dodecyl natriumsulfat (SDS) i RIPA bufferten är avgörande för senare bestämning av Rb-SUMO, som det kunde eliminera ospecifikt SUMO signalen som härleds från den icke-kovalenta interaktionen mellan Rb proteinet och andra icke-Rb SUMO-arter.
- Centrifugera den cell lysates på 18.000 x g under 30 minuter vid 4 ° C. överför supernatanterna till nya 1,5 mL mikro-centrifugrör.
Obs: Protokollet kan pausas här. Proteinerna kan lagras vid-80 ° C i minst 6 månader. - För att förbereda ingående kontroll av varje prov för senare Western blot, spara en liten del av ovan beskrivna supernatanten till en ny tub och förvaras vid -80 ° C.
- Till ovan supernatanterna, Lägg till 1 µg icke-specifik mus immunglobulin G (IgG) av samma art och isotypen som Rb monoklonala antikroppen och 20 µL av 50% protein A/G-sepharose flytgödsel. Sedan, inkubera i 1 h vid 4 ° C med varsam rotering.
- Centrifugera proverna vid 3 000 x g under 3 minuter vid 4 ° C. noggrant samla supernatanterna utan att störa pärlorna och överföra dem till nya 1,5 mL mikro-centrifugrör. Till varje prov, tillsätt 5 µL Rb primär antikropp och 40 µL av 50% protein A/G-sepharose flytgödsel. Sedan, inkubera över natten vid 4 ° C med varsam rotering.
- Samla pärlor genom centrifugering vid 3 000 x g i 3 minuter vid 4 ° C, och ta försiktigt bort supernatanten genom pipettering. Observera att för att undvika pärla förlust, inte aspirera pärlor torr.
- Tvätta pärlorna fyra gånger med 1 mL av RIPA bufferten. Varje gång, blanda rören väl genom rotation dem vid 4 ° C i 15 min. samla pärlor med lågt varvtal centrifugering vid 3 000 x g i 3 minuter vid 4 ° C och sedan kasta supernatanterna.
- Efter bort supernatanterna från den sista tvätten, återsuspendering pärlor i 30 µL 1 x sodium dodecyl sulfate-polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE) lastning buffert (tabell 1) och blanda väl.
- Inkubera rören vid 100 ° C i en värme blockera för 10 min. Centrifugera proverna vid 12 000 x g för 1 min till pellet pärlorna. Försiktigt samla supernatanterna utan att störa pärlorna och överföra dem till 1,5 mL mikro-centrifugrör.
- Analysera proverna med 4% - 20% lutning SDS-PAGE gel och Western blot eller lagra dem på-20 ° C för senare användning.
- Förbereda HEK293 cell lysates.
2. Analys av 6XHis-märkta exogena Rb SUMOylation i mänskliga celler
- Cell kultur och transfection.
- Utsäde ~ 6 × 10 6 HEK293 celler i en 10 cm skålen och Inkubera under 24 h i odlingsmedium under normal cell kultur villkor för att förvärva 75% - 85% konfluenta celler. Innan transfection, ta bort odlingsmedium och Lägg 6 mL förvärmd minskade serum medium (se Tabell av material) och placera sedan rätterna tillbaka till inkubatorn.
- För the Rb konstituerande SUMOylation assay, Lägg 15 µg varje av 6XHis-märkta Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT och Ubc9-C93S plasmider i 500 µL minskade serum medium i 1,5 mL mikro-centrifugrör, respektive.
- Att analysera SUMO-konjugationen av wild typ Rb och dess SUMOylation-defekta mutant, blanda 10 µg av antingen 6XHis-taggade Rb-WT eller Rb-K720R plasmid tillsammans med GFP-SUMO1 (10 µg) i 500 µL minskade serum medium i 1,5 mL mikro-centrifug Tubes 13.
- Samtidigt i ett separat rör, blanda 50 µL transfection reagens (se Tabell för material) i 500 µL minskade serum medium och odla i rumstemperatur i 5 min.
