Summary
هو بروتوكول لدقة تحديد وتحليل نقاط الاشتباك العصبي في شرائح هيبوكامبال استخدام الفلورة الموضحة في هذه المقالة.
Abstract
في الدماغ، وهي الاشتباكات العصبية المتخصصة الوصلات بين الخلايا العصبية، تحديد قوة وانتشار الإشارات العصبية. وينظم العدد من الاشتباكات العصبية محكم أثناء تطوير ونضوج الخلايا العصبية. الأهم من ذلك، يمكن أن يؤدي العجز في عدد المشبك إلى الخلل المعرفي. لذلك، يتم تقييم عدد المشبك جزءا لا يتجزأ من علم الأعصاب. ومع ذلك، كما نهايات صغيرة وصغيرة جداً في الدماغ سليمة، تقييم العدد المطلق التحدي. ويصف هذا البروتوكول وسيلة تحديد وتقييم نقاط الاشتباك العصبي هيبوكامبال شرائح القوارض باستخدام مجهر الفلورة بسهولة. ويشمل إجراء ثلاث خطوات لتقييم نقاط الاشتباك العصبي في صور المجهر [كنفوكل] عالية الجودة من خلال تحليل التعريب المشارك من البروتينات قبل وبوستسينابتيك في شرائح هيبوكامبال. كما توضح هذه المقالة كيف يتم إجراء التحليل ويعطي أمثلة من نهايات كل ضادات والمثبطة. هذا البروتوكول يوفر أساسا صلبا لتحليل نقاط الاشتباك العصبي، ويمكن تطبيقها على أي بحث التحقيق في هيكل ووظيفة المخ.
Introduction
المخ البشري يتكون من حوالي 1014 نقاط الاشتباك العصبي. وينظم عدد المشبك محكم أثناء تطوير ونضوج الجهاز العصبي المركزي (CNS). في التنمية، وهو التضمين عدد المشبك سينابتوجينيسيس والتقليم لتشكيل الشبكات العصبية الوظيفية. التعلم والذاكرة معتمدة من اللائحة رقم المشبك وقوة، وعملية تعرف بالتقوية متشابك والاكتئاب1. الأهم من ذلك تحقيق الاستقرار في نهايات ناضجة ضروري للحفاظ على اتصالات الشبكة العصبية. وعلاوة على ذلك، أبلغ عن العجز في كثافة المشبك في المراحل الأولى من حالات الأعصاب مثل مرض الزهايمر (AD)2. ولذلك، القدرة على دقة تحديد وتقييم عدد المشبك أمر أساسي لتقييم فسيولوجيا الدماغ وعلم الأمراض.
الكثافة القصوى وضغط طبيعة الاشتباكات العصبية تجعل من التحدي لتقدير العدد الدقيق في مناطق الدماغ سليمة. الاشتباكات العصبية الكيميائية في الجهاز العصبي المركزي مصنوعة من اثنين من الخلايا العصبية في ترخيصات الوثيق، مفصولة بشق متشابك3. المحطة الطرفية قبل متشابك، أو بوتون متشابك، يخرج من إكسون وتتكون من حويصلات المتراكمة، التي تحتوي على أجهزة الإرسال العصبية التي تحدد خصوصية المشبك – هما غلوتامات وغاما – حمض أمينوبوتيريك (GABA) ضادات و المثبطة synapses، على التوالي. تحتوي أغشية الحويصلات حويصلية الناقلين محددة لكل ناقل عصبي: غلوتامات حويصلية الناقل (فجلة) الغلوتامات والناقل غابا حويصلية (فجأت) لغابا. المحطة الطرفية بعد متشابك بنية كثيفة جداً يتألف من البروتينات المتعددة، بما في ذلك مستقبلات والتصاق جزيئات البروتينات السقالة. في نهايات عليه، بعد متشابك الكثافة--95 البروتين (مديرية الأمن العام-95) هو الأكثر وفرة سقالة البروتين4، تحوير N-methyl-D-aspartate(NMDA-) عليه ومستقبلات حمض α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (امبا) وظيفة، بينما جيفيرين المراسي المستقبلات المثبطة ل المحطة الطرفية بعد متشابك المثبطة5. إجمالاً، المعونة خصوصية البروتينات إلى ما قبل وما بعد متشابك الأجزاء الأخرى في التمايز وتحديد الأنواع الفرعية المشبك.
