Summary
Bölücü hücreleri öldüren bitki kaynaklı bir toksin olan kolşisinle çift tedaviyle sinirsiz Hydra vulgaris üretilebilir. Bu Hydra tek başlarına beslenemez veya yemez. Bu yazıda, sinirsiz Hydra vulgaris'in laboratuarda uzun süreli bakım için geliştirilmiş bir yöntem anlatılmaktadır.
Abstract
Hydra'nın interstisyel hücre dizisi multipotent kök hücreler ve bunların türevlerini içerir: bez hücreleri, nematositleri, germ hücreleri ve sinir hücreleri. İnterstisyel hücreler bölme hücrelerini öldüren bitki kökenli bir toksin olan kolşisinle iki ardışık muamele ile ortadan kaldırılabilir, böylece interstisyel kök hücrelerden türetilen farklılaşmış hücrelerin yenilenme potansiyelini ortadan kaldırır. Bu, sinir hücrelerinden yoksun Hydra üretimini sağlar. Bir sinirsiz polip, ozmotik basıncı beslemek, beslemek veya düzenlemek için ağzını açamaz. Ancak bu tür hayvanlar düzenli olarak zorla beslenir ve buruşurlarsa hayatta kalabilir ve süresiz laboratuvarda kültürlenebilir. Sinir hücrelerinin olmaması sinir sisteminin hayvan davranışını ve yenilenmesini düzenleyen rolünü araştırmaya olanak tanır. Sinirsiz Hidra bakımı için önceden yayınlanmış protokoller, elle çekilen mikropipet ile ağız-pipetleme gibi eski tekniklereHydra'yı beslemek ve temizlemek için ips. Burada, sinirsiz Hydra'nın bakımı için geliştirilmiş bir protokol getirildi. İnce uçlu forseps ağzını açmaya zorlamak ve yeni öldürülen Artemia eklemek için kullanılır. Zorla beslemeyi takiben, hayvanın vücut boşluğu burada "burping" olarak anılacak olan, sindirilmemiş malzemenin çıkarılması için bir şırınga ve hipodermik iğne kullanılarak taze ortam ile yıkanır. Forseps ve şırınga yardımıyla sinirsiz Hydra'yı kuvvetle besleyen ve buruşturan bu yeni yöntem, elle çekilen mikropipet uçları kullanarak ağız-pipetleme ihtiyacını ortadan kaldırır. Böylece işlem daha güvenli ve önemli ölçüde zaman kazandırır. Hipostomdaki sinir hücrelerinin ortadan kaldırılmasını sağlamak için, anti-tirosin-tubulin kullanılarak immünohistokimyasal işlem yapılır.
Introduction
Hydra'nın sinir sistemi, her iki epiteliyal doku katmanı 1 ile ilişkili sinir hücrelerinden oluşan bir sinir ağından oluşur. Sinir ağı hipostom ve pedunkülde yoğunlaşır ve vücut kolonu 2'de daha az yoğun olur. Sinir hücreleri, sekresyon hücreleri, nematositleri, germ hücreleri ve nöronları oluşturan multipotent kök hücreler olan interstisyel kök hücrelerden kaynaklanır 1 . Bölücü hücreleri öldüren bitki kaynaklı bir toksin olan kolşisin 3 , 4 ile tedavi ederek Hydra vulgaris'in interstisyel hücrelerini ortadan kaldırmak mümkündür. Kolşisin, diğer organizmalarda mikrotübül polimerizasyonunu inhibe ettiği tespit edilmesine rağmen, bir önceki çalışmada, tüm tedavi boyunca Hydra'da mikrotübüllerin bulunduğunu ve bu da kolchisinin Hydra 3'de bu şekilde davranmadığını ortaya koymuştur. Başka bir stUdy, Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas ve Schizosaccharomyces pombe gibi bazı organizmalarda kolşisin tübüline etkili bir şekilde bağlanmadığını ve bu farkı açıklayabileceğini önermektedir. Kolşisin tedavisi interstisyel hücrelerin endoderm epitel hücreleri 3 tarafından fagositozunu indükler ve böylece sinir hücreleri, bez hücreleri ve nematositlerden yoksun olan hayvanların yaratılmasına izin verir. İnterstisyel hücrelerin neden özellikle kolşisin tedavisine duyarlı olduğu belirsizdir. Hem post-mitotik interstisyel hücreler hem de interstisyel kök hücre dizisi hasar görmüş ve fagositozlanmış olduğu göz önüne alındığında, Campbell, kolşisin mitotik aktiviteyi doğrudan etkilemediği sonucuna varmıştır3. Özellikle, kolşisin tedavisi Hydra vulgaris'de iyi işliyor ancak Hydra oligactis 6 gibi diğer türlerde de çalışmadığı gösterilmiştir . Hydra viridis 7'yi üretmek için kolşisin ve hidroksiüre ile değiştirilmiş bir tedavi kullanılabilir. Sinirsiz Hidra (bazen "epitel Hydra " 8 olarak da ifade edilir) doku homeostazı ve rejenerasyonundaki interstisyel hücre soylarından bu özel hücre tiplerinin rollerini incelemek için yararlı bir araçtır.