- Fullt kombinera två separata rören ovan, och odla i rumstemperatur i 15 min. Lägg transfection reagens/plasmid komplex till cellerna och fortsätta att kultur för 8 h vid 5% CO 2 och 37 ° C.
- Ersätt minskade serum medium med odlingsmedium och inkubera cellerna under normala odlingsbetingelser för 48 h efter transfection.
- Nickel affinitet dra ner av proteinet 6XHis-taggade Rb.
- Lyse de transfekterade cellerna HEK293 och extrahera de totala proteinerna som beskrivs avsnitt 1.3.1.
- Centrifug den cell lysates vid 18.000 x g under 30 minuter vid 4 ° C. noggrant samla supernatanterna och överföra dem till rena rör.
Obs: Proteinet kan frysas vid denna punkt för mer än 6 månader vid -80 ° C. - För att förbereda ingående kontroll av varje prov för senare Western blot, spara en liten del av supernatanterna ovan och en ny tub och förvaras vid -80 ° C.
- Tvätta 25 µL av 50% nickel nitrilotriacetic syra (Ni-NTA) agaros pärlor med RIPA bufferten två gånger i ett 1,5 mL mikro-centrifugrör för varje prov. Samla pärlor genom centrifugering vid 3 000 x g under 3 minuter vid 4 ° C.
- Add 1 M Imidazol till varje prov för att erhålla en slutlig koncentration på 10 mM. Lägg sedan till varje prov till röret som innehåller förberedda Ni-NTA agaros pärlorna.
- Inkubera pärlorna och lysates för 2 h vid 4 ° C med varsam rotering. Snurra pärlor vid 3 000 x g i 3 minuter vid 4 ° C och ta försiktigt bort supernatanterna genom pipettering. För att undvika pärla förlust, inte aspirera pärlor torr.
- Tvätta pärlorna med 1 mL av tvättbuffert innehållande 20 mM Imidazol (tabell 1). Varje gång, blanda rören väl genom rotation vid 4 ° C i 15 min. samla pärlor av snurrande vid 3 000 x g i 3 minuter vid 4 ° C och kassera supernatanterna.
- Efter den sista tvättningen, lägga 30 µL av eluering buffert innehållande 250 mM Imidazol (tabell 1) till varje prov och svep för att blanda. Sedan, inkubera i 20 minuter vid 4 ° C till eluera proteinerna.
- Blanda varje prov med 6 × SDS-PAGE lastning buffert (tabell 1). Sedan, inkubera rören vid 100 ° C i en värme-blocket för 10 min.
- Centrifug på 12 000 x g för 1 min till pellet pärlorna. Omsorgsfullt samla supernatanterna utan att störa pärlorna och överföra proverna till 1,5 ml mikro-centrifugrör. Proverna kan analyseras genom Western blot eller lagras vid-20 ° C för senare användning.
3. Western Blot
- Ladda immunoprecipitation eller dra ner prover som erhållits från föregående steg på 4-20% lutning SDS-PAGE geler. Genomföra elektrofores vid 120 V för 90 min att separera proteinerna.
- Överföra proteinerna från gelen till ett polyvinylidene kryptondifluorid (PVDF) membran av electroblotting på 300 mA för 90 minuter vid 4 ° C med hjälp av metoden tank överföring. Blockera PVDF membranet i block buffert som innehåller 5% nonfat mjölk (tabell 1) för 1 h i rumstemperatur.
- Inkubera membranet med primär antikropp i antikropp förtunningsbuffert som innehåller 3% bovint serumalbumin (BSA) (tabell 1) över natten vid 4 ° C. För primära antikroppar, använda en fungerande koncentration av 0,5 µg/mL (anti-SUMO1 antikropp), eller en utspädning av 1: 2000 (anti-Rb och anti Tubulin antikroppar) eller 1:5,000 (anti-GFP och anti hans antikropp).
- Tvätta membranet 3 x 10 min varje gång använder 1 x tris-buffrad koksaltlösning med interpolering (TBST) buffert (tabell 1). Inkubera membranet med arter specifika pepparrot peroxidas HRP-konjugerad sekundära antikroppar utspädda 1:5,000 i block buffert som innehåller 5% nonfat mjölk (tabell 1). Tvätta membranet 3 x 10 min varje gång med 1 x TBST buffert.
