Summary
من خلال علاج مزدوج مع الكولشيسين، السموم المشتقة من النبات الذي يقتل الخلايا الانقسام، يمكن أن تتولد هيدرا فولغاريس الخالية من الأعصاب. هذه هيدرا لا يمكن تغذية أو إيستست من تلقاء نفسها. وتصف هذه الورقة طريقة محسنة للصيانة طويلة الأمد لل هيدرا فولغاريس العصبية الحرة في المختبر.
Abstract
وتشمل سلالة الخلايا الخلالية من هيدرا الخلايا الجذعية متعددة الخلايا، ومشتقاتها: خلايا الغدة، الخلايا النيماتية، والخلايا الجرثومية، والخلايا العصبية. يمكن القضاء على الخلايا الخلالية من خلال اثنين من العلاجات متتالية مع الكولشيسين، وهو السموم المشتقة من النبات الذي يقتل الخلايا الانقسام، وبالتالي محو إمكانية تجديد الخلايا المتمايزة التي يتم استخلاصها من الخلايا الجذعية الخلالي. وهذا يسمح لتوليد هيدرا التي تفتقر إلى الخلايا العصبية. لا يمكن لعنبية خالية من الأعصاب فتح فمها لتغذية، إجيست، أو تنظيم الضغط الاسموزي. ومع ذلك، يمكن لهذه الحيوانات البقاء على قيد الحياة ويتم استزراعها إلى أجل غير مسمى في المختبر إذا كانت تتغذى بانتظام وتزرع. عدم وجود الخلايا العصبية يسمح لدراسات دور الجهاز العصبي في تنظيم سلوك الحيوان وتجديد. البروتوكولات التي نشرت سابقا للصيانة خالية من الأعصاب هيدرا تنطوي على التقنيات التي عفا عليها الزمن مثل الفم بيبتينغ مع ميكروبيبيت اليد سحبهاإيبس لتغذية وتنظيف هيدرا . هنا، يتم تقديم بروتوكول محسن لصيانة هيدرا خالية من الأعصاب. وتستخدم ملقط غرامة يميل لإجبار فتح الفم وإدراج أرتيميا طازجة قتل. بعد تغذية القوة، يتم مسح تجويف الجسم للحيوان مع المتوسطة الطازجة باستخدام حقنة وإبرة تحت الجلد لإزالة المواد عسر الهضم، المشار إليها هنا باسم "التجشؤ". هذه الطريقة الجديدة للتغذية القوة والتجشؤ هيدرا خالية من الأعصاب من خلال استخدام ملقط والمحاقن يلغي الحاجة إلى الفم بيبتينغ باستخدام اليد سحبت نصائح ميكروبيبيت. وبالتالي يجعل العملية أكثر أمانا وأكثر فعالية بكثير الوقت. للتأكد من أن الخلايا العصبية في هيبوستوم تم القضاء عليها، يتم إجراء المناعية باستخدام المضادة للتييروسين-توبولين.
Introduction
الجهاز العصبي من هيدرا يتكون من شبكة العصب، مع الخلايا العصبية المرتبطة كل من طبقات الأنسجة الظهارية 1 . صافي العصب هو أكثر كثافة في هيبوستوم وسويقة وأقل كثافة في العمود الجسم 2 . الخلايا العصبية تنشأ من الخلايا الجذعية الخلالية، والتي هي الخلايا الجذعية متعددة الاختصاصات التي تؤدي إلى خلايا إفرازية، الخلايا النيماتية، والخلايا الجرثومية، والخلايا العصبية 1 . فمن الممكن للقضاء على الخلايا الخلالية من هيدرا فولغاريس من خلال العلاج مع الكولشيسين 3 ، 4 ، السموم المشتقة من النبات الذي يقتل الخلايا الانقسام. على الرغم من أن الكولشيسين تم العثور على تثبيط البلمرة ميكروبيبول في الكائنات الحية الأخرى، وقد أظهرت دراسة سابقة أن الأنابيب الدقيقة موجودة في هيدرا طوال العلاج بأكمله، مما يشير إلى أن الكولشيسين لا يتصرف بهذه الطريقة في هيدرا 3 . آخر ستيوحي أودي أن الكولشيسين لا يربط بكفاءة إلى توبولين في بعض الكائنات الحية، بما في ذلك تيترايمينا بيريفورميس، زي مايس، كلاميدوموناس ، و ششيزوساشاروميسز بومب، والتي قد تفسر هذا الاختلاف 5 . العلاج الكولشيسين يدفع البلعمة من الخلايا الخلالي من قبل الخلايا الظهارية الأديم الباطن 3 وبالتالي يسمح لخلق الحيوانات التي تفتقر إلى الخلايا العصبية وخلايا الغدة، والخلايا النيماتية. ومن غير الواضح لماذا الخلايا الخلالية هي عرضة بشكل خاص لعلاج الكولشيسين. وبالنظر إلى أن كل من الخلايا الخلالية ما بعد الإنقسامية ونسب الخلايا الجذعية الخلالية تضررت و فاجوسيتوسد، خلص كامبل إلى أن الكولشيسين لا يؤثر بشكل مباشر على النشاط الانقسامي 3 . والجدير بالذكر أن العلاج الكولشيسين يعمل بشكل جيد في هيدرا فولغاريس، ولكن ثبت أن لا تعمل كذلك في الأنواع الأخرى، مثل هيدرا أوليغاكتيس 6 . هيدرا فيريديس خالية من الأعصاب 7 . هيدرا خالية من الأعصاب (كما يشار إليها أحيانا باسم " هيدرا الظهارية" 8 ) هي بالتالي أداة مفيدة لدراسة أدوار هذه الأنواع من الخلايا المتخصصة من النسب الخلالي خلية في التوازن الأنسجة وتجديد.