Hidra , sinir sistemi olmadan yaşayabilen, bilinen tek hayvan örneği olabilir. Sinirsiz Hidra , Hydra rejenerasyonunu, homeostazı ve davranışı düzenleyen sinir ağı rolünü kesmek için özellikle yararlı bir model olarak hizmet eder. Örneğin, interstisyel hücrelerin sinirsiz Hidra'ya greft yoluyla verilmesi, sinir hücrelerinin farklılaşmasının karakterize edilmesi için oldukça bölgeye özel 9 sağlar . Dahası, sinirsiz Hydra yeniden üretebilir, çünküAlternatif, sinir sisteminden bağımsız rejenerasyon yolaklarının araştırılmasını mümkün kılmaktadır. Böyle bir örnek, vahşi tip Hydra'da sinir sisteminde cnox-2 fonksiyonuna bağlı olduğu gösterilmiş olan apikal nevrojenez ve kafa oluşumudur, ancak sinirsiz Hydra'da vazgeçilmez görünmektedir ve alternatif bir kafa rejenerasyon işlemi olabileceğini düşündürmektedir 10 .
Sinirsiz Hidra ayrıca nörojenezin 11 kaybı sonrası epitel hücre ekspresyonunu ve nörojenik ve nörotransmisyon genlerinin düzenlenişini incelemek için kullanılmıştır. Sinirsiz Hidra spontan kontraksiyon patlamaları 12 göstermez, bu patlamaların sinir sistemi tarafından düzenlendiğini gösterir. Bununla birlikte, sinirsiz Hydra vücut sütununu forsepsle tutarak yanıt olarak kontrendikçe, mekanik uyarılara yanıt olarak daralmanın bağlanma yoluyla sağlandığını düşündürmektedirGh boşluk kavşakları, spontan kontraktil davranış ise sinir hücrelerindeki boşluk kavşaklarından geçerek sağlanır 13 .
Sinirsiz Hidra ağızlarını yiyecek veya azalan glutatyon 3 ile birlikte açtığınızda açmaz; bu, duyusal nöronların gıdaların mevcudiyetini tespit etmek ve ağzın açılması için sinyal vermesi gerektiğini gösterir. Buna ek olarak sinir ağı, ozmotik basıncın algılanmasında bir rol oynuyor gibi görünmektedir, çünkü sinirsiz hayvanlar kendi ağızlarındaki açılma yoluyla iç hidrostatik basıncını özerk bir şekilde kontrol edememektedir, bu da karakteristik balon benzeri görünümünü 3 , 4'e çıkarmaktadır ( Şekil 1B ). Sinirsiz Hidraktaki hidrostatik basıncın sık manuel deflasyonla düzenlenmesi hipostome ve vücut kolonunda bazı anormal morfolojilerin kaybına neden olmuştur. Bununla birlikte, kronik deflasyon büyümeye müdahale etmiştir.Tomurcuklanma ve doku organizasyonu 8 .
Her ne kadar sinirsiz Hydra kendi başlarına beslenemez ve üreyemezse de, her hayvanı elle zorla besleyip burping ederek laboratuvarda süresiz olarak korumak mümkündür. Önceki yayınlar, sinirsiz Hydra'nın zorla beslenmesi ve buruşturulması yöntemlerini tarif etmiştir, ancak bu protokoller elle uygun boyuta çekilmesi gereken mikropipet uçlarının yanı sıra pipete 14 boruyla bağlanmış bir ağızlığın kullanılmasıyla ilgilidir. Burada, daha basit, daha güvenli ve daha zamandan tasarruf sağlayan besleme ve burping yöntemi anlatılmıştır.
Buna ek olarak, daha önceki çalışmalar, sabit hayvanların bireysel hücrelere ayrılması ve hücre morfolojisinin incelenmesi yoluyla 3 , 4 , 15 nolu sinir hücrelerinin yokluğunun kontrol edilmesini içermektedir. 'HHipostomda nöronların tükenmesini kontrol etmek için makulasyon için tamamlayıcı bir yöntem olarak alfa-tübülinin tirozin karboksil terminaline karşı bir monoklonal antikor ile immünohistokimya kullanılmıştır 13,16. Önceki çalışmalar, pedanküldeki nöronların da bu antikor 13 kullanılarak görselleştirilebileceğini göstermiştir, ancak bu nöronların yanı sıra vücut kolonundaki nöronların da bulunması daha zordur. İmmünohistokimya hipostomdaki sinir hücrelerinin yokluğunu teyit etmek için yeterlidir ve hücre tipi morfolojide uzmanlık gerektirmezken, interstisyel kök hücrelerin ve bu hücrelerin diğer türevlerinin yokluğunu kontrol etmek için kullanılamaz. Ayrışma ve hücre morfolojisi çalışmaları daha titizdir ve tedavinin her aşamasından sonra kalan her hücre türünün sayısal bir hesabını verebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Çift Kolşisin Tedavisi
- Hydra medium 3 , 4 , 17'de % 0.4 kolşisin (ağırlık / hacim) solüsyonu yapın.
Dikkat: Kolşisin akut toksiktir, yutulduğunda ölümcüldür, genetik kusurlara neden olabilir ve göz hasarına neden olabilir. Tozu bir duman davlumbağında tutun ve eksiksiz Kişisel Koruyucu Donanım (PPE) giyin. - Karpitte oda sıcaklığında 8 saat süreyle bir Petri kabında kolşisin solüsyonu mL'si başına 5 Hydra oranında% 24'lük kolşisin içinde 24 saat aç bırakılan Hydra vulgaris'i (burada AEP türü kullanıldı) inkübe edin.