- Inkubera membranet med förbättrad chemiluminescence (ECL) arbetar lösning. Täcka membranet med plastfolie och Utsätt det för röntgenfilm beroende på styrkan signal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att upptäcka endogena Rb SUMOylation under Cellcykelprogression, synkroniseras denna studie först HEK293 celler vid fem olika faser av cellcykeln (G0, tidig G1, G1, S och G2/M) som beskrivs i avsnittet protokollet i denna uppsats. Kvaliteten på synkronisering bekräftades med hjälp av nukleinsyra fläcken med propidium jodid följt av flödescytometri Flödesanalys (figur 1). Nästa, cellerna samlades in och lyserat av denaturering RIPA bufferten. Den SUMO proteaser hämmaren, N-Ethylmaleimide, lades till en slutlig koncentration på 20 mM för att bevara den infödda SUMO-signalen under experimenten. Efter immunoprecipitation av endogena Rb arter under denatureringen villkor att blockera icke-kovalenta ospecifikt samspelet, och följande western blot med en anti-SUMO1 antikroppen, upptäcktes särskilt förekomsten av SUMO signalen vid den tidiga G1 fasen (figur 2). Även om den globala SUMOylation var bättre på den S/G2/M-fasen, på den tiden led av Rb SUMOylation, hade det inte förändrats (figur 2, Inmatningspanelen). Detta fynd tyder på att SUMOylation av Rb inte är helt enkelt en följd av förändrad global SUMO konjugation aktivitet. Således kan dessa resultat visar att de protein immunoprecipitation och Western blot analys som beskrivs i detta dokument för detektion av SUMOylation av endogena Rb proteinet.
För att upptäcka den påtvingade SUMOylation av proteinet Rb, denna studie genereras konstruera en konstitutiv SUMOylated Rb genom att smälta Ubc9, den enda SUMO E2 ligase, till sin C-terminal som möjliggör effektiv och selektiv SUMOylation av Rb (figur 3A). Förlust-of-function mutation av Ubc9, C93S, smälts också på C-terminalen av Rb att fungera som en kontroll (figur 3A). För att ytterligare stärka idrottens särdrag SUMO-Rb signalen, konstruerades samt icke-smält Ubc9 ensam. Alla fyra av hans-taggade plasmidsna var transfekterade i HEK293 celler för 48 h innan de var lyserat i RIPA bufferten kompletteras med 20 mM N-Ethylmaleimide. Alla proteiner utsattes sedan för en dra ner assay, som beskrivs i avsnittet protokollet i denna uppsats. De eluerade Rb proteinerna analyserades av Western blot. Ubc9 riktade fusion-SUMOylation av Rb upptäcktes med hjälp av en anti-SUMO1 antikropp (figur 3B, SUMO1 panel), medan Ubc9 defekt mutationen, C93S, misslyckats med att producera denna signal. Observera att högeffektiva SUMO-ändringen orsakas av Ubc9-fusion leder till ett högre molekylvikt band som ens skulle kunna upptäckas direkt med hjälp av Rb antikroppen och det motsvarar till SUMO signalen (figur 3B, Rb panel). Dessutom orsaka Ubc9 ensam inte någon SUMO konjugation, ytterligare bekräftar de Rb-specifika SUMOylation (figur 3B).
Eftersom SUMO1 konjugeras till lysin 720 av Rb protein11, för att ytterligare analysera de Rb SUMOylation, genereras denna studie en SUMO-brist mutation genom att ersätta denna lysin rest med en arginin (K720R). För att underlätta upptäckt av SUMO-Konjugation av de två övergående uttryckt Rb proteinerna, lades en GFP-SUMO1 konstruktion till förbättra den intracellulära SUMO-signalen. Hans-taggade vildtyp eller mutant Rb var samtidig transfekterade i HEK293 celler tillsammans med GFP-SUMO1, följt av dra ner test och analys av Rb-SUMO1 konjugation kapacitet. Som påpekat, avskaffat K720R mutant helt SUMO-ändring av Rb, ytterligare stärka föreslagna metodens förmåga att upptäcka de Rb SUMOylation (figur 4).
