Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא לפתח התייחסות חלבונים מתבדרת בקבוצה חסר קוהרנטי לקריטריונים במינוח והסיווג. הפניה זו יקל על ניתוח ודיון של הקבוצה בכללותה, יכול לשמש שמות הוקמה.
Abstract
חלבונים הקשורים נחקרו במעבדות שונות באמצעות אורגניזמים משתנות מעצמן מערכת אחידה של נומנקלטורה, סיווג, ולכן קשה לדבר על הקבוצה בכללותה, למקום חדש רצפים לתוך הקשר המתאים. פיתוח הפניה לפי עדיפות רצף חשוב תכונות הקשורות למבנה ו/או פעילות יכול לשמש בנוסף שמות הוקמה כדי להוסיף קצת קוהרנטיות קבוצה מגוונת של חלבונים. מאמר זה משתמש מיוצב ציסטאין סליל אלפא (CS-αβ) superfamily כדוגמה להראות איך הפניה המופקים בתכנת יכולים להבהיר את קשרי הגומלין בין החלבונים הקיימים ב- superfamily, וכן להקל על התוספת של חדש רצפים. הוא גם מראה איך ההפניה יכול לעזור כדי לחדד היישורים רצף שנוצר בתוכנה נפוץ, אשר משפיעה על תוקפה של ניתוח פילוגנטי. השימוש של הפניה צפוי להיות מועיל ביותר עבור קבוצות חלבון הכוללות רצפים מאוד מתפצלת מתוך קשת רחבה של taxa, עם תכונות לא מספקת בשבי על ידי ניתוחים מולקולריים.
Introduction
השם של חלבון לשקף היא המאפיינים ואת היחסים חלבונים אחרים. למרבה הצער, שמות מוקצים בדרך כלל בזמנו של גילוי, וכמו המחקר ממשיך, ההבנה של הקשר גדול עשוי להשתנות. זה יכול להוביל שמות מרובים אם חלבון זוהתה באופן עצמאי על ידי מעבדה אחד או יותר, שינויי המינוח או בכל המאפיינים נחשב סופית בעת הקצאת השם, שם כבר לא מספיק המבדילים את החלבון מאחרים.
הגעה defensins ספק דוגמה טובה של ניוון נומנקלטורה, סיווג. Defensins הגעה הראשונה דווחו מפני חרקים, השם "חרק defensin" הוצע בהתאם הנתפס הומולוגיה ל- defensins בתרבית של1,2. המונח defensin משמש עדיין, למרות שזה עכשיו לנקות את defensins הגעה, יונקים אל תשתף3,אב קדמון משותף4. תלוי בזן, חסרי חוליות "defensin" ייתכן cysteines 6-8 (שיוצרים חוב דיסולפידי שלושה או ארבעה) ועוד מגוון של פעילות מיקרוביאלית. כדי לסבך את המצב, חלבונים עם מאפיינים זהים כפי defensins לא תמיד מכונים "defensins," כמו cremycins שזוהה לאחרונה Caenorhabditis remanei5. בנוסף, הגעה defensins גדול הם נוטים יותר להיות קשור אבולוציונית חוליות β-defensins מאשר ל- defensins הגעה אחרים6. למרות זאת, החוקרים לפעמים להסתמך על השם "defensin" בעת קביעת רצפי אשר צריכים להיכלל ניתוחים.
מחקרים מבניים נחשף הדמיון בין חרקים defensins עקרב רעלים7, הקיפול CS-αβ הוקמה לאחר מכן מאפיין מבנית של חרקים defensins8. הקיפול מגדיר את superfamily (CS-αβ) של הרעלן דמוי עקרב ב מבניים סיווג של חלבונים (SCOP) מסד הנתונים9, הכולל חמש המשפחות: defensins חרקים, קצר-שרשרת העקרב רעלים, ארוכי שרשרת העקרב רעלים, MGD-1 (מ רכיכה), צמח defensins. Superfamily הזה הוא נרדף עם חבר העמים תיאר לאחרונה-defensins4 ו Superfamily 3.30.30.1010,מסד נתונים תלת-ממדיים הצנתור/ג'ין11. מחקרים מתוך מגוון של הגעה taxa, צמחים, פטריות הצג כי השמות של חלבונים המכילים הקיפול שאינן בבירור קשורות לציסטאין מספר או דפוס התקשרות, פעילות מיקרוביאלית או היסטוריה אבולוציונית12.
חוסר העקביות ואת קריטריונים ברורים לעשות את זה מאתגר שם ולסווג זיהו לאחרונה רצפי superfamily הזה. מכשול גדול השוואת חלבונים ב superfamily הזה הוא cysteines ממוספרים ביחס לכל בודדים רצף (ציסטאין הראשון ברצף כל הוא C1), בלי שום דרך להסביר התפקיד המבני. משמעות הדבר היא כי ניתן להשוות רק רצפים עם מספר זהה של cysteines. יש קטן שימור רצף שונה cysteines ויוצרים, מקפלים CS-αβ שהופך היישורים וניתוחים פילוגנטי קשה. על ידי פיתוח מערכת מספור קובע סדר עדיפויות של תכונות מבניות, רצפים superfamily יכול להיות בקלות רבה יותר בהשוואה, מיושר. תכונות שנשמרת, כמו גם אלה הגדרת קבוצות, ניתן לאבחן במהירות, רצפים החדש ניתן להציב יותר בקלות לתוך הקשר המתאים.