Not: 5 Hydra / mL kolşisin, Hydra ile çanak kalabalıktan kaçınmak için ne kadar çözüm bulunacağını belirlemek için bir kılavuzdur. Sonraki temizleme ve çözüm değişiklikleri için aynı çözelti hacmini kullanın. - Kolşisin solüsyonunu çıkarın ve yerine koyun.Kolchicine içermeyen temiz Hydra ortamı ile. Hydra ortamında 50 μg / mL rifampisin'e aktarmadan önce, bir cam Pasteur pipetiyle seri bir transferle temiz Hydra ortamına 5 kez Yıkayın. Hydra'yı 18 ° C inkübatörde saklayın.
Not: 1-2 haftalık tedavi için dimetil sülfoksid (DMSO) içinde yeterli 1.000X rifampisin stoğu (50 mg / mL) 4 ° C'de saklanabilir. Kesin miktar, her gün kullanılan toplam çözelti hacmiyle belirlenebilir. Örneğin her biri günde iki kez değiştirilmesi gereken 10 mL solüsyon içeren 2 yemek varsa, günde bir 1000X stoktan 40 μL veya 560 μL'ye tekabül eden toplam 40 mL solüsyon kullanılacaktır Iki haftalık bir süre zarfında. Stok, daha sonra, kullanım üzerine Hydra ortamında 1: 1000 oranında seyreltilir.
Dikkat: DMSO yanıcı bir sıvıdır ve cilde kolayca nüfuz eder ve vücuda diğer çözünmüş kimyasallara izin verir. ElSolventi duman kaputunda tutun ve tam KKD giyin. Not, DMSO 4 ° C'de donar - Rifampisin içeren Hydra maddesini, günde iki kez değiştirin, Hydra , hücreleri ortamdan çıkardığı sürece genellikle tedaviden 1 hafta sonrasına kadar durdurun. Bu noktada, orta günlük olarak değiştirilebilir. Tedaviyi takip eden günlerde Hydra , elindeki dokunduruklarını tamamen kaybedecektir. Birbirlerine kaynaştırabilir ve tuhaf şekilli Hydra ile sonuçlanacak şekilde, Hydra'yı birbiriyle temastan kaçının ( Şekil 2 A ).
- Temas etmesini önlemek için çanağı dairesel hareketlerle döndürmeyin. Bunun yerine, Hydra ayrılıncaya kadar çanağı dikey ve yatay yönde hafifçe çalkalayın. Hydra'yı 18 ° C inkübatöre yerleştirdikten sonra kabı muayene edin ve gerektiği gibi ayarlayın.
Not: Ortamın iki kez değiştirildiği günler için ortamı değiştirinSabah bir kez ve öğleden sonra / akşam tekrar.
- Temas etmesini önlemek için çanağı dairesel hareketlerle döndürmeyin. Bunun yerine, Hydra ayrılıncaya kadar çanağı dikey ve yatay yönde hafifçe çalkalayın. Hydra'yı 18 ° C inkübatöre yerleştirdikten sonra kabı muayene edin ve gerektiği gibi ayarlayın.
- Tendak oluşmaya başladıktan sonra, haftada 3-4 kez Hydra'yı zorla besleme ve buruşmaya başlayın (bkz. Bölüm 2 ve 3). Kolşisin tedavisini takiben yaklaşık 8-9 gün içinde Hydra , ellerini geri almaya başlayacak.
Not: Tentacle yeniden büyüme bireyler arasında değişir. Bazıları, tentacle büyüme belirtileri göstermeden önce 8 - 9 gün daha uzun sürebilir. Duyularını yeniden canlandırmayan ve garip bir şekilde şekillendirilmiş olan ( Şekil 2 B ) hayvanlar veya beslenemeyecek kadar küçük hayvanlar kaldırılmalıdır. Bu Hydra , muhtemelen ikinci tedaviden sağ kalamayacak. Hydra da tomurcuklanabilir. Bununla birlikte, tomurcuklardan bazılarının hala interstisyel hücreleri olabilir ve kendi başına yiyebilirler.- Destek almadan yiyebilecek ve ana hayvandan ayrışabilen tomurcukları çıkartın. Canlı Artemia'yı bu canlılara ekleyerek bu hayvanları tanımlayın.Çanağı beslemek ve hayvanların Artemia'yı kendi başına yakalayıp yemediklerini gözlemlemek. 1 veya 2 Hydra kendi başına yiyebilir. Bunlar da atılmalıdır.
Not: Sinirsiz Hidra , karakteristik bir balon benzeri morfolojiye ve normalden daha kısa ve daha incedir (nematosit kaybına bağlı olarak) olan dokunaçlara sahiptir ve bu nedenle kolayca normal görünümlü hayvanlardan ayırt edilebilir ( Şekil 1A, 1B ).
- Destek almadan yiyebilecek ve ana hayvandan ayrışabilen tomurcukları çıkartın. Canlı Artemia'yı bu canlılara ekleyerek bu hayvanları tanımlayın.Çanağı beslemek ve hayvanların Artemia'yı kendi başına yakalayıp yemediklerini gözlemlemek. 1 veya 2 Hydra kendi başına yiyebilir. Bunlar da atılmalıdır.