هيدرا قد يكون المثال الوحيد المعروف للحيوان قادر على العيش من دون الجهاز العصبي. هيدرا خالية من الأعصاب بمثابة نموذج مفيد بشكل خاص لتشريح دور الشبكة العصبية في تنظيم هيدرا التجدد والتوازن، والسلوك. على سبيل المثال، إدخال الخلايا الخلالية في هيدرا خالية من الأعصاب عن طريق التطعيم سمح لتوصيف التمايز الخلايا العصبية كما محددة للغاية المنطقة 9 . وعلاوة على ذلك، لأن هيدرا خالية من الأعصاب يمكن تجديد، فإنهاتمكن من التحقيق في مسارات تجديد بديلة للجهاز العصبي المستقل. أحد الأمثلة على ذلك هو الخلايا العصبية القمية وتكوين الرأس، والتي تبين أنها تعتمد على وظيفة نوكس-2 في الجهاز العصبي في ويلديب هيدرا ، ولكن يبدو أنها قابلة للاستبدال في هيدرا خالية من الأعصاب، مما يشير إلى أنه قد يكون هناك بديل عملية تجديد الرأس 10 -
كما تم استخدام هيدرا خالية من الأعصاب لدراسة التعبير عن الخلايا الظهارية وتنظيم الجينات العصبية والعصبية بعد فقدان الخلايا العصبية 11 . هيدرا خالية من الأعصاب لا تظهر انفجارات انفجارات عفوية 12 ، مشيرا إلى أن هذه الرشقات ينظمها الجهاز العصبي. ومع ذلك، عقد هيدرا دو الخالية من الأعصاب، والتعاقد ردا على معسر العمود الجسم مع ملقط، مما يشير إلى أن تقلص في استجابة للمحفزات الميكانيكية بوساطة اقتران ثروغ تقاطعات الفجوة في الخلايا الظهارية، في حين يتم بوساطة سلوك مقلص عفوية عن طريق اقتران من خلال تقاطعات الفجوة في الخلايا العصبية 13 .
هيدرا خالية من الأعصاب لا تفتح أفواههم عندما قدمت مع الطعام أو انخفاض الجلوتاثيون 3 ، مما يشير إلى أن الخلايا العصبية الحسية ضرورية للكشف عن وجود الطعام وإشارة الفم لفتح. وبالإضافة إلى ذلك، يبدو أن شبكة العصب أن تلعب دورا في استشعار الضغط الاسموزي، لأن الحيوانات الخالية من الأعصاب غير قادرة على تنظيم مستقل الضغط الهيدروستاتيكي الداخلي من خلال فتح الفم، مما تسبب في مظهرها مثل البالون مميزة 3 ، 4 ( الشكل 1B ). تنظيم الضغط الهيدروستاتيكي في هيدرا الخالية من الأعصاب عن طريق الانكماش اليدوي المتكرر أدى إلى فقدان بعض التشكل غير طبيعي في العمود السفلي والجسم. ومع ذلك، أدى الانكماش المزمن إلى تداخل مع النمو، إلأوغاتيون، في مهدها، وتنظيم الأنسجة 8 .
على الرغم من أن هيدرا خالية من الأعصاب غير قادرة على إطعام و إيستست من تلقاء نفسها، فمن الممكن للحفاظ عليها إلى أجل غير مسمى في المختبر عن طريق تغذية القوة يدويا والتجشؤ كل حيوان. وقد وصفت المنشورات السابقة أساليب تغذية القوة والتجشؤ هيدرا خالية من الأعصاب، ولكن هذه البروتوكولات تنطوي على استخدام نصائح ميكروبيبيت التي يجب أن تكون اليد سحبت بعناية إلى الحجم المناسب، فضلا عن استخدام الناطقة بلسان متصلة ماصة بواسطة أنابيب 14 . هنا، يتم وصف طريقة أبسط وأكثر أمنا، وأكثر كفاءة في الوقت للتغذية والتجشؤ.
وبالإضافة إلى ذلك، شملت الدراسات السابقة التحقق من عدم وجود الخلايا العصبية من خلال تفكك الحيوانات الثابتة في الخلايا الفردية وفحص التشكل الخلية 3 ، 4 ، 15 . Hتم استخدام المناعية مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ضد التيروزينات الكربوكسيل-محطة من ألفا-توبولين كوسيلة مجانية لتطهير للتحقق من نضوب الخلايا العصبية في 13 ، 16 هايبوستوم. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن الخلايا العصبية في السويق يمكن أيضا أن تصور باستخدام هذا الأجسام المضادة 13 ، ولكن هذه الخلايا العصبية وكذلك تلك الموجودة في عمود الجسم هي أكثر صعوبة لجعل بها. في حين أن المناعية كافية لتأكيد عدم وجود الخلايا العصبية في هايبوستوم ولا تتطلب الخبرة على نوع الخلايا التشكل، فإنه لا يمكن أن تستخدم للتحقق من عدم وجود الخلايا الجذعية الخلالي والمشتقات الأخرى من هذه الخلايا. التفكك والدراسات مورفولوجيا الخلية هي أكثر صرامة ويمكن أن تعطي حسابا كمي لأعداد كل نوع من الخلايا المتبقية بعد كل مرحلة من مراحل العلاج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. علاج الكولشيسين المزدوج
- جعل 0.4٪ الكولشيسين (الوزن / حجم) الحل في هيدرا المتوسطة 3 ، 4 ، 17 .