מאמר זה משתמש בתכנת (למשל, Excel) ליצור הפניה מספור מערכת superfamily CS-αβ. זה מראה איך זה מבהיר השוואות בין רצפים והחלתו רצפים CS-αβ החדש מזוהה של tardigrades. כדוגמא את superfamily CS-αβ, הפרוטוקול נכתב כדי לספק הדרכה בעת שימוש רצפים של עניין; עם זאת, זה לא נועד לפרט הזה superfamily או רצפי ציסטאין-עשיר. שיטה זו צפוי להיות שימושית במיוחד עבור קבוצות של חלבונים אשר נחקרו באופן עצמאי ב- taxa מתפצלת ו/או יש רצף הומולוגיה הכולל קטן, עם מאפיינים בדידה זה לא ניתן בקלות לזהות תוכנות אנליזה מולקולרית. שיטה זו דורשת כמה החלטות קודמת לגבי תכונות חשובות, אז זה יהיה של השירות מוגבל אם אין תכונות חשובות זוהו. המטרה העיקרית היא להראות כיצד ניתן להשיג פריט חזותי פשוט הגומלין רצף. לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להודיע עימוד רצפים וניתוח, אבל אם יישור וניתוח המטרות, שיטת ברקוד יהיה חלופה בעלת קיבולת נוספת עבור אוטומציה13. השיטה הנוכחית מציגה את התכונות של כל פפטיד בצורה לינארית, אז זה לא יהיה שימושי עבור הפריט החזותי ישירה של מבנה תלת-ממדי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. לקבוע את הגדרת התכונות של קבוצת חלבונים עניין
- ייעוץ פרסומים קודמים כדי לקבוע אם יש קונצנזוס לגבי התכונות הדרושות להיחשב חלק מהקבוצה. שימו לב כל חוסר עקביות או הבדלים דעת בין קבוצות מחקר, וכוללים מאפיינים שיכול לשרת כדי להבדיל עוד תת קבוצה אחת.
- אם ספרות הקודם אינו מטפל הגדרת מאפיינים, להשתמש רצפי הנחשבים נציג של קבוצת כנקודת התחלה כדי לזהות תכונות שנשמרת.
2. לאסוף את רצפי הרלוונטיים
- אם הדעת נכתב כי כוללים ניתוחים של רצפי המייצגות את הקבוצה, כוללים רצפי אלה ב- raw dataset. לאחזר רצפי מספרים ההצטרפות המוזכרים בספרות ולשמור ברצף רגיל בתוכנית לעריכת (למשל, EditSeq חבילת Lasergene או אחד מני רבים זמינים עבור חינם באינטרנט).
- אם המדובר הקבוצה הוגדרה באחד המאגרים מבניים, כוללים את רצפי שמסד הנתונים רשימות להיות חלק הקבוצה. אחזר רצפים באמצעות העלייה שהמספרים שסופקו במסד הנתונים ולשמור בעריכת רצף רגיל תכנית, לעיל-
הערה: לדוגמה, רצפי לקטגוריות את superfamily CS-αβ (עקרב הרעלן דמוי) במסד הנתונים SCOP ניתן למצוא כאן: http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/data/scop.b.h.c.h.html. - לבצע בסיסי מקומי יישור כלי חיפוש (פיצוץ) 14 חיפושים ציבורי מקוון, מאגרי מידע זמין דרך המרכז הלאומי עבור ביוטכנולוגיה מידע (NCBI) למצוא רצפי אשר ייתכן שלא נכללו בספרות או מבניים מסדי נתונים. ביותר להשלים את התוצאות, להשתמש בשני החלבון הפיצוץ (blastp), תרגם הפיצוץ עם חלבון תוכניות שאילתה (tblastn); . אלו זמינות: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
- שימוש רצפים ידועים להיות חלק מקבוצת עניין כמו רצפים של השאילתה. העתק והדבק את הרצף בתיבת החיפוש בחלק העליון, או לספק GenBank ההצטרפות מספר או במערכת העיכול מזהה, אם זמין.
- בחר את מסד הנתונים מתוך התפריט הנפתח. לבחור רצפי חלבונים לא יתיר (ע נ) blastp והביע את רצף תגים עבור tblastn.
- חיפוש של תוצאות taxa ספציפיים בתוך האורגניזם הגדרת על-ידי הקלדת את האורגניזם או טקסון שם ו בחירה מתוך הרשימה המופיעה בעת הקלדת. כדי להוסיף אורגניזמים נוספים או taxa כדי לא לכלול, לחץ " + " יופיעו לחצן של שדה אחר. לא לכלול כל taxa לא רצויים בתיבת אורגניזם על-ידי הקלדת את השם או אורגניזם טקסון, בחירה מתוך הרשימה המופיעה בעת הקלדת ובדיקת " תכלול " בתיבה בשמאל.
- לגשת פרמטרים נוספים על ידי לחיצה על " פרמטרי האלגוריתם " ליד החלק התחתון של הדף. נשאיר את ברירת המחדל אלא אם כן יש תירוץ עבור שינוי פרמטר.
- לחץ " הפיצוץ " לחצן הפעל הניתוח; זה עלול לקחת קצת זמן התוצאות יופיעו. באופן כללי, לאחזר כניסות עם מצפה ערך (או e-ערך) של " -05 " או יותר ולשמור ברצף רגיל בתוכנית לעריכת.
- אם כל הלהיטים מעל לגודל הסף הזה, הפעל מחדש את החיפוש עם מספר רב יותר של רצפי היעד (במקטע פרמטרים אלגוריתם) כדי להשיג כל רצפי רלוונטי.
- במידת הצורך, לקצץ את רצפי כדי לא לכלול מידע לא רלוונטי (למשל, הקיפול CS-αβ חל רק פפטיד בוגר). לזהות את האות פפטידים pro-פפטידים להסרת באמצעות אביזר 15 (זמין באינטרנט), או SignalP עבור מתוחכמים יותר אות פפטיד חיזוי 16 (זמין באינטרנט).
3. ליצור הפניה ב גיליון אלקטרוני המבוסס על חשוב תכונות כי זוהו
- לזהות את מאפייני המכונן של קבוצת עניין. לדוגמה, השתמש הקיפול CS-αβ שקבע סופית מבנה הפתרון של חרק defensin A Phormia terraenovae ( איור 1) 8.
- הקיפול כוללת מוטיב קטן יותר הנקרא סליל מיוצב ציסטאין (תגובת CSH) 17; לזהות את מוטיב זה על ידי CXXXC (כאשר X הוא כל חומצה אמינית) הזרם של CXC בצורת שתי איגרות חוב דיסולפידי ( איור 1 , מוצק ורוד קווים).