- İlk kolşisin tedavisinden üç hafta sonra, kolşisin tedavisini tekrarlayın (adım 1.1 - 1.5). Geride kalan interstisyel hücreleri ve sinir hücrelerini ortadan kaldırmak için ikinci bir kolşisin tedavisi gereklidir 3 .
2. Kuvvet Besleme
- Artemia kistlerini, daha daralacak dar ve uzun bir cam kaba ekleyin. Kabı Artemia su (6.72 M NaCl) ile doldurun. Exce'den kaçınınDaha yüksek bir kapak verimliliği için 1 L suya 1 g kist oluşturur.
- Konteynerin üstünü parafilm ile örtün ve parafilm yoluyla kutuya 10 mL'lik bir serolojik pipet yerleştirin. Bir akvaryum hava pompasına boru bağlayarak ve boruyu pipetin etrafına takarak havalandırma sağlayın. Pipet ucunun kabın tabanına ulaştığından ve alt kısmına hiçbir kist yerleşmediğinden emin olun. Artemia 48 saat sonra açılacak.
Not: Artemia'yı açmanın , aynı şekilde işe yarayacak birçok farklı yolu vardır.
- Konteynerin üstünü parafilm ile örtün ve parafilm yoluyla kutuya 10 mL'lik bir serolojik pipet yerleştirin. Bir akvaryum hava pompasına boru bağlayarak ve boruyu pipetin etrafına takarak havalandırma sağlayın. Pipet ucunun kabın tabanına ulaştığından ve alt kısmına hiçbir kist yerleşmediğinden emin olun. Artemia 48 saat sonra açılacak.
- Bir Artemia ağında Artemia suyundan Artemia suyundan Strain (akvaryum tedarik şirketlerinden temin edilebilir) ve onları Hydra ortamı içeren bir çanağa koymadan önce yaklaşık 20 saniye boyunca DI suda yıkayın. Artemia suyunun tuzluluğu Hydra için çok yüksektir, bu nedenle Artemia kullanılmadan önce yıkanmalıdır.
- Bir diseksiyon mikroskopu altında,Artemia'yı bir çift ince forsepsle hafifçe sıkarak euthanize edin. Bağırsakları atmak için yeterince sert sıkmayın, çünkü bu forseps'e yapışacak ve beslemeyi zorlaştıracaktır. Artemia'yı Hydra'ya vermeden önce hafifçe sıkıştırmak sindirim sürecinde yardımcı olacaktır 14 . Hızlı bir şekilde beslenmeyi kolaylaştırmak için yeni öldürülmüş Artemia'yı çanak içindeki Hydra'nın yakınına yerleştirin.
Not: Sonraki tüm basamaklar bir diseksiyon mikroskopu altında yapılır. - Hydra'yı pedanküle tutmak için bir çift forseps kullanın. Hydra'yı besleme işlemi sırasında pedikül tutmaya devam edin. İkinci bir forseps kullanarak, Hydra sözleşmesini yapmak için vücut sütununu sıkıştırın.
- İkinci forseps ucunu birlikte tutarken hipostomun merkezine dokunun (hayvanın ağız ucundaki kubbeli yapı). Bu bazen ağzın açılmasına neden olur. benF ağza dokunarak açılmıyorsa, forospu hipostomun merkezine ekleyerek ağzı delin ve ardından forsepsin uçlarındaki basıncı hafifçe bırakın. Bu, ponksiyondan yapılan ağız açıklığını uzatmalıdır.
Not: Ağız açıldığında Hydra sönebilir ve çökebilir ( Şekil 2 C ). Bu gerçekleşirse, Artemia hala Hydra'ya sokulabilir. Bunu yapmak çok zorsa, bir sonraki Hydra'ya geçin ve bir süre sonra orijinal Hydra'ya dönün ve tekrar deneyin. Hydra, müteakip ağız açıklıklarında o kadar fazla havalandırma eğiliminde değildir. - Artemia'yı forsepsle çabucak kaldırın ve onları Hydra'nın mide boşluğuna sokun. Mide boşluğu dolana kadar Artemia'yı olabildiğince çok takın ve Artemia Hydra'ya zarar vermeden yerleştirilemez, kazaMüttefiki içerideki herhangi bir Artemi'yi çekip çıkarmak veya ağzın kapanmasını önlemek. Ortalama olarak, bu 5 - 6 Artemia , ancak 12'ye kadar olanı büyük hayvanlara besleniyor.
- Ağız kapanmaya başlarsa, yukarıda açıklandığı gibi forsepsle tekrar gerin; Bununla birlikte, hayvanın içindeki Artemia ağız yeniden açıldığında çıkmaya başlayabileceği için dikkatli olunmalıdır.
- Hydra bütün bir Artemia için çok küçükse Artemia'yı bir neşter yardımıyla kesip Hydra'yı daha küçük parçalara koyun. Artemia Hydra'nın içinde kalmazsa forsepsleri Artemia'ya karşı basarak ağzı kapatana kadar Hydra'nın içinde tutmak gerekebilir.
- Hydra ortamında taze 50 μg / mL rifampisin içeren bir çanağa yanlışlıkla buruşturmayı önlemek için dikkatli bir şekilde cam Pasteur pipetiyle birlikte Hydra'yı gönderin. Bir Artemia kovulduysaTransfer ederken Hydra'yı yeni yemeğe getirirken tekrar takın.