Figur 1 : Validering av cellcykeln synkronisering analysen av flödescytometri. HEK293 celler var odlade och synkroniseras vid G0, tidig G1, G1, S, och G2/M faser av cellcykeln som beskrivs i detta protokoll. Cellcykeln distributioner bestämdes genom fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS). De representera data visar ett exempel på kvantitativ analys av FACS analysen (n = 1). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Rb är SUMOylated på tidiga G1 fas. HEK293 celler synkroniserades i olika faser av cellcykeln som beskrivs i detta protokoll. Cellerna samlades och lyserat i RIPA bufferten kompletteras med 20 mM N-Ethylmaleimide. De ingående kontrollerna var lastade på en 4-20% SDS-PAGE toning gel, överförs och utplånas med anti-SUMO1 och anti Tubulin, som godstrafiklinjer. De återstående cell lysates utsattes sedan för immunoprecipitation med anti-Rb antikroppen vid en spädning på 1: 200. De resulterande eluenter var åtskilda av 4% - 20% SDS-PAGE toning gel och immunoblotted med anti-SUMO1 antikropp och anti-Rb antikropp. Experimentet upprepades två gånger med samma resultat. Denna siffra har modifierats med tillstånd13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Påvisande av SUMO-ändring av Rb-Ubc9 fusionsprotein. (A) Diagram över Ubc9 fusion-riktade SUMOylation (UFDS) konstruktioner av Rb. (B) konstituerande SUMOylation av Rb orsakas av UFDS. HEK293 celler normalnivå transfekterade med hans-taggade UFDS konstruktioner var lyserat i RIPA bufferten med 20 mM N-Ethylmaleimide. Totalen lysate av varje prov var inkuberas med Ni-NTA agaros pärlor att dra ner hans-taggade Rb-Ubc9 fusionsproteiner eller Ubc9 (används som den negativa kontrollen), respektive. De renade proteinerna var åtskilda av 4% - 20% SDS-PAGE toning gel och immunoblotted med anti-SUMO1 och anti hans antikroppar. Hans-Rb: 6XHis taggade Rb-Ubc9 fusionsproteinerna; Hans-Ubc9: 6XHis taggade Ubc9 bara. RB-Ubc9: oförändrad Rb-Ubc9; RB-Ubc9-S: SUMOylated Rb-Ubc9; Hyper-pRb-Ubc9: hyper-fosforyleras Rb-Ubc9. Resultaten visas i figuren är representativa för tre oberoende studier. Denna siffra har modifierats med tillstånd13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . SUMO-brist K720R mutation minskar SUMOylation av Rb. HEK293 celler var övergående Co transfekterade med vildtyp eller mutant Rb-hans konstruktioner tillsammans med GFP-SUMO1. Cellerna samlades och lyserat i RIPA bufferten kompletteras med 20 mM N-Ethylmaleimide. En liten del av lysates analyserades direkt genom Western blot som ingående kontroll. Resten av lysates inkuberades med Ni-NTA agaros pärlor att dra ner hans-taggade Rb proteiner som beskrivs i detta protokoll, och de var immunoblotted med anti-SUMO1 och anti hans antikroppar. Observera att lysin-till-arginin mutationen vid 720 av Rb totAlly avskaffar SUMO ändring av detta protein. Experimentet genomfördes en gång med ett liknande resultat som tidigare rapporterats11. Denna siffra har modifierats med tillstånd13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Lösning | Komponenter | Kommentarer |
| RIPA lyseringsbuffert | 50 mM Tris, pH = 8,0; 150 mM NaCl. 1% NP-40; 1% natriumdeoxikolat; 0,1% SDS | Lägga till proteashämmare cocktail och N-ethylmaleimide omedelbart före användning. |
| Tvättbuffert | 50 mM NaH2PO4 pH = 8,0; 300 mM NaCl. 20 mM Imidazol | Används för dra ner assay endast |