הערה: כדי להשלים את מוטיב CS-αβ, קשר דיסולפידי השלישית נוצר מן cysteines נוספים הממוקמים לפני חצי אחד של המוטיב תגובת CSH ( איור 1, מנוקד קווים ורודים).
- הקיפול כוללת מוטיב קטן יותר הנקרא סליל מיוצב ציסטאין (תגובת CSH) 17; לזהות את מוטיב זה על ידי CXXXC (כאשר X הוא כל חומצה אמינית) הזרם של CXC בצורת שתי איגרות חוב דיסולפידי ( איור 1 , מוצק ורוד קווים).
- להיכנס אלה הגדרת תכונות לתוך גיליון אלקטרוני. ראה איור 2-
- שימוש עמודות עבור התכונות שנשמרת ו כדי לייצג את החללים בין תכונות אלה. שמור את העמודות רחב מספיק כדי להתאים מספרים ולהבטיח שיש להם רוחב עקבי. הגדר את רוחב באמצעות " עיצוב | רוחב עמודה " פונקציה ( איור 2, חץ ורוד).
- השתמש בשורות עבור רצף שמות.
- כאשר רצף יש התכונה, מלא את התיבה באמצעות הפונקציה מילוי ( איור 2, כיכר ורוד). עבור המרווח בין תכונות, הזן את מספר חומצות אמינו בתיבת בין ולהשאיר אותה ללא מילוי. לדוגמה, באמצעות החרק defensin רצף נותן הפניה הכוללת שש cysteines, עם spacings מוגדר בין C2 C3 ובין C5 C6.
- הוסף נציג רצפים שהוקמו בעבר חברי הקבוצה בהתבסס על מסדי נתונים מבניים ספרות.
הערה: לדוגמה, ספרות הקודם לבין מסד הנתונים SCOP לזהות מספר קבוצות להכללה: defensins חרקים, קצר-שרשרת העקרב רעלים, רעלים ארוכי שרשרת העקרב, MGD-1, צמח defensins, תולעים נימיות ABFs, drosomycins מן דרוזופילה, ו macins. הספרות מזהה רצף חיידקי עם cysteines רק 4 עשוי לייצג אב הטיפוס הזה superfamily 18. הוספת רצפי אלה מגדילה את מספר cysteines של ההפניה מ-6 עד 10 אך שומר את היישור של המאפיינים המבניים החשובים ( איור 3).- כדי להוסיף תכונה זו נוטים להגדיר קבוצת משנה של רצפים (לדוגמה, נוספת ציסטאין), השתמש " הוספה " פונקציה ( איור 3, חץ ורוד).
- אם קיימות תכונות חסרות רצף נתון, השאר את התיבה ללא מילוי, ולשלב אותו עם תיבות המייצגות חומצות אמינו להתערב. במידת הצורך, למזג את התאים באמצעות התכונה מזג ומרכז ( איור 3, תיבת ורוד).
- המשך הוספת רצפים לקבוצות כדי לקבל תמונה טובה יותר של וריאציית בכל קבוצה של superfamily גדול יותר. לסכם את מאפייני הקבוצה כדי להקל על השוואות ( איור 4).
- כאשר מספר חומצות אמינו בין התכונות העיקריות משתנה, להשתמש במקף לציון טווח, כגון 6-12 (חומצות אמינו 6-12) וקו נטוי כדי לציין גם / או, כגון 7/10 (7 או 10 החומצות).
- לבחור דרך להוסיף ביאור תכונות של רצפי עשוי להיות רלוונטי, אך אינן מתרחשות לעיתים קרובות מספיק כדי לכלול בהפניה. לדוגמה, מאחר cysteines חשובים superfamily הזה, תווית cysteines נוספים ( איור 4, תיבות ורוד).
- להוסיף newlרצפים המזוהים y בגיליון הנתונים באמצעות את רצפי הקים כמדריך. לדוגמה, הוספת רצפים tardigrades (צהוב) מציג רצפי tardigrade נחלקים למספר קבוצות שונות של superfamily ( איור 5 מציג סיכומים במקום שורה לכל רצף למטרות רווח).
- מראים השתנות בתוך קבוצת טקסונומי על ידי ארגון מחדש את השורות ( איור 6).
4. להשתמש את ההפניה כדי לחדד היישורים חומצת אמינו
הערה: ישנן תוכניות רבות יכול לשמש עבור היישורים רצף מרובים, אבל להפגנה ישתמש מולקולרית ניתוח גנטיקה אבולוציונית (MEGA6) 19. כי הוא זמין להורדה בחינם.
- להוריד ולהתקין את התוכנה-
- להתחיל עם זווית חדשה במגה על-ידי בחירה " עריכה/בנייה יישור " תחת הכרטיסיה יישור, בחר " ליצור זווית חדשה של " בתיבת מופיע ולחץ על " אישור. " מכן בחר " חלבון. "
- בחר " הכנס רצף מקובץ " ב " עריכה " תפריט כדי לייבא את רצפי.
הערה: רצפים תצטרך להיות בתבנית FASTA לייבוא לתוך מגה. צבעי רקע המשקפים סוגי חומצות אמיניות שונות משמשות כברירת מחדל, אך אפשרות זו ניתן לבטל תחת " תצוגה " תפריט. - לאחר כל רצפי מוזנים, לחץ על הסמל כיפוף היד ולאחר מכן " חלבון יישר " כדי ליישר את רצפי באמצעות אלגוריתם השריר 20.
הערה: ClustalW הינו גם זמין.- אם הודעה המציינת כי שום דבר לא נשאר ער אבא שנבחר ומבקש לבחור את כל, לחץ על " אישור. "
- הערה: זה פותח חלון המאפשר אחד לשנות פרמטרים מסוימים, אבל הם רק כשידוע אין סיבה לעשות זאת. ניתוח זה משתמש תת-קבוצה של הרצף נותחו גם עם נייר הקודם 12.
- סימון היישור מבוסס על התכונות החשובות; שימו לב: הבר העליון מעל רצפי יציג עמודות כלשהן איפה החומצה אמינית לחלוטין והתפאורה (*). לראות איור 7. נראה כי היישור הראשוני מראה רק שלושה cysteines שנשמרת ארבע ( איור 7, תיבות ורוד); הבטתי למטה את העמודה רצף AlCRP הוא בבירור לא מיושרים ( איור 7, חץ ורוד).