تنبيه: الكولشيسين سامة للغاية، قاتلة إذا ابتلع، قد يسبب عيوب وراثية، ويمكن أن يسبب تلف العين. التعامل مع مسحوق في غطاء الدخان وارتداء معدات الحماية الشخصية الكاملة (ب). - احتضان هيدرا فولغاريس (تم استخدام سلالة إيب هنا) التي جوعا لمدة 24 ساعة في 0.4٪ الكولشيسين بنسبة 5 هيدرا لكل مليلتر من الحل كولشيسين في طبق بتري لمدة 8 ساعات في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
ملاحظة: 5 الكوليرا هيدرا / مل هو المبدأ التوجيهي لتحديد مقدار الحل لاستخدامها لتجنب الاكتظاظ الطبق مع هيدرا . استخدام نفس حجم الحل لتنظيف لاحق وتغييرات الحل. - إزالة الحل كولشيسين واستبدالهامع نظيفة هيدرا المتوسطة دون الكولشيسين. غسل هيدرا 5 مرات عن طريق نقل تسلسلي مع ماصة باستور الزجاج في هيدرا نظيفة المتوسطة قبل نقل إلى 50 ميكروغرام / مل ريفامبيسين في هيدرا المتوسطة. الحفاظ على هيدرا في حاضنة 18 درجة مئوية.
ملاحظة: يكفي تخزين 1000X ريفامبيسين الأسهم (50 ملغ / مل) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (دمسو) لمدة 1-2 أسابيع من العلاج يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية. ويمكن تحديد المبلغ المحدد من قبل الحجم الكلي للحل المستخدمة كل يوم. على سبيل المثال، إذا كان هناك 2 أطباق، كل منها يحتوي على 10 مل من الحل الذي يحتاج إلى تغيير مرتين يوميا، ما مجموعه 40 مل من الحل سوف تستخدم في يوم واحد، أي ما يعادل 40 ميكرولتر من الأسهم 1000X في اليوم الواحد أو 560 ميكرولتر على مدى أسبوعين. ثم يتم تخفيف الأسهم 1: 1000 في هيدرا المتوسطة عند الاستخدام.
الحذر: دمسو هو سائل قابل للاحتراق ويخترق الجلد بسهولة، والسماح للمواد الكيميائية المذابة الأخرى في الجسم. يدلي المذيبات في غطاء الدخان وارتداء معدات الوقاية الشخصية الكاملة. من المذكرة، دمسو يتجمد عند 4 درجات مئوية - تغيير هيدرا المتوسطة التي تحتوي على ريفامبيسين مرتين يوميا حتى توقف هيدرا طرد الخلايا في المتوسط، والذي هو عموما من 1 أسبوع بعد العلاج. عند هذه النقطة، يمكن تغيير الوسيط مرة واحدة يوميا. خلال الأيام التالية للعلاج، سوف هيدرا تفقد تماما مخالبهم. تجنب وجود هيدرا في اتصال مع بعضها البعض، لأنها قد الصمامات معا وتؤدي إلى شكل غريب هيدرا ( الشكل 2 A ).
- لمنع الاتصال، تجنب دوامة الطبق في حركة دائرية. بدلا من ذلك، يهيج بلطف الطبق في الاتجاهات العمودية والأفقية حتى تنتشر هيدرا بعيدا. فحص الطبق عند وضع هيدرا في حاضنة 18 درجة مئوية وضبط حسب الضرورة.
ملاحظة: بالنسبة للأيام التي يتم فيها تغيير الوسيط مرتين، غير الوسيطمرة واحدة في الصباح ومرة أخرى في فترة ما بعد الظهر / المساء.
- لمنع الاتصال، تجنب دوامة الطبق في حركة دائرية. بدلا من ذلك، يهيج بلطف الطبق في الاتجاهات العمودية والأفقية حتى تنتشر هيدرا بعيدا. فحص الطبق عند وضع هيدرا في حاضنة 18 درجة مئوية وضبط حسب الضرورة.
- مرة واحدة تبدأ مخالب لتشكيل، تبدأ تغذية القوة والتجشؤ هيدرا 3 إلى 4 مرات في الأسبوع (انظر القسمين 2 و 3). حوالي 8-9 أيام بعد العلاج كولشيسين، وسوف تبدأ هيدرا في نمو مخالبهم مرة أخرى.
ملاحظة: ينمو نمو اللامسة يختلف بين الأفراد. قد يستغرق البعض وقتا أطول من 8 إلى 9 أيام قبل ظهور علامات نمو اللامسة. تلك التي لا تنمو مخالب وكذلك شكل غريب ( الشكل 2 ب ) يجب إزالة الحيوانات أو الحيوانات صغيرة جدا لتغذية. من المرجح أن هذه هيدرا لا البقاء على قيد الحياة العلاج الثاني. قد هيدرا أيضا برعم. ومع ذلك، قد لا تزال بعض البراعم لا تزال الخلايا الخلالية وتكون قادرة على تناول الطعام من تلقاء نفسها.- إزالة أي البراعم التي يمكن أن تأكل دون مساعدة وفصل من الحيوان الأم. تحديد هذه الحيوانات بإضافة أرتيميا الحية إلىوتغذية طبق ومراقبة ما إذا كان أو لا حيوانات الصيد وأكل الأرتيميا من تلقاء نفسها. 1 أو 2 هيدرا قد تكون قادرة على تناول الطعام من تلقاء نفسها. وينبغي أيضا التخلص منها.