Not: Hidra'yı plastikle karşılaştırıldığında camın camdan daha az yapıştığını tespit ettiği için, bir cam pipetle Hydra aktarılır. Pipet uzunluğu önemli değil, ancak 5 inç pipetler kullanmak biraz daha kolay olabilir.
3. Burping
- Beslenmeden 8 ila 20 saat sonra herhangi bir zamanda sindirilmemiş materyali gidermek için Hydra'yı yırtın.
- İpucu düz olana kadar P320 veya benzeri kum zımpara kağıdıyla 30G'lik bir hipodermik iğne noktasını kumlayın.
Not: 27G derialtı iğne de işe yarayabilir, ancak yüksek göstergenin küçük ucu tercih edilir. - İğneyi tek kullanımlık 1 mL plastik şırınga üzerine takın ve şırıngayı Hydra ortamında taze 50 μg / mL rifampisin ile doldurun.
Not: Tek bir Hidra atmak, 0,05 mL ila 0.1 mL çözeltiyi alır. 1 mL syriDaha büyük hacimli bir şırınga ile ortaya çıkan solüsyonun kuvvetini ve hacmini kontrol etmek daha zor olduğundan nge tercih edilir. - Bir diseksiyon mikroskopu altında, ince noktalı forseps ile Hydra pedankül tutun ve iğne ile hipostom merkezinde dokunun. Ağız açılmazsa, hipospata püskürtücüler sokun ve yukarıda tarif edildiği gibi ağzını besleme için açın.
Not: Sonraki tüm basamaklar bir diseksiyon mikroskopu altında yapılır. - Tüm hayvanın, mide boşluğunun, 50 mikrogram / mL rifampisin solüsyonuyla, tüm artıklar atılıncaya kadar üflenmesini önlemek için, şırıngayı boşaltmak için hafifçe yıkayın. Hidra ölçüsü izin vermiyorsa, iğnenin mutlaka Hydra'ya sokulması gerekmez. İğne, ağız açıklığına yakın tutulabilir ve doğrudan ağza doğru işaret edilebilir.
- Bir cam Pasteur pipet kullanarak, kesilmiş Hydra'yi taze 50'lik bir çanağa aktarın81, g / mL rifampisin, Hydra ortamında.
4. İmmünohistokimya ile Kalite Kontrolü
NOT: Aşağıdaki protokol, Shenk, M.A ve arkadaşlarının protokollerinden adapte edilmiştir . 18 ve Böttger, A 19 . Aksi belirtilmediği sürece, tüm basamaklar oda sıcaklığında (RT) yapılır. Kuluçka adımları için bir besleyici kullanılabilir ve boyama kalitesini artırabilir. Bununla birlikte, Hydra birbirine yapışmış olursa, tüm basamaklar olmadan da yapılabilir.
- Bloke edici çözeltiyi hazırlayın: 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 DMSO. Kullanana kadar bu solüsyonu 4 ° C'de saklayın (adım 4.6 ve 4.11). Çözüm 1 - 2 gün boyunca saklanabilir.
Not: Bu protokolde kullanılan tüm özümler tehlikeli atık olarak doğru bir şekilde toplanmalıdır. - Hydra'yı 200 μL% 2 üretan içinde Relax Hydra m1.7 mL mikrosantrifüj tüpleri içinde 1 dakika süreyle. Sinirsiz , işlenmemiş, birincil antikor kullanılmadan işlenmiş ve ikincil antikorsuz işlem görmemiş halde, tüp başına 5 Hydra kullanın.
Not: 1 dakikanızı aşmayın. Üretkenlikte çok fazla zaman geçtikten sonra hayvanlar kötü şekil alacağından burada zamanlama önemlidir. - Üretanı çıkarın ve Hydra'yı 200 uL% 4 paraformaldehid (PFA) içinde, Hydra ortamında 15 dakika sabitleyin.
- Numuneleri, her biri için 10 dakika boyunca 3 kez 1x PBS ile yıkayın.
Not: PBS ve PBSTx ile yapılan tüm yıkamalar 500 mcL solüsyon ile yapılır. - PBS içinde 500 μL% 0.5 Triton X-100 ile 15 dakika süreyle geçirgen hale getirin.
- % 0.5 Triton X-100'ü çıkarın ve bloke edici çözeltiden 500 μL ekleyin. Numuneleri en az 1 saat boyunca bloke edin.
- Bloke edici çözeltide anti-tirozin-tübülin antikoru 1: 200 seyreltin.
Not: Bu konsantrasyon deDeneysel olarak sona erdirildi. Kontrollerdeki sinyalin çok zayıf olduğu tespit edilirse konsantrasyonun arttırılması gerekebilir. Spesifik olmayan bağlanma varsa, konsantrasyonun azaltılması gerekebilir. Antikorun önceden kuluçkalanması ayrıca, spesifik olmayan bağlanmayı azaltabilir. - Numunelerdeki bloke edici çözeltiyi çıkarın ve primer antikorun 200 μL'ini sinirsiz Hydra'ya , muamele edilmemiş kontrollere ve ikincil olmadan muamele edilmemiş kontrollere ekleyin. Primer olmayan muamele edilmemiş kontroller için, antikor olmaksızın sadece 200 uL engelleyici çözelti ekleyin.
- Numuneleri gece boyunca (> 12 saat) 4 ° C'de inkübe edin.