- להיפטר פער גדול בין ה-אני את c שנשמרת, לסמן את המקפים ולחץ " מחק " מפתח. מסמן כל חומצות אמינו, או שהם יימחקו גם כן.
- כדי להעביר חומצות אמינו מימין, להאיר, הקש על מקש רווח
- הערה כי AlCRP עכשיו יש את cysteines מבנית מיושר, כי C האחרון של מוטיב CXXXC כולו במהלך היישור ( איור 8). להתאים את היישור לפי הצורך כדי לקבוע עדיפויות של התכונות החשובות ביותר של הרצף.
5. להשוות את קבוצות המזוהים באמצעות ההפניה עם תוצאות מניתוחי פילוגנטי
- מן במערכים ראשוני, לקבוע אילו רצפים צריך להיות כלול בניתוח פילוגנטי; עבור מספר קטן של רצפים, שלב זה עלול שלא יהיה צורך.
- לשמור קובץ יישור הכולל כל רצפי, אך עבור ניתוח פילוגנטי, להסיר רצפים יתירים ( איור 9, ורוד בתיבות הצג זוגות של רצפי יתירים).
- אם ערכת הנתונים כוללת מספר רב של רצפים, להפעיל את ערך ניתוח ראשוני ויוצרים בחירת נציגי קבוצות זה תמיד קלייד.
- לקבוע המודל הטוב ביותר של החלפת חומצת אמינו.
- לייצא את היישור בתבנית מגה (תחת הכרטיסיה נתונים).
- עבור לתפריט מודלים ובחר " למצוא את הטוב ביותר DNA/חלבון במודל. " בחר את קובץ ה. הרגע הצלת ופתיחתו; פעולה זו תפתח חלון בעל פרמטרים מסוימים שניתן לשנות.
- השתמש הפרמטרים של ברירת המחדל אלא אם כן יש סיבה לשנות אותם. לחץ על " לחשב " להתחיל את הניתוח.
- להפעיל ניתוח נראות מקסימלית (מ"ל) במגה-
- בחר " לבנות/מבחן הסבירות המרבי עץ " ' מתפריט ' טקסונומי.
- לבחור הדגם נחוש בדעתו להיות בכושר הטוב ביותר עבור הנתונים מ שלב 5.2 (הפלט ייתן המודל החלפה, כמו גם את הטוב ביותר " המחירים בין אתרי " פרמטר).
- 1,000 לבחור bootstrap משכפל כדי להשיג את האמצעים של תמיכה עבור העץ.
- לחץ " לחשב " כדי להפעיל את הניתוח; מגה יש " Explorer עץ " להמחיש את העץ.
- להפעיל ניתוח בייסיאני תוכנת קוד פתוח MrBayes 21.
הערה: מדריך MrBayes זמין גם מאתר זה. זה נועד לספק שלבים בסיסיים ואינו מדריך מקיף להתנהלות ניתוח פילוגנטי בייסיאנית.- לייצא את היישור מגה בתבנית PAUP (Nexus) באותה תיקיה שבה התוכנית MrBayes-
- MrBayes פתוח וסוג " exe שם הקובץ " (למשל, " exe Alignment.nex ").
- לציין את הפרמטרים מודל וניתוח. לבחור את הדגם או שצוין בשלב 5.2 או לבחור " מעורב " הגדרת לנסות מודלים שונים ולדווח את התדירות של המודל על העצים עם ההסתברויות האחורי הטוב ביותר (prset aamodelpr = מעורב). סוג " showmodel " לדווח את ההגדרות הנוכחיות של מודל, " לעזור mcmc ב " כדי להציג את הגדרות הפרמטר הנוכחי, עם הסבר קצר על כל אחד.
- להגדיר את מספר הדורות באמצעות " mcmcp ngen = " הפקודה (1 מיליון הוא אופייני).
- סוג " mcmc ב " כדי להתחיל את הניתוח.
- בעת השלמת מספר דורות, התוכנית תבקש להוסיף דורות רבים יותר. אם סטיית התקן הממוצע של פיצול התדרים הוא פחות מ- 0.1, הקלד. לא. אם זה מעל 0.1, הניתוח צריך להיות מותר להמשיך או פרמטרים מסוימים צריך להיות שונה (עיין במדריך).
- השתמש " sumt " פקודה כדי ליצור את קבצי עץ.
- לאחר הניתוח הושלם נוצר קונצנזוס עץ, וניתן להציגו העץ FigTree (זמין באינטרנט).
- להשוות את העצים כדי לראות אם השיטות מפיקים תוצאות עקביות.
הערה: כמה רצפים אינם מספקים מידע רב: העצים לא יכול להיות פתרון טוב, הענפים שיש תמיכה מינימלית ( איור 10). - להשוות בין העצים לקבוצות מזוהה באמצעות ההפניה כדי לראות אם אלה קבוצות תמיכה הניתוחים פילוגנטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
קבוצות של רצפי superfamily CS-αβ דיווחו בספרות מוצגים באיור4. זיווגים ציסטאין סמך את המספור עבור כל רצף מציע חמש קבוצות בסיסיות (טבלה 1, העמודה האמצעית). קבוצה 1 יש שישה cysteines זה דיסולפידי שלוש איגרות חוב, כולל רצפים מפני חרקים, זוהי חברת, רכיכות, נמטודות, ופטריות. קבוצות 2, 3 ו- 4 יש 8 cysteines בצורת ארבע איגרות חוב דיסולפידי. קבוצה 2 כולל חרקים, עכביש, צמח הרצפים; קבוצה 3 כולל העכבישים, רכיכה נמטודות הרצפים; קבוצה 4 כולל רצפים cnidarians, annelids, רכיכות, פטריות. קבוצה 5 כוללת את macins 10 ציסטאין. כמה רצפים די שלא התאימה את הדפוסים הללו, אבל היו בדרך כלל קרוב יותר לקבוצה אחת מהאחרים.