ملاحظة: هيدرا خالية من الأعصاب لديها التشكل مثل البالون مميزة، ومخالب التي هي أقصر وأرق من المعتاد (بسبب فقدان الخلايا الديدان الخيطية)، وبالتالي يمكن بسهولة تمييزها عن الحيوانات تبدو طبيعية ( الشكل 1 A، 1B ).
- إزالة أي البراعم التي يمكن أن تأكل دون مساعدة وفصل من الحيوان الأم. تحديد هذه الحيوانات بإضافة أرتيميا الحية إلىوتغذية طبق ومراقبة ما إذا كان أو لا حيوانات الصيد وأكل الأرتيميا من تلقاء نفسها. 1 أو 2 هيدرا قد تكون قادرة على تناول الطعام من تلقاء نفسها. وينبغي أيضا التخلص منها.
- بعد ثلاثة أسابيع من أول علاج الكولشيسين، كرر العلاج الكولشيسين (الخطوات 1،1-1،5). علاج الكولشيسين الثاني ضروري للقضاء على الخلايا الخلالية المتبقية والخلايا العصبية 3 .
2. قوة تغذية
- إضافة الخراجات أرتيميا إلى حاوية زجاجية ضيقة وطويلة أن التناقص التدريجي في الجزء السفلي. ملء الحاوية مع المياه الأرتيميا (6.72 M كلوريد الصوديوم). تجنب إكستحرير 1 غرام من الخراجات لكل 1 لتر من الماء للحصول على أعلى حاصل هاتش.
- تغطية الجزء العلوي من الحاوية مع بارافيلم وإدراج 10 مل ماصة المصلية من خلال بارافيلم في الحاوية. توفير التهوية عن طريق ربط أنابيب لمضخة الهواء الحوض وتركيب الأنابيب حول ماصة. تأكد من أن طرف ماصة تصل إلى الجزء السفلي من الحاوية وأنه لا يتم تسوية الخراجات في الجزء السفلي. سوف يفقس الأرتيميا بعد 48 ساعة.
ملاحظة: هناك العديد من الطرق المختلفة لفقس الأرتيميا التي قد تعمل فقط كذلك.
- تغطية الجزء العلوي من الحاوية مع بارافيلم وإدراج 10 مل ماصة المصلية من خلال بارافيلم في الحاوية. توفير التهوية عن طريق ربط أنابيب لمضخة الهواء الحوض وتركيب الأنابيب حول ماصة. تأكد من أن طرف ماصة تصل إلى الجزء السفلي من الحاوية وأنه لا يتم تسوية الخراجات في الجزء السفلي. سوف يفقس الأرتيميا بعد 48 ساعة.
- توتر الأرتيميا من المياه الأرتيميا في شبكة الأرتيميا (المتاحة من شركات توريد الحوض) وغسلها لمدة 20 ثانية في المياه دي قبل وضعها في طبق مع هيدرا المتوسطة. ملوحة المياه أرتيميا مرتفعة جدا ل هيدرا ، لذلك يجب غسلها أرتيميا قبل استخدامها.
- تحت المجهر تشريح،الموت ببطء الأرتيميا عن طريق الضغط عليها برفق مع زوج من ملقط غرامة. تجنب الضغط الصعب بما فيه الكفاية لطرد الشجاعة، وهذا سوف التمسك ملقط وجعل التغذية صعبة. الضغط برفق على الأرتيميا قبل إطعامه إلى هيدرا سيساعد في عملية الهضم 14 . وضع الأرتيميا قتل حديثا بالقرب من هيدرا في طبق لتسهيل التغذية السريعة.
ملاحظة: تتم جميع الخطوات اللاحقة تحت المجهر تشريح. - استخدام زوج واحد من ملقط لعقد هيدرا من قبل سويق. مواصلة عقد السويق خلال عملية تغذية هيدرا . باستخدام زوج الثاني من ملقط، قرصة العمود الجسم من أجل جعل عقد هيدرا .
- في حين عقد نصائح من الزوج الثاني من ملقط معا، اضغط في وسط هايبوستوم (هيكل قبة في نهاية الفم من الحيوان). وهذا يؤدي أحيانا إلى فتح الفم. أناو الفم لا يفتح عن طريق التنصت، ثقب الفم عن طريق إدراج ملقط في وسط هايبوستوم ثم الإفراج قليلا الضغط على نصائح ملقط. هذا يجب أن تمتد من فتح الفم التي أدلى بها ثقب.
ملاحظة: قد هيدرا تنفجر والانهيار عند فتح الفم ( الشكل 2 C ). إذا حدث هذا، قد لا يزال يتم إدراج الأرتيميا في هيدرا . إذا كان من الصعب جدا القيام بذلك، والانتقال إلى هيدرا المقبل والعودة إلى هيدرا الأصلي بعض الوقت في وقت لاحق، وحاول مرة أخرى. و هيدرا تميل إلى عدم تفريغ بقدر كبير خلال فتحات الفم اللاحقة. - بسرعة التقاط أرتيميا مع ملقط وإدراجها في تجويف المعدة هيدرا ل. إدراج العديد من الأرتيميا ممكن حتى تجويف المعدة هو الكامل وأكثر من ذلك لا يمكن إدراج الأرتيميا دون الإضرار هيدرا ، حادثحليف سحب أي أرتيميا داخل، أو منع الفم من الإغلاق. في المتوسط، وهذا هو 5 - 6 الأرتيميا ، ولكن ما يصل إلى 12 تم تغذية الحيوانات الكبيرة.
- إذا بدأ الفم لإغلاق، تمتد مفتوحة مرة أخرى مع ملقط كما هو موضح أعلاه؛ ومع ذلك، ينبغي توخي الحذر كما أي أرتيميا بالفعل داخل الحيوان قد تبدأ في الخروج عند فتح الفم.