يمكن إجراء التقييم لعدد المشبك مع تقنيات مختلفة. الأكثر شيوعاً هو استخدام الميكروسكوب الإلكتروني (م)، الذي يتيح تحليل المشبك في مجالات الاتفاق وسليمة في الدماغ مع تضخم عالية والقرار. ومع ذلك، هذا الأسلوب مكلفة للغاية ويتطلب إعداد نماذج معقدة، ويستغرق وقتاً طويلاً جداً. وتشمل التقنيات الأخرى استخدام صفيف التصوير المقطعي6، الذي لديه عيب رئيسي في أنه يتطلب معدات متخصصة ومكلفة لإجراء التحليل. وعلاوة على ذلك، المعدلة وراثيا خطوط معربا عن علامات متشابك محددة مفيدة في تقييم المشبك رقم7، ولكن توليد خطوط جديدة يمكن أن تكون تقييدية ومكلفة، وقد يؤدي overexpression البروتينات غير المرغوب فيها خارج الهدف تعمل.
بسبب هذه القيود، والبساطة، تقييم العديد من الباحثين عدد المشبك بفحص مستويات البروتين الكلي متشابك. ومع ذلك، يمكن ملاحظة خسارة المشبك قبل إجراء تغييرات كبيرة في البروتين، كنتائج يعيد متشابك الهيكلية في تشتت ترخيصات قبل أو بعد متشابك، مع لا تدهور البروتينات متشابك. وعلاوة على ذلك، هي مستويات البروتين متشابك في الإعلان، انخفاض تنكس المشبك التالية أو موت الخلايا العصبية8،9. التحديد الكمي للمستويات الإجمالية لا تمكن هذا التمييز. وبالتالي، هناك حاجة تطوير طريقة موثوقة وموجودا، ودقيقة لتقييم عدد المشبك في الدماغ.
في هذه المقالة، نحن تصف كيفية تحديد دقة وتحديد العدد من نقاط الاشتباك العصبي باستخدام مجهر الفلورة في شرائح هيبوكامبال الدماغ القوارض. الاشتباكات العصبية تحددها كولوكاليزيشن علامات ما قبل وما بعد متشابك التي تظهر في توزيع الشروريه. ونحن تثبت صحة هذا الأسلوب من خلال دراسة Wnt الإشارات في الدماغ. Wnts بروتينات يفرزها هام لتشكيل والقضاء، والمحافظة على نقاط الاشتباك العصبي. تقلد في فيفو خصم يفرز من تتالي Wnt، ديككوبف-1 (Dkk1)، يؤدي إلى فقدان متشابك ضادات مع الحفاظ على الاشتباكات العصبية المثبطة في الحصين10. علينا توضيح هوية وعدد من الاشتباكات العصبية ضادات والمثبطة في شرائح هيبوكامبال من ماوس الكبار التعبير عن Dkk1 وتسليط الضوء على إمكانية تحويل هذه التقنية إلى أنواع أخرى من الأنسجة/ثقافة الأعمال التحضيرية.