Not: Alternatif olarak, oda sıcaklığında 5-6 saat inkübe edin. - Birincil antikoru çıkarın ve numuneleri 1x PBS'de (PBSTx)% 0.3 Triton X-100 ile geniş bir şekilde yıkayın.
Not: Birincil antikoru saklayın ve 4 ° C'de saklayın, çünkü en az 2 - 3 kez tekrar kullanılabilir. - Seyreltik keçi anti-fare hP ikincil antibOdaklama 1: 500 engelleme çözümünde. Sinir içermeyen Hydra'ya , muamele edilmemiş kontrollere ve birincil olmayan muamele edilmemiş kontrollere 200 uL ekleyin. İkincil olmayan muamele edilmemiş kontroller için, sadece antikor olmadan 200 uL engelleyici çözelti ekleyin.
Not: Alternatif olarak, flüoresans sekonder antikor kullanılabilir, bunun için 4.13 - 4.17 basamaklarına ihtiyaç yoktur. Bir flüoresan ikincil kullanmak zaman tasarrufu sağlar ve genellikle yeterli ancak hP ikincil artan hassasiyet sağlar. İkincil konsantrasyon deneysel olarak belirlendi. Kontrollerdeki sinyaller çok zayıfsa, konsantrasyonun arttırılması gerekebilir. Spesifik olmayan bağlanma varsa, konsantrasyonun azaltılması gerekebilir. - Örnekleri gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- İkincil antikoru çıkarın ve numuneleri PBSTx ile yoğun bir şekilde yıkayın.
- 1x PBT hazırlayın: 1x PBS içinde% 0,2 sığır serumu albumin (ağırlık / hacim) ve% 0.05 Tween20. Bunları kuluçkalayın30 dakika boyunca 1x PBT'de amples.
- 1x PBT'yi çıkarın ve karanlıkta 15 dakika 1x PBT'de 1: 1000 NHS-floresein ve 1: 10,000 H 2 O 2 içindeki örnekleri inkübe edin. Işıklara maruz kaldıkça flüoresan sinyali düşeceğinden, bu adımdan itibaren örnekleri mümkün olduğunca karanlıkta tutun.
Not: NHS-floresein, ayrıntılı bir FISH protokolünü takiben King, RS ve Newmark, PA 20 - Numuneleri PBSTx ile hızlı bir şekilde 3 kez, daha sonra 30 dakika boyunca 2 kez yıkayın.
- Yıkamaya devam etmek için numuneleri PBSTx'de gece boyunca 4 ° C'de bırakın.
- 1x PBSTx ile birkaç kez daha yıkayın. Hücrenin çekirdeklerini görselleştirmek için, 4 ', 6-diamindino-2-fenilindol, dihidroklorür (DAPI) kullanılarak DNA saykırması için aşağıdaki opsiyonel adımları uygulayın. Aksi halde, numuneler şimdi görüntülenecektir.
- PBSTx'de 5 mg / mL DAPI stokunu 1: 500'lük bir konsantrasyona seyreltin ve her tüpe 200 uL ekleyin. incuÖrnekleri 30 dakika bekletin.
Dikkat: DAPI bilinen bir kanserojendir. Tam KKD giyin. - DAPI kaldırın ve floresan mikroskopi ile görüntüleme önce numuneleri PBSTx ile 2-3 kez yıkayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İlk 8 saatlik kolşisin tedavisinin hemen ardından, tüm Hydra hayatta kalır. Bu Hydra'lardan bazıları sadece benekli tutacaklara sahip olacak ( Şekil 3 A ), diğerleri dokunaçlarını tamamen tükettiler ( Şekil 3 B ). Sonraki 1 veya 2 gün içinde, tüm Hydra'nın elindeki dokunma duyularını kaybedene kadar dokunaçlar küçülmeye devam edecek. Tedaviyi takip eden yaklaşık 1 hafta içinde, Hydra , dokunaçlarını tam olarak yenilemeden önce dokunaçlar gibi küçük saplama ( Şekil 3 C ) ile dokunaçlı yeniden oluşma belirtileri gösterecektir ( Şekil 3 D ). Orijinal Hydra'nın yaklaşık% 50-60'ında sonunda dokunuşları tedaviden 1-2 hafta sonra tekrar oluşuyor.
SEcond tedavisinde, hayvanların iyileşmesi ilk tedaviden sonraki iyileşme ile benzerdir. Böylece, her iki tedaviye giren orijinal hayvan sayısının yaklaşık% 10'u toparlar ve deney için uygun bir boyuta gelir ( Şekil 1 B ). Bu Hydra , işlenmemiş hayvanlardan daha ince görülen, daha şeffaf olan dokuları vardır ve ozmotik basıncı hafifletmek için ağızlarını açamama nedeniyle şişmiş görünen dokunma duyularına sahiptir ( Şekil 1 A , 1B). Beslenmeyen tüm hayvanlar birkaç hafta hayatta kalabilirler, ancak beslenemeyen hayvanlar küçülür ve beslenmesi gittikçe zorlaşır.
İkinci tedaviyi takiben iyileşen hidra süresiz olarak muhafaza edilebilir. Bu hayvanlar tomurcuklanmakta, böylece nüfusu devam ettirmekte ve büyümektedirler. Ayrıca, nüfus yetiştirilebilirBu hayvanları kesip yeniden canlandırarak 4 .