קבוצות 1 ו- 2 נראה לחלוק שתי איגרות חוב: C2-C5 ו- C3-C6; עם זאת, מתחיל את המספור של כל הרצף ציסטאין הראשון שלה עם שאינו מכיר את ההקשר המבני של איגרות חוב. C2-C5 קבוצה 1 רצף אחד משני אג ח ב מוטיב תגובת CSH, בעוד C2-C5 ברצפים קבוצה 2 צורות הקשר הסופי הדרוש כדי לייצב את הקיפול CS-αβ טפסים. הקשר הומולוגי ל 1 קבוצה C2-C5 היא Group2 C3-C6, אשר אינו ברור של המספור. זה גם לא ברור זה קבוצה 3, הקשר C2-C6 ממלא את התפקיד המבני אותו.
באמצעות רצף של הספרות שנוצר הפניה עם סך של cysteines 10. המוטיב תגובת CSH נוצר חוב C3-C8 ו C4-C9, עם השלמת הקיפול CS-αβ C2-C6. מספור מחדש את זוגות ציסטאין בהתבסס על המספרים הפניה מבהיר את האיגרות נוכח כל רצף (טבלה 1, עמודה ימנית). עכשיו ברור שיש כל רצפי C2 C6, C3-C8 ו C4-C9, המשקף העדר מבניים המגדיר את superfamily. השימוש של הפניה מאפשר השוואה קלה בין רצפים בעלי לא עקביות במינוח וקריטריונים סיווג רב-משמעי. זה גם יכול לעזור לזהות מאפיינים המגדירים את קבוצת משנה של רצפים. לדוגמה, הקשר C1-C7 עשוי להבדיל macins של שאר בני superfamily, שהופך אותו מתאים כשידור רצפי עם הקשר הזה "macins" במקום "defensins" (טבלה 1 , איור 4).
חיפושים במאגרי מידע מקוונים ציבוריים חשף רצפים 16 מ tardigrades שיש בבירור את CS-αβ לקפל, שמונה כל מ Hypsibius dujardini , Milnesium tardigradum. 4 של הרצף החדש בעלי cysteines 6, 9 יש שמונה, אחד יש תשע, ויש שניים עשר. זה נותן מעט מאוד מידע, אבל על ידי יישור את רצפי להפניה, מתברר כי רצפים tardigrade עם מספר זהה של cysteines לא תמיד יש את cysteines מבנית-חשוב באותו מקום בתוך הרצף ( איור 5 , איור 6). היישור עם ההפניה מאפשרת גם היסק מליטה דפוסים (טבלה 2, להסיק דפוסי התקשרות המוצג בסוגריים). חלק רצפי tardigrade בבירור להתאים תבניות 1-4. אחרים דומים ביותר את האב הקדמון חיידקי המוצע, עקרב Cl-הרעלן או משפחה של פפטידים דמויי defensin פטרייתי. תבנית 2 ייתכן לשתי תת-קבוצות, אחד מיוצג על ידי עקרב Na + רעלים, drosomycin, ואת צמח defensins, והשני על ידי עקרב Cl-רעלים. עבודה נוספת לחקור את הפונקציה של החלבונים tardigrade נדרשת כדי לקבוע אם יש להתייחס רעלים מאשר defensins.
ניתוח פילוגנטי משמשים לעתים קרובות כדי ללמוד איך ייתכן התפתחה קבוצה של חלבונים. רצפי superfamily CS-αβ הן בדרך כלל קצרות מאוד מתפצלת; העצים וכתוצאה מכך לעתים נפתרות לקוי ומציעים תובנה קטנה. ML והן בייסיאניות עצי המשנה של רצפי מנותח כאן נפתרו בצורה גרועה, עם תמיכה נמוכה עבור רבים clades (איור 10, הקבצים המשלימים 1 - 4). זה מנהג נפוץ להראות רק האתחול רמות מעל 70 (או הסתברויות אחורי מעל 0.7), אך איור 10 משמרת כל המספרים כדי להדגים את רמות נמוכות באופן כללי של תמיכה. חמש קבוצות נתמכו מעל 70/0.7, לפחות באחד העצים שני: (א) 6 ג ו רעל עקרב של 8 ג; (ב) macins; שנתות (ג) ו- defensins עקרב; (ד) צמח defensins; (ה) 6 ג defensins מפני חרקים, זוהי חברת וכן רכיכות. בעץ ML, קלייד e כוללת גם של הרעלן 8C ו של 8 ג tardigrade defensin, אבל התמיכה היתה נמוכה מאוד (איור 10A). באופן כללי, אלה משקפים את הקטגוריות מזוהה באמצעות הפניה ציסטאין המספור אך גם מראים כי רצפים במספרים ציסטאין שונים בתוך קבוצה גדולה taxonomical עשויים להיות קשורים באופן הדוק יותר מאשר רצפים עם דפוס זהה מ קבוצות שונות. בזמן רק מספר קטן של רצפי השתמשו במחקר זה, ניתוח גדול יותר של רצפי 250 לא ביטלה את חוסר רזולוציה (הקבצים המשלימים 5 - 8)12. היישור הפניה לגיליון אלקטרוני עשוי להציע יותר קל ויזואליזציה של קווי דמיון עם רלוונטיות מבנית או תפקודית בהשוואה עצים פילוגנטי.