| Eluering buffert | 50 mM NaH2PO4 pH = 8,0; 300 mM NaCl. 250 mM Imidazol | Används för dra ner assay endast |
| 6 x laddar buffert | 0,5 M Tris, pH = 6,8; 30% glycerol; 10% SDS; 5% β-merkaptoetanol; 0,1% bromfenolblått | Förvaras vid-20 ° C |
| 10 x kör buffert | 0,25 M Tris, pH 8,6; 1,9 M glycin; 1% SDS | Att göra 1 x Running Buffer: blanda 100 ml 10 x Running Buffer med 900 mL ddH2O |
| 10 x överföring buffert | 0,25 M Tris, pH 8,3, 1,9 M glycin | Att göra 1 x överföring buffert: blanda 100 mL 10 x överföra buffert med 200 ml metanol och 700 mL ddH2O |
| 10 x TBS buffert | I 1 L ddH2O: 24,08 g Tris pH 7.4. 80 g NaCl | Att göra 1 x TBST buffert: blanda 100 mL 10 x TBS buffert med 900 mL ddH2O och 1 mL Tween-20 |
| Blockerande buffert | 1 x TBST med 5% nonfat torr mjölk | Förbereda buffert omedelbart före användning |
| Antikropp förtunningsbuffert | 1 x TBST med 3% BSA och 0,02% natriumazid | Denna buffert kan lagras vid 4 ° C i minst 6 månad |
Tabell 1: Lösningar och buffertar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta dokument beskriver ett protokoll för att identifiera och analysera den endogena SUMOylation av Rb i mänskliga celler. Eftersom denna metod är särskilt inriktad på endogena Rb proteinet utan någon alternationen av globala SUMO-relaterade signal, är det ett viktigt verktyg för att undersöka Rb-SUMO ändring under helt naturliga fysiologiska förhållanden.
För att uppnå detta mål är det viktigt att komma ihåg att: 1) även om SUMO består av fyra isoformer (SUMO1-4, varje kodas av olika gener) jämfört med ubikvitinering, alla SUMO arter som är mycket mindre riklig; (2) för de flesta SUMO målprotein är endast en liten del av ett visst protein SUMOylated vid steady state, som är resultatet av den ständiga konkurrensen mellan enzymerna som är involverade i SUMO konjugation och deconjugation14,21. och 3) SUMO mål kan genomgå snabba cykler av SUMOylation och deSUMOylation. Till exempel visar nyligen data erhållits av författarna till detta nuvarande papper att Rb-SUMO1 existerar bara för ett kort tidsfönster i den tidiga G1-fasen, vilket överensstämmer med den uppfattningen att SUMOylation är en reversibel, högdynamiska process13 . Dessa fakta gör det utmanande att direkt identifiera den endogena SUMOylation av ett visst protein. Således, för att framgångsrikt identifiera detta, är det viktigt att identifiera de exakta villkoren under vilka denna ändring inträffar. Exempelvis i detta föreslagna protokoll är tidpunkten för cellcykeln synkroniseringen avgörande för detektion av Rb SUMOylation. En optimerad experimentell förfarande är också viktiga för framgångsrik detektion av lågaktivt SUMO-modifierade arter av ett visst protein. Till exempel korrekt ultraljudsbehandling eller passerar genom nålar kunde förhindra bildandet av klibbig och trögflytande komponenter på grund av genomiskt DNA, således korrekt ultraljudsbehandling kan underlätta totala protein utvinning. Dessutom kunde en bra monoklonal antikropp med hög affinitet till målproteinet vara till hjälp för att förbättra kvantiteten och specificitet immunoprecipitation. Sammanfattningsvis är den föreslagna metoden viktigt för att ytterligare utforska de fysiologiska förhållanden under vilka endogena Rb SUMOylated, vilket är förutsättningen för följande överuttryck-baserade funktionella analysen.