- إذا كان هيدرا صغير جدا بالنسبة لأرتيميا كاملة، وقطع أرتيميا باستخدام مشرط وتغذية قطع أصغر هيدرا . إذا لم يبقى الأرتيميا داخل هيدرا ، قد يكون من الضروري الضغط على ملقط ضد أرتيميا لإبقائه داخل هيدرا حتى يغلق فمه.
- نقل هيدرا تغذية مع ماصة باستور الزجاج، بعناية لتجنب التجشؤ عرضي، إلى طبق مع الطازجة 50 ميكروغرام / مل ريفامبيسين في هيدرا المتوسطة. إذا طرد أرتيميا وروم هيدرا أثناء نقل، إعادة إدراجه بينما في طبق جديد.
ملاحظة: يتم استخدام ماصة الزجاج لنقل هيدرا ، كما تم العثور على أن هيدرا عصا أقل إلى الزجاج مقارنة مع البلاستيك. طول ماصة لا يهم، ولكن باستخدام ماصات 5 بوصة قد تكون أسهل إلى حد ما.
3. التجشؤ
- تجشؤ هيدرا لإزالة المواد عسر الهضم في أي وقت بين 8 و 20 ساعة بعد التغذية.
- الرمل أسفل نقطة إبرة تحت الجلد 30G مع P320 أو مماثلة الحصى الصنفرة حتى طرف مسطح.
ملاحظة: A 27G إبرة تحت الجلد سوف تعمل أيضا، ولكن الطرف أصغر من مقياس أعلى هو الأفضل. - إرفاق الإبرة إلى المتاح 1 مل حقنة بلاستيكية وملء حقنة مع الطازجة 50 ميكروغرام / مل ريفامبيسين في هيدرا المتوسطة.
ملاحظة: التجشؤ هيدرا واحد يستغرق حوالي 0.05 مل إلى 0.1 مل من الحل. A 1 مل سيرينج هو الأفضل منذ السيطرة على قوة وحجم الحل الخروج هو أكثر صعوبة مع حقنة حجم أكبر. - تحت المجهر تشريح، عقد سويق من هيدرا مع ملقط نقطة غرامة والاستفادة في وسط القبو مع الإبرة. إذا لم يفتح الفم، إدراج ملقط في هيبوستوم وفتح الفم كما هو موضح أعلاه للتغذية.
ملاحظة: تتم جميع الخطوات اللاحقة تحت المجهر تشريح. - استخدام حقنة لطرد، بلطف جدا لتجنب تهب بعيدا الحيوان بأكمله، وتجويف المعدة مع 50 ميكروغرام / مل ريفامبيسين الحل حتى تم طرد جميع الحطام. الإبرة لا تحتاج بالضرورة إلى إدراجها في هيدرا إذا كان حجم هيدرا لا يسمح. يمكن أن تعقد الإبرة على مقربة من فتح الفم، وأشار مباشرة نحو الفم.
- باستخدام ماصة باستير الزجاج، ونقل هيدرا بوربد إلى طبق مع الطازجة 5081؛ ز / مل ريفامبيسين في هيدرا المتوسطة.
4. مراقبة الجودة عن طريق المناعية
ملاحظة: يتم تكييف البروتوكول التالي من البروتوكولات التي كتبها شينك، M. A، وآخرون. 18 ، وبوتجر، A 19 . تتم جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة (رت) ما لم يذكر خلاف ذلك. A نوتاتور يمكن استخدامها لخطوات الحضانة ويمكن تحسين جودة تلطيخ. ومع ذلك، إذا هيدرا الحصول على متشابكة مع بعضها البعض، ويمكن أيضا أن يتم تنفيذ جميع الخطوات دون.
- إعداد الحل عرقلة: 10٪ مصل بقري جنيني (فبس) و 1٪ دمسو في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (بس). تخزين هذا الحل في 4 درجات مئوية حتى استخدام (الخطوات 4.6 و 4.11). يمكن تخزين الحل لمدة 1-2 أيام.
ملاحظة: يجب جمع جميع الحلول المستخدمة في هذا البروتوكول بشكل صحيح باعتبارها النفايات الخطرة. - الاسترخاء هيدرا في 200 ميكرولتر من 2٪ يوريتان في هيدرا مإديوم لمدة 1 دقيقة في 1.7 مل أنابيب ميكروسنتريفوج. استخدام 5 هيدرا في أنبوب لكل من الشروط 4: خالية من الأعصاب، غير المعالجة، غير المعالجة مع عدم وجود الأجسام المضادة الأولية، وغير المعالجة مع عدم وجود الأجسام المضادة الثانوية.
ملاحظة: لا تتجاوز دقيقة واحدة. التوقيت هنا أمر بالغ الأهمية لأن الحيوانات ستكون في حالة سيئة بعد قضاء الكثير من الوقت في يوريتان. - إزالة يوريتان وإصلاح هيدرا في 200 ميكرولتر من بارافورمالدهيد 4٪ (بفا) في هيدرا المتوسطة لمدة 15 دقيقة.
- غسل العينات 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
ملاحظة: يتم كل يغسل مع برنامج تلفزيوني و بستكس مع 500 ميكرولتر من الحل. - بيرمابيليز مع 500 ميكرولتر من 0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة.
- إزالة 0.5٪ تريتون X-100 وإضافة 500 ميكرولتر من الحل حجب. منع العينات لمدة 1 ساعة على الأقل.
- تمييع المضادة-- التيروزين-توبولين الأجسام المضادة 1: 200 في حجب الحل.