איור 1: הגדרת רצף ותכונות מבנית של Superfamily CS-αβ. חומצות אמינו במבנה התלת-ממדי הם צבע מקודד: לולאה (כחול), סליל אלפא (ירוק), גליונות בטא (זהב), ואגרות דיסולפידי (ורוד). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: ראשוני שש-ציסטאין הפניה בהתבסס על הרצף של חרקים Defensin. עמודות מציינים את cysteines שנשמרת (C1-C6), על המוטיב תגובת CSH, המספר והתפאורה אמינו חומצות בין cysteines. הקופסאות מלאות עולה כי יש הרצף ציסטאין נתון את המספרים מציינים חומצות אמינו בין cysteines. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: מעודן 10-ציסטאין הפניה בהתבסס על רצפים נציג מקבוצות של Superfamily CS-αβ. העמודות מציינים cysteines שנשמרת וחומצות אמינו ביניהם. Cysteines תורם את מוטיב תגובת CSH (C3, C4, C8 ו C9) וכדי הקיפול CS-αβ (C2 ו- C6) מסומנות. רצפים ומסומנות בצבעים לפי קבוצה בטקסונומיה: Arachnida (אור כתום), חיידקים (שחור), צורבים (אפור), בעלי שש רגליים (כתום), רכיכות (כחול), Nematoda (סגול) ו צמחים (ירוק). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : סיכום של CS-αβ Superfamily רצפים מיושר עם הפניה לפי תכונות קבוצה. העמודות מציינים cysteines שנשמרת וחומצות אמינו ביניהם. Cysteines תורם את מוטיב תגובת CSH (C3, C4, C8 ו C9) וכדי הקיפול CS-αβ (C2 ו- C6) מסומנות. רצפים ומסומנות בצבעים לפי קבוצה בטקסונומיה: Annelida (אדום כהה), Arachnida (אור כתום), חיידקים (שחור), צורבים (אפור), פטריות (ירוק בהיר), בעלי שש רגליים (כתום), רכיכות (כחול), Nematoda (סגול), ו צמחים (ירוק). מספרים המופרדים באמצעות מקף מצביעים על מגוון רחב של חומצות אמינו להתערב; מספרים המופרדים בלוכסן מייצגים גם / או. "C" מציין של ציסטאין נוסף זה אינו מתרחש בתדירות מספיק כדי להצדיק תוספת להפניה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : תוספת של רצפים Tardigrade CS-αβ ליישור Superfamily עם הפניה לפי תכונות קבוצה. העמודות מציינים cysteines שנשמרת וחומצות אמינו ביניהם. Cysteines תורם את מוטיב תגובת CSH (C3, C4, C8 ו C9) וכדי הקיפול CS-αβ (C2 ו- C6) מסומנות. רצפים ומסומנות בצבעים לפי קבוצה בטקסונומיה: Annelida (אדום כהה), Arachnida (אור כתום), חיידקים (שחור), צורבים (אפור), פטריות (ירוק בהיר), בעלי שש רגליים (כתום), רכיכות (כחול), Nematoda (סגול), צמחים (ירוק) ו Tardigrada (צהוב). מספרים המופרדים באמצעות מקף מצביעים על מגוון רחב של חומצות אמינו להתערב; מספרים המופרדים בלוכסן מייצגים גם / או. "C" מציין של ציסטאין נוסף זה אינו מתרחש בתדירות מספיק כדי להצדיק תוספת להפניה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: תוספת של רצפים Tardigrade CS-αβ ליישור Superfamily עם הפניה על ידי קבוצת בטקסונומיה. העמודות מציינים cysteines שנשמרת וחומצות אמינו ביניהם. Cysteines תורם את מוטיב תגובת CSH (C3, C4, C8 ו C9) וכדי הקיפול CS-αβ (C2 ו- C6) מסומנות. רצפים ומסומנות בצבעים לפי קבוצה בטקסונומיה: Annelida (אדום כהה), Arachnida (אור כתום), חיידקים (שחור), צורבים (אפור), פטריות (ירוק בהיר), בעלי שש רגליים (כתום), רכיכות (כחול), Nematoda (סגול), צמחים (ירוק) ו Tardigrada (צהוב). מספרים המופרדים באמצעות מקף מצביעים על מגוון רחב של חומצות אמינו להתערב; מספרים המופרדים בלוכסן מייצגים גם / או. "C" מציין של ציסטאין נוסף זה אינו מתרחש בתדירות מספיק כדי להצדיק תוספת להפניה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: רצף misaligned באמצעות כלים אוטומטיים יישור. חומצות אמינו והתפאורה רצפים כל מסומנות באמצעות * בשורה מעל הסדרה הראשונה (המתוארים בתיבות ורוד). AlCRP הוא לא מיושרים. הפער צריך להוריד כדי ליישר כהלכה את C (חץ ורוד). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8: עידון ידנית של היישור שומר על התכונות החשובות מבחינה מבנית של הרצף. AlCRP עכשיו מיושרת כהלכה (חץ ורוד), ואת המוטיב CXXXC מלא כולו על הרצף (תיבות ורוד). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 9 : יתיר רצפי ישור. אם ישנם זוגות של רצפי כמעט זהה (תיבות ורוד), ניתן להסיר אחת, שכן אלה צפויה תמיד אשכול ביחד ב ולתרום מעט הטופולוגיה הכללית של העץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 10 : השוואה של עצים שנוצר מניתוחי פילוגנטי. (א) מקסימום הסבירות ניתוח מגה, עם 1,000 האתחול ושכפול באמצעות את לכשכש + G + אני מדגמן. (B) ניתוח בייסיאני עם דורות 1,000,000 באמצעות הגדרת מודל מעורב. Clades נתמך ב- 70/0.7 מוצגים קווים מלאים ורוד; קווים מקווקווים ורוד להראות clades נתמכים at 70/0.7 בעץ אחר. (a 6 ג) ורעל עקרב של 8 ג; (ב) macins; שנתות (ג) ו- defensins עקרב; (ד) צמח defensins; (ה) 6 ג defensins מפני חרקים, זוהי חברת וכן רכיכות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
טבלה 1: קבוצות בתוך Superfamily CS-αβ המבוססים על דפוסי בשיוך ציסטאין. לחמישה דפוסים בסיסיים של היווצרות בונד מוצגים באמצעות מספרים פנימיים (העמודה האמצעית) או מספרי האסמכתא (בעמודה הימנית). עקרב Cl - רעלים, ASABF 6Cys-אלפא, קבוצה של פפטידים פטרייתיים ממוקמים עם התבנית m הזהost תתאם מאד. ציסטאין אינו כלול בתיבה ההפניה שציין של עילי של cysteines לפני/אחרי (למשל, C3/4 הוא בין C3 ו- C4).