Protocol
تغطي جميع التجارب باستخدام الفئران والجرذان قد أقر وأجريت باستخدام إجراءات الجدول 1 قانون وزارة الداخلية الحيوانات (الإجراءات العلمية) عام 1986. ويمكن الاطلاع على وصفه السائل الدماغي النخاعي الاصطناعية (قام) في الجدول 1-
1-"إعداد شريحة هيبوكامبال الحاد"
- إزالة الدماغ الماوس، في أسرع وقت ممكن، باستخدام ملعقة وحادة مقص قص الجمجمة، ووضعه في الجليد، والاوكسيجين (95% س 2، 5% CO 2)، قام السكروز عالية (~ 100 مل)-
- مكان في الدماغ الماوس على طبق بيتري وإزالة جزء صغير من قشرة أمامي مع مشرط قبل هيميسيكتينج أسفل خط الوسط الدماغ والمخيخ-
- وضع نصفي في الجانب الذي كان مجرد قص والصق كل نصف الكرة الغربي على خشبة المسرح من فيبرتوم. قطع
- 200-300 ميكرون سميكة أقسام المنطقة كاملة للفائدة. في حالة الحصين، ينبغي الحصول على حوالي 3-4 شرائح في نصف الكرة الغربي-
- باستخدام ماصة باستور بلاستيك، نقل الشرائح إلى غرفة مغمورة في اﻷوكسيجين (95% O 2، 5% CO 2) قام. الحفاظ على الأقل 34 درجة مئوية للحد الأدنى 30
ملاحظة: يمكن إجراء معاملة شرائح مع وكلاء الدوائية النشطة، مثل المؤتلف Dkk1 البروتينات، في هذه المرحلة بإضافة العملاء الدائرة شريحة.
إزالة الشرائح من الدائرة باستخدام الرسام من - ووضعها في لوحة 24-جيدا وإصلاح لمدة 20 دقيقة إلى ح 1 في بارافورمالدهيد 4% (السكروز PFA)/4% في درجة حرارة الغرفة (RT).
تنبيه: منهاج عمل بيجين السامة، وارتداء حماية ملائمة. - تغسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني 1 X (10 دقيقة في كل)-
ملاحظة: البروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً هنا ليوم 1-2، ما دامت تحفظ الشرائح في 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني X 1.
2. الفلورة "علامات متشابك"
ملاحظة: يمكن الاطلاع على الوصفات لكافة المخازن المؤقتة المستخدمة في الجدول 2-
- يحل محل برنامج تلفزيوني مع حظر بيرميبيليزينج المخزن المؤقت (الجدول 2) في الآبار شريحة واحتضان في RT حاء – 4-6
- تضعف جسم خنزير غينيا [بولكلونل] ضد vGlut1 في إضعاف 1:2,000 في المخزن المؤقت لحظر/بيرميبيليزيشن-
ملاحظة: vGlut1 علامة للتصور المحطة الطرفية عليه قبل متشابك. لتحديد المشبك عليه بعد متشابك، استخدام جسم [بولكلونل] ضد مديرية الأمن العام-95 وتمييع 1: 500 في نفس الحل. استخدام وحدة تخزين الحد أدنى من 300 ميليلتر في كل بئر. لتحديد موقع تشريحي الحصين، استخدام جسم مضاد يمكن أيضا تحديد هيكل الخلايا العصبية، مثل MAP2 أو توبولين. التمارين في التركيزات الصحيحة من جميع الأجسام الأولية لعلامات متشابك من خيار (ما قبل وما بعد متشابك) وتمييع في المخزن المؤقت لحجب بيرميبيليزينج جديدة- - احتضان الشرائح في حل جسم الأولية بين عشية وضحاها (أو 1-2 أيام) في 4 ° جيم-استخدام منصة تهتز مع حركة قوية-
- تغسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني (10 دقيقة في كل)-
- تمييع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة 1: 500 في المخزن المؤقت لحظر. على سبيل المثال، عند استخدام جسم خنزير غينيا vGlut1، تطبيق جسم ثانوية يعترف بالمكون خنزير غينيا (مثلاً حمار المضادة-غينيا-خنزير) يضاف إلى فلوروفوري محددة. عند استخدام جسم الأرنب PSD-95، تطبيق جسم ثانوية يعترف بالمكون أرنب (مثلاً حمار أرنب المضادة) مترافق fluorophore محددة مختلفة-
- احتضان الشرائح في هذا الحل ح 2-3 في ضمان الرايت أن الشرائح محمية من الضوء، كما حساسة للضوء من الأجسام المضادة الثانوية-
- تغسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني (10 دقيقة في كل)-
- بعناية إزالة الشرائح من لوحة 24-حسنا الرسام باستخدام ووضعها بالتساوي على شرائح الزجاج المسمى مسبقاً. إضافة قطره متوسطة المتصاعدة على رأس كل شريحة ومن ثم ضع برفق ساترة زجاج أعلى الشرائح. تجنب تكوين فقاعات الهواء. الحرص على استخدام ما يكفي تصاعد المتوسطة (300-400 ميليلتر)، كما قد يؤدي مبلغ غير كاف لتجفيف شرائح.