ملاحظة: كان هذا التركيز ديتم تعيينه تجريبيا. إذا تم العثور على إشارة في الضوابط لتكون ضعيفة جدا، قد تحتاج إلى زيادة التركيز. إذا كان هناك ملزم غير محدد، قد تحتاج إلى خفض التركيز. قبل الحضانة من الأجسام المضادة قد يساعد أيضا على تقليل غير محددة ملزمة. - إزالة الحل حجب من العينات وإضافة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية إلى هيدرا خالية من الأعصاب، والضوابط غير المعالجة، والضوابط غير المعالجة مع أي الثانوية. للضوابط غير المعالجة مع عدم وجود الابتدائي، فقط إضافة 200 ميكرولتر من حجب الحل دون الأجسام المضادة.
- احتضان العينات بين عشية وضحاها (> 12 ساعة) في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: بدلا من ذلك، احتضان 5-6 ح في رت. - إزالة الأجسام المضادة الأولية وغسل العينات على نطاق واسع مع 0.3٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني 1X (بستكس).
ملاحظة: حفظ الأجسام المضادة الأولية وتخزينها في 4 درجات مئوية، كما يمكن إعادة استخدامها على الأقل 2 - 3 مرات. - تمييع الماعز المضادة للماوس هب الثانوية أنتيبأودي 1: 500 في حجب الحل. إضافة 200 ميكرولتر إلى هيدرا خالية من الأعصاب، والضوابط غير المعالجة، والضوابط غير المعالجة مع عدم وجود الابتدائي. للضوابط غير المعالجة مع أي الثانوية، فقط إضافة 200 ميكرولتر من حجب الحل دون الأجسام المضادة.
ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخدام الأجسام المضادة الثانوية الفلورسنت، والتي ليست هناك حاجة الخطوات 4.13 - 4.17. استخدام الفلورسنت الثانوي يوفر الوقت و عموما كافية، ولكن ه الثانوية يوفر حساسية متزايدة. تم تحديد تركيز الثانوي بشكل تجريبي. إذا تم العثور على إشارات في الضوابط لتكون ضعيفة جدا، قد تحتاج إلى زيادة التركيز. إذا كان هناك ملزم غير محدد، قد تحتاج إلى خفض التركيز. - احتضان العينات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- إزالة الأجسام المضادة الثانوية وغسل العينات على نطاق واسع مع بستكس.
- إعداد 1X بت: 0.2٪ ألبومين المصل البقري (الوزن / حجم)، و 0.05٪ Tween20 في برنامج تلفزيوني 1X. احتضان sأمبلز في 1X بت لمدة 30 دقيقة.
- إزالة 1X بت واحتضان العينات في 1: 1،000 نهس-فلوريسئين و 1: 10،000 H 2 O 2 في 1X بت لمدة 15 دقيقة في الظلام. من هذه الخطوة على، والحفاظ على العينات في الظلام قدر الإمكان، حيث أن إشارة الفلورسنت سوف تنخفض لأنها تتعرض للضوء.
ملاحظة: تم إعداد نهس-فلوريسئين بعد بروتوكول فيش مفصلة من قبل الملك، رس و نيومارك، با 20 - غسل العينات 3 مرات مع بستكس بسرعة، ثم 2 مرات لمدة 30 دقيقة.
- ترك العينات في بستكس بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية لمواصلة الغسيل.
- هل يغسل عدد قليل من أكثر مع 1x بستكس. لتصور نواة الخلية، وتنفيذ الخطوات الاختيارية التالية ل كونترستينينغ دنا باستخدام 4 '، 6-دياميندينو-2-فينيليندول، ثنائي هيدروكلوريد (دابي). وإلا، قد يتم تصوير العينات الآن.
- تمييع 5 ملغ / مل الأسهم دابي لتركيز العمل من 1: 500 في بستكس وإضافة 200 ميكرولتر لكل أنبوب. Incuبيت عينات لمدة 30 دقيقة.
تنبيه: دابي هو مادة مسرطنة معروفة. ارتداء معدات الوقاية الشخصية الكاملة. - إزالة دابي وغسل العينات 2-3 مرات مع بستكس قبل التصوير مع المجهر مضان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مباشرة بعد العلاج 8 كولشيسين الأولي، كل هيدرا البقاء على قيد الحياة. بعض من هذه هيدرا سوف يكون فقط بذرة اللامسة المتبقية ( الشكل 3 A )، في حين أن الآخرين قد فقدت تماما مخالبها ( الشكل 3 B ). على مدى 1 أو 2 أيام التالية، وسوف تستمر مخالب لتقليص حتى كل هيدرا فقدت مخالبها. حوالي 1 أسبوع بعد العلاج، سوف هيدرا تظهر علامات نمو اللامسة، مع كعب صغيرة مثل مخالب ( الشكل 3 C ) قبل أن تجدد تماما مخالبها ( الشكل 3 D ). من هيدرا الأصلي، حوالي 50-60٪ في نهاية المطاف تجديد مخالبهم بين 1-2 أسابيع بعد العلاج.
بعد sالعلاج إكوند، انتعاش الحيوانات مشابه لذلك بعد العلاج الأول. وهكذا، حوالي 10٪ من العدد الأصلي من الحيوانات التي ذهبت إلى كل من العلاجات يتعافى وينمو إلى حجم مناسب للتجريب ( الشكل 1 B ). هذه هيدرا ديك مخالب التي تظهر أرق من تلك الحيوانات غير المعالجة، لديها الأنسجة التي هي أكثر شفافية، وسوف تظهر منتفخة بسبب عدم القدرة على فتح أفواههم من أجل تخفيف الضغط الاسموزي ( الشكل 1 A ، 1B). أي الحيوانات التي لا تغذى يمكن البقاء على قيد الحياة لبضعة أسابيع، ومع ذلك، فإن الحيوانات غير صالحة تتقلص في الحجم ويصبح من الصعب على نحو متزايد لإطعام.