İmmunohistokimya, ikinci kolşisin tedavisinden sonra hipostomdaki nöronların kaybedildiğini doğrulamaktadır. Hipostomdaki yoğun sinir ağı bir anti-tirosin-tubulin antikoru 13 , 16 kullanarak görselleştirilebilir ve ağızdan ve belirgin hücre cisimlerinin dışına yayılan farklı lifleri gösterir ( Şekil 4 A ). Bu lifler, kolşisin ile çift işleme tabi tutularak üretilen sinirsiz Hidra'da yoktur ( Şekil 4 B ). Ayrıca, DAPI ile birlikte boyama, kolşisin tedavilerinin bir sonucu olarak interstisyel hücre soylarının hücrelerinin kaybına bağlı olarak, tedavi edilmemiş kontrollere kıyasla, sinirsiz Hidra'da azalan hücre çekirdeği sayısını ortaya çıkarmaktadır ( Şekil4 A, 4B ).
Şekil 1 . Sinirsiz ve Tedavi Edilmemiş Hidraların Karşılaştırılması .
(A) Tedavi edilmemiş Hydra . (B) İkinci kolşisin tedavisinden 22 gün sonra sinirsiz hidra . Şişmiş vücut kolonunu ve sinirsiz hayvandaki ince dokunaçları not edin. Ölçek çubukları 500 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 . Şekli Değiştirilmiş Hidra Örneği .
(A) İki Hidra (B) Tuhaf şekilli bir Hydra . (C) Ağzı açıldıktan sonra sönmüş bir hidra . Ölçek çubukları 400 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 . İlk 8 saatlik Kolşisin Tedavisini İzleyen Hydra Temsilcisi Görüntüleri.
(A) Tedaviden hemen sonra kalın dokunaçlı bir Hydra . (B) Tedaviden hemen sonra eldivenlerini tamamen kaybetmiş bir Hydra . (C) Tedaviden 8 gün sonra onun dokularını yeniden canlandırmaya başlayan bir Hydra . (D)Tedaviden 13 gün sonra onun dokularını tamamen yeniden kıvranan bir Hydra . Ölçek çubukları 400 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 . Hipostomdaki Sinir Hücrelerinin Kaybı, İmmunohistokimyasal Yöntemle Teyit Edilebilir.
(A) (i) anti-tirosin-tübülin antikoru ve (ii) DAPI ile etiketli, ikinci kolşisin tedavisinden yaklaşık 2 hafta sonra, tedavi edilmemiş bir Hidra hipostomu ve (B) sinirsiz bir Hydranın hipostomu. (Iii) yer paylaşımını gösterir. *, Ağzın yerini belirtir. Maksimum z projeksiyonları, e ile alınan dönen disk konfokal floresan z istiflerinden yapıldı.Xposures 500 ms (GFP) ve 15 ms (DAPI). Parlaklık ve kontrast görünürlüğü artırmak için ayarlandı. Ölçek çubukları 20 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hydra interstisyel hücreler, çift kolşisin tedavisi 3 , 4 ile ortadan kaldırılabilir. İlk tedaviyi izleyen günlerde, Hydra parçalarının deforme olmuş Hydra'ya kaynaşmasını önlemek için bireysel Hydra arasındaki temastan kaçınmak önemlidir. Ayrıca, ilk tedaviyi takiben yiyebilen hayvanlar kaldırılmalıdır çünkü ikinci kolşisin tedavisi bu tür hayvanlardan kalan interstisyel hücreleri ortadan kaldırmak için yeterli olmayabilir. İkinci kolşisin tedavisinden sonra sinirsiz Hydra'nın hayatta kalma oranını en üst düzeye çıkarmak için, hayvanlar, ilk tedaviden sonra mümkün olduğunca çok Artemia ile beslenmelidir; beslenmeler arasında 1-2 gün arasında iyileşme ve büyüme sağlanmalıdır. Her bir kolşisin tedavisi, hücrelerin alınmasıyla birlikte Hydra'nın büyüklüğünü önemli ölçüde azaltır, bu nedenle Hydra'nın her tedaviden önce ne kadar büyük olduğu bHydra'nın beslenebileceği ve muhafaza edilebilecek bir büyüklüğe kavuşması ihtimalini ortadan kaldırın.
Her tedaviden sonra Hydra'nın hayatta kalma oranının düşük olması nedeniyle birçok Hydra ile başlamak arzu edilebilir. Bununla birlikte, aynı anda çok fazla Hydra'ya tedavi başlatılması konusunda dikkatli olunmalıdır. Bu, ilk tedaviyi takiben beslenmeyi zorlaştırır ve çok zaman alıcıdır. İlk tedaviden sonra iyi beslenen hayvanlar daha büyük boyutlara ulaşırlar ve bu nedenle ikinci tedaviden sonra daha yüksek sağkalıma sahiptirler. Bu nedenle, daha azıyla başlamak ve daha iyi beslenmeye odaklanmak daha üretken olabilir. Genel olarak, 50 - 100 hayvandan başlayarak 1-2 kişiye kadar yönetilebilir. En iyi Hydra ile başlamak en iyisidir, çünkü bunlar iki tedaviden daha iyi kurtulacaktır.