- إجازة الجافة للحد أدنى من 1-2 أيام في الرايت والاحتفاظ بالشرائح محمية من الضوء.
- تخزين الشرائح عند 4 درجة مئوية في الأجل القصير، ولكن التخزين الطويل الأمد، والاحتفاظ بها في-20 درجة مئوية.
3. [كنفوكل] الحصول على الصور والتحليل
- التصوير باستخدام الليزر [كنفوكل] الفحص المجهري.
- تحديد منطقة الحصين تصويرها (مثلاً، أمونيس قرن 1 و 3 (CA1، CA3) أو المغزلي المسنن (المدير العام)) عن طريق 10 x أو 20 x الهدف.
- تغير إلى 63 x أو علامة x 40 الغمر النفط الهدف للتأكد من تشريح شريحة غير سليمة عن طريق تحديد نيوريتيس المستمر وتنظيم هيكل. استخدم علامة العصبية، مثل MAP2، كمرجع ( الشكل 1A).
- في وقت لاحق، التبديل إلى 60 × الهدف النفط-الغمر (غ = ~1.3-1.4) وضبط الإعدادات لكل قناة للحصول على الإشارات الأمثل والتباين. تعيين كثافة كل الليزر لتجنب تشبع أي بكسل باستخدام خيار-مرتفعة/منخفضة التباين.
ملاحظة: هذه الإعداد سوف تعتمد على استخدام المجهر، ولكن الرجوع إلى الجدول للمواد اللازمة لإعدادات الطاقة الليزر المستخدمة في الشكل 2 و الشكل 3، و الشكل 4. للحصول على أفضل النتائج، استخدم دقة 1024 × 1024 بكسل. الإعدادات ينبغي أن تظل ثابتة طوال شروط مختلفة لنفس التجربة. ويمكن تطبيق التكبير إضافية إذا لزم الأمر.
تقييم عمق تلطيخ فيها حتى - واكتساب رصات الصور على الأقل 8 مسافة واحدة (250 نيوتن متر) طائرات. ثم تأخذ 3 صور الممثل المتاخمة كدسات من نفس المنطقة التي تهم كل شريحة.
ملاحظة: العمق تختلف من شريحة واحدة إلى آخر، لكن ينبغي دائماً حوالي 2-5 ميكرون من سطح الشريحة. - تكرار الحصول على مالا يقل عن 3 شرائح كل حالة ومن 6-8 الحيوانات كل مجموعة العلاج.
- صورة التحليل.
ملاحظة: استخدام برمجيات تحليل صورة تلقائية (انظر الجدول للمواد). علما أن بعض الأنظمة تتطلب ترخيص، بينما البعض الآخر الحرة، مثل إيماجيج. البرمجيات المستخدمة يجب تحليل الصور في 3D مع مراعاة جميع الطائرات من المكدس تصويرها. الرجوع إلى الجدول للمواد للاطلاع على تفاصيل البرامج المستخدمة في تحليل الصورة ( الشكل 1).- استخدام بروتوكول عتبة كثافة على أساس مخصص للتعرف على جميع بونكتا متشابك وعلامات العصبية، التي هي الأمثل وتحديدها داخل البرنامج يدوياً [انظر الجدول للمواد للبرامج المحددة المستخدمة في هذا البروتوكول].