هيدرا التي لا استعادة بعد العلاج الثاني يمكن الحفاظ إلى أجل غير مسمى. هذه الحيوانات قادرة على برعم، وبالتالي استدامة وتنامي السكان. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تزرع السكانعن طريق قطع هذه الحيوانات والسماح لهم لتجديد 4 .
المناعية يؤكد فقدان الخلايا العصبية في هايبوستوم بعد العلاج الكولشيسين الثاني. صافي العصب الكثيف في هيبوستوم يمكن تصور باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة التيروزين-توبولين 13 ، 16 ويظهر ألياف متميزة يشع الخارج من الفم والهيئات خلية واضحة ( الشكل 4 A ). هذه الألياف غائبة في هيدرا خالية من الأعصاب التي تم إنتاجها من قبل العلاج المزدوج مع الكولشيسين ( الشكل 4 B ). وعلاوة على ذلك، شارك في تلطيخ مع دابي يكشف عن انخفاض عدد نوى الخلية في هيدرا خالية من الأعصاب مقارنة مع الضوابط غير المعالجة بسبب فقدان خلايا سلالة الخلايا الخلالي نتيجة لعلاج الكولشيسين ( الشكل4 ألف، 4 باء ).
الشكل 1 . مقارنة هيدرا خالية من الأعصاب وغير المعالجة.
(A) غير المعالجة هيدرا . (B) خالية من الأعصاب هيدرا 22 يوما بعد العلاج الكولشيسين الثاني. لاحظ العمود تورم الجسم ومخالب رقيقة في الحيوان الخالي من الأعصاب. الحانات مقياس هي 500 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 . أمثلة على هيدرا المشوهة.
(A) اثنين هيدرا (B) هيدرا على شكل غريب. (C) هيدرا التي انفصلت بعد فتح فمها. الحانات مقياس هي 400 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 . صور ممثل هيدرا بعد أول 8 ساعة علاج الكولشيسين.
(A) هيدرا مع مخالب باهظة مباشرة بعد العلاج. (B) هيدرا التي فقدت تماما مخالبها مباشرة بعد العلاج. (C) هيدرا التي بدأت لتنمو مخالبها 8 أيام بعد العلاج. (د)هيدرا التي نمت تماما مخالبها 13 يوما بعد العلاج. الحانات مقياس هي 400 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 . فقدان الخلايا العصبية في هيبوستوم يمكن تأكيده من قبل المناعية.
(A) هيبوستوم من هيدرا غير المعالجة و (B) هايبوستوم من هيدرا خالية من الأعصاب حوالي 2 أسابيع بعد العلاج الكولشيسين الثاني، المسمى مع (1) الأجسام المضادة المضادة للتييروسين-توبولين و (إي) دابي. (3) يظهر التراكب. * يشير إلى موقع الفم. جعلت Z الإسقاطات القصوى من الغزل القرص مبائر مضان متحد البؤر z اتخاذها مع هالتعرضات 500 مللي ثانية (غفب) و 15 مس (دابي). تم تعديل السطوع والتباين لتحسين الرؤية. الحانات مقياس هي 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هيدرا الخلايا الخلالي يمكن القضاء عليها من خلال علاج الكولشيسين المزدوج 3 ، 4 . في الأيام التالية للعلاج الأول، فمن الأهمية بمكان لمنع الاتصال بين هيدرا الفردية لتجنب الانصهار من قطع هيدرا في هيدرا مشوهة. أيضا، الحيوانات التي يمكن أن تأكل دون مساعدة بعد العلاج الأول يجب إزالتها لأن العلاج الكولشيسين الثاني قد لا يكون كافيا للقضاء على الخلايا الخلالية المتبقية من هذه الحيوانات. لتعظيم معدل البقاء على قيد الحياة من هيدرا خالية من الأعصاب بعد العلاج الكولشيسين الثاني، يجب تغذية الحيوانات كما العديد من الأرتيميا ممكن بعد الانتعاش من العلاج الأول، مع 1-2 أيام بين العلف للتعافي والنمو. كل علاج الكولشيسين يسبب هيدرا لتقليل كبير في الحجم كما يتم إغست الخلايا، وبالتالي فإن أكبر هيدرا هي قبل كل معاملة، بإتر احتمالات أن هيدرا سوف يتعافى إلى حجم التي يمكن تغذية والحفاظ عليها.
بسبب انخفاض معدل البقاء على قيد الحياة من هيدرا بعد كل معاملة، قد يكون من المستحسن أن تبدأ مع العديد من هيدرا . ومع ذلك، يجب توخي الحذر مع بدء العلاج على الكثير من هيدرا في وقت واحد. وهذا سيجعل التغذية بعد أول علاج صعبة وتستغرق وقتا طويلا للغاية. الحيوانات تغذية جيدا بعد العلاج الأول استعادة إلى أحجام أكبر، وبالتالي يكون معدل البقاء على قيد الحياة أعلى بعد العلاج الثاني. وبالتالي، قد يكون من المفيد البدء بعدد أقل والتركيز على التغذية بشكل أفضل. عموما، بدءا من 50-100 الحيوانات هو يمكن التحكم فيها 1-2 أشخاص. ومن الأفضل أيضا أن تبدأ مع أكبر هيدرا ممكن، وهذه سوف البقاء على قيد الحياة أفضل العلاجين.