Burada açıklanan sinir hücrelerinin eksik olduğu Hydra'nın zorla beslenmesi ve buruşturulması yöntemi, daha güvenli, basit ve daha fazla zamanGeçmişte açıklanan yöntemlere göre verimli, 3 , 4 , 14 . Piyasada satılan forsepslerin ve şırıngaların kullanılması elle çekilen mikropipet uçlarının gereğini ortadan kaldırır, bu da zaman alıcı ve yapmak zordur. Bu araçların kullanımı da ağız-pipet ihtiyacını ortadan kaldırır. Forseps kullanarak zorla besleme ilk bakışta zor olabilir, ancak yeterli zaman ve uygulama göz önüne alındığında, oldukça kolay ve verimli hale gelir. Önce, aletlerle ne kadar güç kullanılacağı ve Hydra'yı nasıl manipüle edebileceğini hissetmek için, normal yutmayı beslemek ve buruşmak için pratik yapmalıdır. Çeşitli forsepsler ve iğne ebatları, kuvvet besleme ve burping için en uygun aletleri bulmak için test edildi.
Burada tarif edildiği gibi antikor boyanın kullanılması hipostomdaki sinir hücrelerinin yokluğunu kontrol etmek için yeterlidir. Tüm interstisyel hücrelerin ortadan kaldırılmasını sağlamak için, hayvanlara maceralı hale getirilebilir veMevcut hücrelerin türleri incelenebilir 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar, şırınga ve iğne tekniğine uyum konusunda yardım için sinirsiz hayvanlar üretmek ve sürdürmek için orijinal protokol olan Bayan Rui Wang ile Bayan Danielle Hagstrom ve Dr. Rob Steele'in görüşleri için Dr. Dick Campbell'e (UC Irvine) teşekkür ederler. (UC Irvine) el yazması üzerine yorumlar. Bu çalışma RCSA ve NSF hibe CMMI-1463572 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 mL Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X - 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 mL Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
References
- Bode, H. R. The interstitial cell lineage of Hydra: a stem cell system that arose early in evolution. J. Cell. Sci. 109, 1155-1164 (1996).
- Hager, G., David, C. N. Pattern of differentiated nerve cells in hydra is determined by precursor migration. Development. 124, 569-576 (1997).
- Campbell, R. D. Elimination of Hydra interstitial and nerve cells by means of colchicine. J. Cell. Sci. 21, 1-13 (1976).
- Marcum, B. A., Campbell, R. D. Development of Hydra lacking nerve and interstitial cells. J. Cell. Sci. 29, 17-33 (1978).
- Burns, R. G. 3H-colchicine binding: Failure to detect any binding to soluble proteins from various lower organisms. Exp. Cell. Res. 81, 285-292 (1973).
- Lee, H. -T., Campbell, R. D. Development and Behavior of an Intergeneric Chimera of Hydra (Pelmatohydra oligactis Interstitial Cells Hydra attenuata Epithelial Cells). Biol. Bull. 157 (2), 288-296 (1979).
- Novak, P. Preparing Hydra viridis with Nerve Cells and No Interstitial Cells, or with Neither of These Cell Types. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 295-297 (1983).
- Wanek, N., Marcum, B. A., Lee, H. -T., Chow, M., Campbell, R. D. Effect of hydrostatic pressure on morphogenesis in nerve-free Hydra. J. Exp. Zool. 211, 275-280 (1980).
- Minobe, S., Koizumi, O., Sugiyama, T. Nerve cell differentiation in nerve-free tissue of epithelial Hydra from precursor cells introduced by grafting. Dev. Biol. 172 (1), 170-181 (1995).
- Miljkovic-Licina, M., Chera, S., Ghila, L., Galliot, B. Head regeneration in wild-type hydra requires de novo neurogenesis. Development. 134 (6), 1191-1201 (2007).
- Wenger, Y., Buzgariu, W., Galliot, B. Loss of neurogenesis in Hydra leads to compensatory regulation of neurogenic and neurotransmission genes in epithelial cells. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (20150040), (2015).
- Campbell, R. D., Josephson, R. K., Schwab, W. E., Rushforth, N. B. Excitability of nerve-free Hydra. Nature. 262, 388-390 (1976).
- Takaku, Y., Hwang, J. S., et al. Innexin gap junctions in nerve cells coordinate spontaneous contractile behavior in Hydra polyps. Sci. Rep. 4 (3573), (2014).
- Marcum, B. A. Culturing Epithelial Hydra. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 287-290 (1983).
- David, C. N. A quantitative method for maceration of Hydra tissue. Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 171, 259-268 (1973).
- Gröger, H., Schmid, V. Larval development in Cnidaria: A connection to Bilateria. Genesis. 29 (3), 110-114 (2001).
- Lenhoff, H. M. Water, Culture Solutions, and Buffers. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 29-34 (1983).
- Shenk, M. A., Bode, H. R., Steele, R. E. Expression of Cnox-2, a HOM/HOX homeobox gene in hydra, is correlated with axial pattern formation. Development. 117, 657-667 (1993).
- Böttger, A., et al. Horizontal Gene Transfer Contributed to the Evolution of Extracellular Surface Structures: The Freshwater Polyp Hydra Is Covered by a Complex Fibrous Cuticle Containing Glycosaminoglycans and Proteins of the PPOD and SWT (Sweet Tooth) Families. PLoS One. 7 (12), (2012).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Dev. Biol. 13 (8), (2013).