För att förstärka SUMO signalen av ett visst protein, är det vanligt att co-overexpress detta protein samt andra SUMO-relaterade proteiner (vanligtvis Ubc9 och SUMO protein) i cellerna. Även en enkla Western blot med en antikropp mot underlaget är det enklaste sättet att hitta högre molekylvikt, SUMOylated form av detta protein, kunde vi inte upptäcka SUMO-Rb signalen med denna metod. Sålunda, detta papper bara fokuserat på en metod att upptäcka SUMO-ändring av utfällda exogena Rb proteinet. Dessutom beskrivs denna metod hur man på konstgjord väg förbättra eller eliminera SUMO-konjugationen av Rb. Som den enda E2-ligase, har Ubc9 visat att direkt överföra SUMO till specifika mål22. Således, genom att smälta till C terminalen av Rb, Ubc9 väsentligt främjar SUMO-ändring av Rb. med denna metod, författarna till denna uppsats har framgångsrikt visat att SUMOylation av Rb tillräckligt främjade egna fosforylering genom att öka dess bindning till CDK213. Dessutom för att studera de funktionella konsekvenserna av förlusten av Rb SUMOylation, genereras författarna en SUMO-brist Rb konstruktion, som tidigare rapporterats11. Med hjälp av den metod som föreslås i detta nuvarande papper, visades det att SUMO-Rb är nödvändigt för normala cellcykelns förlopp och cell spridning13.
Utöver SUMO1 spela SUMO2 och SUMO3 också viktiga roller i protein SUMOylation14,17. SUMO2 och SUMO3 benämns ofta som SUMO2/3 eftersom de är närbesläktade och dela 97% identitet. SUMO1 delar en 50% likhet med SUMO2/3. Det är allmänt accepterat att SUMO1 är ansvarig för normal cell fysiologiska funktioner och underhåll, medan SUMO-2/3 är huvudsakligen involverade i cell stress Svaren15,17,23, 24. med tanke på att Rb kan också vara SUMOylated av SUMO2/3 med okänd funktion12, den metod som föreslås i denna studie är fortfarande lämplig för detektering och analys av denna ändring av Rb. Förutom Rb, metoderna som beskrivs här kan i stor utsträckning till att upptäcka och funktionell analys av SUMOylation av en mängd målproteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av bidrag från vetenskap och teknik kommissionen av Shanghai (Grant nr 14411961800) och National Natural Science Foundation Kina (Grant nr 81300805).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Triton X-100 | AMRESCO | 694 | |
| RNase A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E3876 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | AMRESCO | M107 | |
| Nonidet P-40 Substitute (NP-40) | AMRESCO | M158 | |
| protease inhibitor | Roche | 5892970001 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Rb antibody | Cell Signaling Technology | #9309 | |
| Protein A/G-Sepharose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| Lipofectamine-2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads | Qiagen | 30230 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| 4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel | BIO-RAD | 4561096 | |
| Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Tween-20 | AMRESCO | M147 | |
| Tubulin antibody | Abmart | M30109 | |
| SUMO1 antibody | Thermo Fisher Scientific | 33-2044 | |
| GFP antibody | Abmart | M20004 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| enhanced chemiluminescence (ECL) Kit | Thermo Fisher Scientific | 32106 |
References
- Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
- Massague, J. G1 cell-cycle control and cancer. Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).
- Weinberg, R. A. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 81 (3), 323-330 (1995).
- Giacinti, C., Giordano, A. RB and cell cycle progression. Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).
- Burkhart, D. L., Sage, J. Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene. Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).
- Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion. Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).
- Hilgendorf, K. I., et al. The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria. Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).
- Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct. Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).
- Macdonald, J. I., Dick, F. A. Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function. Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).
- Ezhevsky, S. A., et al. Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).
- Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor. Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).
- Li, T., et al. Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways. J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).
- Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase. Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).
- Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. Concepts in sumoylation: a decade on. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).
- Flotho, A., Melchior, F. Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease. Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).
- Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
- Wilkinson, K. A., Henley, J. M. Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation. Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).
- Sharma, P., Kuehn, M. R. SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization. Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).
- Jakobs, A., et al. Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation. Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Saitoh, H., Hinchey, J. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3. J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).
- Ayaydin, F., Dasso, M. Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues. Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).