ملاحظة: البرنامج يحدد كثافة الحد الأدنى والحد الأقصى لكل فلوروفوري ويؤيد نسبة مئوية من كثافة لكل كائن معترف بها. علما بأن النسبة المئوية لكثافة تختلف وفقا فلوروفوري المستخدمة والجسم ضد علامة متشابك. - لعلامات متشابك، تأكد من أن حجم مرشحات (> 0.1µm 3 و < 0.8µm 3) المحدد داخل البرامج وتطبيقها على الصورة. ضبط المعلمات للتأكد من أن الكائنات المحددة ليست متداخلة. استبعاد أي كائن التي كبيرة جداً أو صغيرة جداً للنظر بونكتا متشابك (انظر الشكل 2)-
ملاحظة: بمجرد الأمثل، نفس قيم العتبة ثم تطبق على جميع الصور داخل تجربة معينة. - تقدير متوسط عدد وكثافة، وحجم بونكتا متشابك الفردية (ما قبل أو بعد متشابك) باستخدام البروتوكولات الأمثل العتبة المحددة داخل البرنامج. تطبيع عدد بونكتا لحجم حقل الصورة (تقريبا 16,928 مكم 3 في النظام المتبع هنا). تطبيع كثافة بونكتا متشابك لشدة العلامة المرجعية العصبية.
ملاحظة: يتم تعريف نقاط الاشتباك العصبي كالتعريب المشارك بين علامات كل ما قبل وما بعد متشابك. مرة عتبة بروتوكولات ح بونكتا ما قبل وما بعد متشابكأفي قد أنشئت، البرنامج ينبغي أن يحدد المشارك توطين بونكتا متشابك كالتداخل مقدار 1 بكسل أو أكثر في طائرة واحدة-
ملاحظة: لإجراء تحليل إحصائي، تأكيد أن كافة مجموعات العينات تتبع مجراها الطبيعي وتجانس التباين، كما يحدده ليليفوردس واختبارات χ2، على التوالي. يجب أن يتم تحليل عينات تبين من التوزيع الطبيعي وتجانس التباين مع الاختبارات حدودي، كما هو موضح أدناه. على سبيل المثال، يجب إجراء تحليل بونكتا متشابك ضادات استخدام ANOVA اتجاه واحد مع حظر والنسخ المتماثل. كل التجربة الفردية ينبغي أن تعتبر كتلة؛ عادة، هناك ثلاث تجارب مستقلة، كل منها مع الفئران 1-3 من كل شرط.
- استخدام بروتوكول عتبة كثافة على أساس مخصص للتعرف على جميع بونكتا متشابك وعلامات العصبية، التي هي الأمثل وتحديدها داخل البرنامج يدوياً [انظر الجدول للمواد للبرامج المحددة المستخدمة في هذا البروتوكول].
الرقم 1: تحليل بونكتا متشابك باستخدام تحليل الصور برامج. الصورة (A) لتخصيص بروتوكول عتبة كثافة. المثال المعطى لمديرية الأمن العام-95، الذي قد بونكتا المحدد بحجم محدد من > 0.1 ميكرومتر 3 و < 0.8 ميكرومتر 3 وهذه الكائنات المتراكبة المصغر. لاحظ أن الصورة المعروضة لطائرة [كنفوكل] لتمكين التصور أسهل من بونكتا متشابك واختيار المعلمة دقيقة. (ب) لقطة شاشة لتحليل الإخراج من البرنامج (بعد اختيار البروتوكول الأمثل). مثال على القياسات بونكتا متشابك الخام رقم استناداً إلى وحدة التخزين. ثم يتم تصدير هذه القيم إلى برامج جداول بيانات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