طريقة تغذية القوة والتجشؤ هيدرا التي تفتقر إلى الخلايا العصبية الموصوفة هنا هو أكثر أمانا، أبسط، والمزيد من الوقتكفاءة من الطرق الموصوفة في الماضي 3 ، 4 ، 14 . استخدام الملقط المتاحة تجاريا والمحاقن القضاء على الحاجة إلى نصائح سحبت ميكروبيبيت اليد، والتي تستغرق وقتا طويلا وصعبة لجعل. استخدام هذه الأدوات أيضا يتجنب الحاجة إلى الفم ماصة. قوة التغذية باستخدام ملقط قد يكون من الصعب في البداية ولكن نظرا ما يكفي من الوقت والممارسة، يصبح من السهل جدا وفعالة. ينبغي للمرء أن الممارسة الأولى تغذية القوة والتجشؤ هيدرا العادي للحصول على الشعور لمدى القوة لاستخدامها مع الأدوات وكيفية التعامل مع هيدرا . تم اختبار ملقط مختلف وإبرة أحجام للعثور على الأدوات المثلى لقوة التغذية والتجشؤ.
استخدام تلطيخ الأجسام المضادة كما هو موضح هنا هو كاف فقط للتحقق من غياب الخلايا العصبية في هايبوستوم. للتأكد من أن جميع الخلايا الخلالية قد تم القضاء عليها، قد تكون الحيوانات مقلقة ويمكن فحص أنواع الخلايا الحالية 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون الدكتور ديك كامبل (جامعة كاليفورنيا في إيرفين) للمناقشات حول البروتوكول الأصلي لتوليد والحفاظ على الحيوانات الخالية من الأعصاب، والسيدة روي وانغ للمساعدة في التكيف مع حقنة وتقنية الإبرة، والسيدة دانيال هاغستروم والدكتور روب ستيل (أوك إيرفين) للتعليق على المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل رسيسا و نسف منحة كمي-1463572.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 mL Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X - 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 mL Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
References
- Bode, H. R. The interstitial cell lineage of Hydra: a stem cell system that arose early in evolution. J. Cell. Sci. 109, 1155-1164 (1996).
- Hager, G., David, C. N. Pattern of differentiated nerve cells in hydra is determined by precursor migration. Development. 124, 569-576 (1997).
- Campbell, R. D. Elimination of Hydra interstitial and nerve cells by means of colchicine. J. Cell. Sci. 21, 1-13 (1976).
- Marcum, B. A., Campbell, R. D. Development of Hydra lacking nerve and interstitial cells. J. Cell. Sci. 29, 17-33 (1978).
- Burns, R. G. 3H-colchicine binding: Failure to detect any binding to soluble proteins from various lower organisms. Exp. Cell. Res. 81, 285-292 (1973).
- Lee, H. -T., Campbell, R. D. Development and Behavior of an Intergeneric Chimera of Hydra (Pelmatohydra oligactis Interstitial Cells Hydra attenuata Epithelial Cells). Biol. Bull. 157 (2), 288-296 (1979).
- Novak, P. Preparing Hydra viridis with Nerve Cells and No Interstitial Cells, or with Neither of These Cell Types. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 295-297 (1983).
- Wanek, N., Marcum, B. A., Lee, H. -T., Chow, M., Campbell, R. D. Effect of hydrostatic pressure on morphogenesis in nerve-free Hydra. J. Exp. Zool. 211, 275-280 (1980).
- Minobe, S., Koizumi, O., Sugiyama, T. Nerve cell differentiation in nerve-free tissue of epithelial Hydra from precursor cells introduced by grafting. Dev. Biol. 172 (1), 170-181 (1995).
- Miljkovic-Licina, M., Chera, S., Ghila, L., Galliot, B. Head regeneration in wild-type hydra requires de novo neurogenesis. Development. 134 (6), 1191-1201 (2007).
- Wenger, Y., Buzgariu, W., Galliot, B. Loss of neurogenesis in Hydra leads to compensatory regulation of neurogenic and neurotransmission genes in epithelial cells. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (20150040), (2015).
- Campbell, R. D., Josephson, R. K., Schwab, W. E., Rushforth, N. B. Excitability of nerve-free Hydra. Nature. 262, 388-390 (1976).
- Takaku, Y., Hwang, J. S., et al. Innexin gap junctions in nerve cells coordinate spontaneous contractile behavior in Hydra polyps. Sci. Rep. 4 (3573), (2014).
- Marcum, B. A. Culturing Epithelial Hydra. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 287-290 (1983).
- David, C. N. A quantitative method for maceration of Hydra tissue. Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 171, 259-268 (1973).
- Gröger, H., Schmid, V. Larval development in Cnidaria: A connection to Bilateria. Genesis. 29 (3), 110-114 (2001).
- Lenhoff, H. M. Water, Culture Solutions, and Buffers. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 29-34 (1983).
- Shenk, M. A., Bode, H. R., Steele, R. E. Expression of Cnox-2, a HOM/HOX homeobox gene in hydra, is correlated with axial pattern formation. Development. 117, 657-667 (1993).
- Böttger, A., et al. Horizontal Gene Transfer Contributed to the Evolution of Extracellular Surface Structures: The Freshwater Polyp Hydra Is Covered by a Complex Fibrous Cuticle Containing Glycosaminoglycans and Proteins of the PPOD and SWT (Sweet Tooth) Families. PLoS One. 7 (12), (2012).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Dev. Biol. 13 (8), (2013).