בטבלה 2: תוספת של CS Tardigrade-αβ רצף לקבוצות דפוס בשיוך ציסטאין. Tardigrade defensins ו- macins (מודגש) מוכנסים לתוך הקבוצות שנוצרו קודם לכן במידת האפשר. כמה רצפים tardigrade עשוי להראות דפוס ייחודיות לקבוצה. ציסטאין אינו כלול בתיבה ההפניה שציין של עילי של cysteines לפני/אחרי (למשל, C3/4 הוא בין C3 ו- C4). הסימון "2C/1" מציין קיימים שני cysteines במעלה הזרם של הפניה C1.
הקבצים המשלימים 1 (S1): יישור זה הנתונים (dataset) במגה- אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
קובץ משלים 2 (S2): עץ מרבי-הסבירות מגה קובץ זה הנתונים (dataset). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
קובץ משלים 3 (S3): יישור זה הנתונים (dataset) בתבנית נקסוס עבור MrBayes. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
הקבצים המשלימים 4 (S4): קובץ קונצנזוס מניתוח MrBayes את הנתונים (dataset). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
הקבצים המשלימים 5 (S5): יישור של רצפי CS-αβ 250 מגה- אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
הקבצים המשלימים 6 (S6): עץ נראות מקסימלית של רצפי CS-αβ 250. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
הקבצים המשלימים 7 (S7): יישור של 250 רצפי CS-αβ נקסוס תבנית עבור MrBayes. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
הקבצים המשלימים 8 (S8): קובץ קונצנזוס מניתוח MrBayes של רצפי CS-αβ 250. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הקריטריונים למתן חלבון בתוך קבוצה צריכה להיות ברורה, אבל זה לא תמיד המקרה. רצפים זאת יש CS-αβ מקפלים נחקרו במעבדות רבות באמצעות מגוון רחב של אורגניזמים, וכתוצאה מכך מערכות שונות של נומנקלטורה, וכן ברמות שונות של אפיון. בניסיון לכפות במינוח חדש לחלוטין אינה סבירה ולא יגרום בלבול רב כאשר ייעוץ ספרות הקודם. הפניה מספור מערכת יכול לשמש בנוסף השם של חלבון כדי להבהיר את המאפיינים שלו יחסית superfamily.
קבוצות של חלבונים עם קריטריונים ברורים לגבי שמות לא סביר תועלת יצירת הפניה בגיליון אלקטרוני, למרות שזה עשוי להיות שימושי עבור סיכום מספר רב של רצפים והצגה של המאפיינים החשובים. היישורים רצף וסמלים שימושיים עבור חוקרים את רמת השימור בכל אתר, אך לא באופן פעיל לתעדף רצף תכונות חשובות עבור מבנה או פונקציה. הדוגמה CS-αβ התמקדו במבנה, אך יכול גם לשלב חומצות אמינו ספציפיות שיוצרות אתר איגוד כתכונה המכונן. כמו תכונות רצף המקנים פעילויות ספציפיות מיקרוביאלית/רעילים של פפטידים CS-αβ מזוהים, אלה יכול להוסיף את ההפניה כדי להבהיר את קבוצות בהתבסס על פעילות. אמנם רק פפטידים בוגרת החזוי שימשו בדוגמה זו, אם הנוכחות של פפטיד אות או פרו-פפטיד חשוב, ניתן להוסיף את המידע עבור כל רצף. הכניסה ספציפי או מחיקת אירועים, כמו גם מיקומים אינטרון, ניתן גם לכלול אם הם חשבו להיות אינפורמטיבי. היתרון שבשימוש MrBayes עבור ניתוח פילוגנטי הוא כי הוא אינו מוגבל נתונים מולקולרית-זה ניתן לנתח נתונים קידוד עבור מאפיינים אחרים שיש חשיבות אבולוציונית. אלה יכולים להיות מקודד כמו מתנה או נעדר, מתן מידע יותר מאשר רצף לבד.
איסוף הרצפים הרלוונטי הוא שלב קריטי של הפרוטוקול. בהתאם להיקף המחקר והפצה של חברי הקבוצה, זה עשוי להקיף את קבוצות taxonomical רחבה. אם המטרה היא להבין קבוצה שלמה של חלבונים, לשקול כמה רצפים עלול להימצא מחוץ המינים הנמצאים הם מדווחים בדרך כלל. אם טקסון מיוצג כבר היטב, רצפים נוספים הם לא סביר או מיותר להוציא אותם מן החיפוש עשוי להיות מתאים. בסיסי כלל-של-אגודל לאחזור להיטים בחיפוש הפיצוץ הוא לשימוש על קיצוץ של -05 ערך ה-e. ערך ה-e הוא מספר המתעניינים צפוי במקרה. אמנם זה מתאימים למצבים מסוימים, אם יש קבוצה של רצפי שהיא מאוד מתפצלת אבל מניות מאפיינים ספציפיים, זה יכול להיות פחות אמין זה יכול לאחזר רצפים דומים אבל לא לתכונות רוצה, זה אולי לא להחזיר רצפים בעלי המאפיינים המרכזיים אבל זה מאוד מתפצלת. ישנם כמה דרכים אפשריות של המטפל בבעיה זו. הראשונה היא להסתכל על הרצפים המזוהים בחיפוש מתחת שרשם-05 כדי לראות אם הם עונים לקריטריונים הכללה. שנית, אם יש מספיק מידע, להשתמש הפיצוץ Iterated מיקום ספציפי (PSI-הפיצוץ)22 או פגע דפוס יזם הפיצוץ (PHI-הפיצוץ)23. PSI-הפיצוץ משתמש תוצאות חיפוש ראשוני כדי ליצור מודל חדש לסיבוב הבא, יכול לפעמים רצפים מתבדרת מצאו כי החיפוש הראשוני לא הזדהה. פי-הפיצוץ דורש תבנית להגיש יחד עם הרצף שאילתה. זה מגביל את רצפי שאוחזרו לאלה המכילים את התבנית של עניין. כלי זה שימושי במיוחד אם מוטיב ייחודי לקבוצה ניתן לזהות בבירור.