رقم 2: فحص الجودة من إعدادات الشريحة والمعلمة بونكتا متشابك. (أ) الصور [كنفوكل] الممثل (40 x الهدف) لمنطقة الاهتمام: تحديد CA1 الطبقة رادياتوم (sr) وطبقة أورينس (حتى) شريحة هيبوكامبال تلطيخ MAP2. شريط المقياس = 2 ميكرومتر. (ب) [كنفوكل] الصور (60 × الهدف و 1.3 إضافية X التكبير على اقتناء البرمجيات) من رادياتوم الطبقة CA1، مع علامات ضادات-vGlut1 (الأخضر)، ومديرية الأمن العام-95 (أحمر)-من شرائح هيبوكامبال. ملاحظة تحديد بونكتا ما قبل وما بعد متشابك واضحة. بونكتا أكبر من 0.8 ميكرومتر 3 تستثني من القياس الكمي (الأسهم البيضاء). شريط المقياس = 2 ميكرومتر (ج) كونفوكال الصور (60 × الهدف و 1.3 إضافية X التكبير على اقتناء البرمجيات) من رادياتوم الطبقة CA1، مع علامات ضادات-vGlut1 (الأخضر)-من أقسام هيبوكامبال كريوستات-قص من العقول كامل ثابت في منهاج عمل بيجين. ملاحظة وجود ثقوب كبيرة وتلطيخ vGlut1 غير النظامية، وتحبب خفيف. شريط المقياس = 2 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Representative Results
يحدث فقدان المشبك في بداية أمراض الأعصاب مثل الإعلان ومرض باركنسون2،،من1112. ومع ذلك، تظل الآليات الجزيئية الكامنة وراء العجز هذه غير مفهومة. أوجه القصور في إشارة Wnt ارتبطت بإعلان13،14،15،،من1617. Wnts يفرز glycoproteins وتلعب دوراً أساسيا في تشكيل المشبك وتحوير انتقال متشابك18،19،،من2021. ومؤخرا، حددنا Wnts المنظمين الرئيسيين لصيانة متشابك في الجهاز العصبي ناضجة10،22. لدقة دراسة أثر Wnt الإشارات في الاشتباكات العصبية في قرن آمون للفئران المعدلة وراثيا، ونحن استغل إعداد شريحة الدماغ والفحص المجهري [كنفوكل] لتقييم التغييرات في عدد المشبك. حددنا صحية الشرائح التي كان الهيكل جيدا الاحتفاظ (الشكل 2A). وعلاوة على ذلك، اختيار بونكتا متشابك تعريف بعناية، مع استبعاد الأجسام الملون الكبيرة ربما تمثل البروتينات المجمعة (الشكل 2). تم تطبيق هذا المعيار على جميع الصور، مع نفس المعلمات التحليل الدقيق.
استخدمنا نظام نموذج المعدلة وراثيا بالحث على التعبير عن خصم Wnt يفرز Dkk1 في تعليم الكبار الفئران (iDkk1) تحت التتراسيكلين التحكم (انظر الجدول للمواد)10،22. أظهرنا أن الحصار على إشارات Wnt في الحصين الكبار يؤدي فقدان المشبك عليه على وجه التحديد في منطقة رادياتوم الطبقة CA1 (الشكل 3). ويوضح الشكل 3 ألف الصور [كنفوكل] الممثل من علامات ما قبل وما بعد متشابك ضادات (vGlut1، ومديرية الأمن العام-95، على التوالي) المكتسبة من شرائح هيبوكامبال من الفئران iDkk1 الإعراب عن Dkk1 لمدة أسبوعين، فضلا عن عناصر التحكم الخاصة بها. يمكننا تحليل هذه الصور باستخدام برامج فولوسيتي وأظهرت انخفاضا كبيرا في العدد من الاشتباكات العصبية ضادات، كمياً بتوطين المشارك vGlut1، ومديرية الأمن العام-95-المسمى بونكتا في منطقة CA1 الحصين الفئران iDkk1 بعد تحريض Dkk1 لمدة أسبوعين (الشكل 3B، * ف < 0.05؛ اختبار كروسكال-واليس؛ 6 الفئران في النمط الوراثي). في رادياتوم الطبقة CA1، انخفض عدد بونكتا المشبك ضادات الواحد 1,000 ميكرومتر3 من 500 في مكافحة الفئران إلى 300 في الفئران iDkk1. وفي المقابل، المحرض Dkk1 التعبير لم يؤثر على عدد نهايات المثبطة (المعرفة بواسطة التعريب المشارك بين علامات ما قبل وما بعد متشابك فجأت وجيفيرين، على التوالي)، كما هو موضح في الشكل 4 أ-ب (ف > 0.05؛ اختبار كروسكال-واليس؛ 3 الفئران في النمط الوراثي).