תיאום מדויק הוא קריטי עבור ניתוח פילוגנטי; פרשנויות של עצים תקפות רק אם הם נוצרים באמצעות יישור טוב. שימוש ההפניה כדי ליידע את היישור יכול לסייע למנוע שגיאות שהן רק ברור כאשר מבנה או הפעילות נחשבים. רצף יתירות צריך להיות מוגדר עבור הפרוייקט. שני רצפים שנראים יתיר לא ייתכן למטרות פילוגנטי אם הם מן taxa במשרדנו או כמעט זהים רצף אבל יש מאפיינים מבניים או פונקציונליים שונים. אם יש עמימות בנוגע אשר רצפים יש לכלול, במערכים מרובים יכול להיות שנוצר, מנותח בנפרד כדי לראות איך יישור משתנה מסקנות פילוגנטי ההשפעה. השיטה המוצגת כאן לא לבטל את הצורך ההתאמה הידנית של מערכים, אבל זה יכול לעזור להבהיר איך רצפי יתיישר, ואולי ניתן להשתמש בשילוב עם טכניקה barcoding מתוחכמים יותר מכפי שתיארנו בעבר13.
עבור ההפניה להיות שימושי, חשוב לזהות את הגדרת מאפיינים שאינם נמצאים כיום ברור מהרצף לבד. לדוגמה, בחן את חוסר היכולת להשוות ציסטאין מליטה דפוסים בין רצפי עם מספר שונה של cysteines כאשר כל רצף ממוספר לגבי עצמו. המטרה היא להקל על ההשוואה ולאפשר דיון, לא כדי להוסיף שכבה נוספת של בלבול. הדבר עשוי לכלול מספר חזרות של ההפניה וקורא שיקול הדעת להחליט אילו תכונות כדי לכלול. יש לקוות כי אימוץ שיטה נפוצה לדון רצפים מתבדרת בקבוצה יגביר את ההבנה של הקבוצה בכללותה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחבר אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר שוטף פפטיד מיקרוביאלית tardigrade נתמך על ידי מימון מגזר מן המערב התיכון אוניברסיטת Office של מחקר במימון תוכניות (ORSP). ORSP היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, פרשנות או הכנת כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BLAST webpage | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi | ||
| EditSeq (Lasergene suite) | DNASTAR | https://www.dnastar.com/t-allproducts.aspx | |
| Excel 2013 | Microsoft | ||
| FigTree | http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/ | ||
| MEGA | www.megasoftware.net | ||
| MrBayes | http://mrbayes.sourceforge.net/ | ||
| SCOP database | http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/ |
References
- Matsuyama, K., Natori, S. Purification of Three Antibacterial Proteins from the Culture Medium of NIH-Sape-4, an Embryonic Cell Line of Sarcophaga peregrina. J Biol Chem. 263 (32), 17112-17116 (1988).
- Lambert, J., et al. Insect immunity: Isolation from immune blood of the dipteran Phormia terranovae. of two insect antibacterial peptides with sequence homology to rabbit lung macrophage bactericidal peptides. PNAS. 86 (262-266), (1989).
- Dimarcq, J. -L., Bulet, P., Hetru, C., Hoffmann, J. Cysteine-rich antimicrobial peptides in invertebrates. Biopolymers. 47, 465-477 (1998).
- Shafee, T. M. A., Lay, F. T., Hulett, M. D., Anderson, M. A. The Defensins Consist of Two Independent, Convergent Protein Superfamilies. Mol Biol Evol. 33 (9), 2345-2356 (2016).
- Zhu, S., Gao, B. Nematode-derived drosomycin-type antifungal peptdies provide evidence for plant-to-ecdysozoan horizontal transfer of a disease resistance gene. Nat Commun. 5, (2014).
- Zhu, S., Gao, B. Evolutionary origin of b-defensins. Dev. Comp. Immunol. 39, 79-84 (2013).
- Bonmatin, J. -M., et al. Two-dimensional 1H NMR study of recombinant insect defensin A in water: Resonance assignments, secondary structure and global folding. J Biomol NMR. 2 (3), 235-256 (1992).
- Cornet, B., et al. Refined three-dimensional solution structure of insect defensin A. Structure. 3 (5), 435-448 (1995).
- Murzin, A. G., Brenner, S. E., Hubbard, T., Chothia, C. SCOP: a structural classification of proteins database for the investigations of sequences and structures. J Mol Biol. 247, 536-540 (1995).
- Sillitoe, I., et al. CATH: comprehensive structural and functional annotations for genome sequences. Nucleic Acids Res. 43, (Database issue) 376-381 (2015).
- Lam, S. D., et al.
- Tarr, D. E. K. Establishing a reference array for the CS-ab superfamily of defensive peptides. BMC Res Notes. 9, 490 (2016).
- Shafee, T. M. A., Robinson, A. J., van der Weerden, N., Anderson, M. A. Structural homology guided alignment of cysteine rich proteins. SpringerPlus. 5 (27), (2016).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic Local Alignment Search Tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
- Duckert, P., Brunak, S., Blom, N. Prediction of proprotein convertase cleavage sites. Protein Eng Des Sel. 17 (1), 107-112 (2004).
- Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. SignalP 4.0:discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nat Methods. 8, 785-786 (2011).
- Kobayashi, Y., et al. The cysteine-stabilized a-helix: A common structural motif of ion-channel blocking neurotoxic peptides. Biopolymers. 31, 1213-1220 (1991).
- Gao, B., del Carmen Rodriguez, M., Lanz-Mendoza, H., Zhu, S. AdDLP, a bacterial defensin-like peptide, exhibits anti-Plasmodium. activity. Biochem Biophys Res Commun. 387, 393-398 (2009).
- Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis. Mol Biol Evol. 30 (12), 2725-2729 (2013).
- Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).
- Ronquist, F., Huelsenbeck, J. P. MrBayes 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models. Bioinformatics. 19 (12), 1572-1574 (2003).
- Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25 (17), 3389-3402 (1997).
- Zhang, Z., et al. Protein sequence similarity searches using patterns as seeds. Nucleic Acids Res. 26 (17), 3986-3990 (1998).