الأهم من ذلك، أجرينا تحليلاً قوة إحصائية لتقدير العدد المناسب من شرائح والحيوانات اللازمة لتوليد هذه النتائج القوية. استخدام البحث والتطوير، حسبنا أن هناك حاجة إلى شرائح 35 تقريبا كل حالة (3 صور x 3 شرائح x 6 الحيوانات = 36) للكشف عن حجم تأثير كبير (و = 0.4) بثقة 80% (الطاقة = 0.8) في ANOVA اتجاه واحد مع حظر والنسخ المتماثل، كما هو موضح في الخطوة 3.2.6.
الشكل 3: فقدان نهايات ضادات هيبوكامبال شرائح من الفئران iDkk1. (أ) صور [كنفوكل] الممثل CA1 الطبقة رادياتوم إظهار ضادات الاشتباكات العصبية، حددها التعريب المشارك بين vGlut1 ومديرية الأمن العام-95 (الأسهم البيضاء). ويمثل الفريق أقل تكبير أعلى المستطيل المميز. تغيير حجم أشرطة = 2 ميكرومتر. (ب) النسبة المئوية ضادات نقاط الاشتباك العصبي بين عنصر التحكم و iDkk1 كان كمياً باستخدام البرنامج المذكور في الجدول للمواد (* ف < 0.05؛ اختبار كروسكال-واليس؛ 6 الفئران في النمط الوراثي). البيانات هي تمثيل ± sem. لقد تم تعديل هذا الرقم من مرجع10. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: الاشتباكات العصبية المثبطة دون تغيير في شرائح هيبوكامبال من الفئران iDkk1. (أ) صور [كنفوكل] الممثل رادياتوم الطبقة CA1 من الاشتباكات العصبية المثبطة التي حددها التعريب المشارك بين فجأت وجيفيرين (الأسهم البيضاء). ويمثل الفريق أقل تكبير أعلى المستطيل المميز. تغيير حجم أشرطة = 2 ميكرومتر. (ب) النسبة المئوية للاشتباكات العصبية المثبطة بين الفئران التحكم و iDkk1، كما كمياً باستخدام البرمجيات فولوسيتي (ف > 0.05؛ اختبار كروسكال-واليس؛ 3 الفئران في النمط الوراثي). البيانات هي تمثيل ± sem. لقد تم تعديل هذا الرقم من مرجع10. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| مكونات قام السكروز عالية | تركيز | وتلاحظ |
| كلوريد الصوديوم | 75 مم | |
| ناكو3 | 25 مم | |
| بوكل | 2.5 مم | |
| نة2بو4، 2 ح2س | 1.25 مم | |
| حمض كينورينيك | 1.25 مم | |
| حمض بيروفك | 2 مم | |
| يدتا | 0.1 مم | |
| كاكل2 | 1 مم | إضافة بعد الأوكسجين للحل |
| مجكل2 | 4 مم | إضافة بعد الأوكسجين للحل |
| د-الجلوكوز | 25 مم | |
| السكروز | 100 مم | |
| غرفة مغمورة "قام عناصر" | ||
| كلوريد الصوديوم | 125 مم | |
| ناكو3 | 25 مم | |
| بوكل | 2.5 مم | |
| نة2بو4، 2 ح2س | 1.25 مم | |
| كاكل2 | 1 مم | إضافة بعد الأوكسجين للحل |
| مجكل2 |
الجدول 1: قام تكوينها.
| المخزن المؤقت لحظر/بيرميبيليزينج | تركيز | وتلاحظ |
| مصل حمار | 10 ٪ | |
| تريتون-X | 0.50% | |
| برنامج تلفزيوني | س 1 | |
| برنامج تلفزيوني x 10 | pH إلى 7.4 | |
| كلوريد الصوديوم | 1.37 M | |
| بوكل | 27 مم | |
| نة2بو4 | 100 مم | |
| خ2ص4 | 18 ملم | |
| 4% PFA/4% السكروز | pH إلى 7.4 | |
| برنامج تلفزيوني | س 1 | تضعف من 10 x |
| منهاج عمل بيجين | 1.33 م | |
| السكروز | 117 ملم |
الجدول 2: المخازن المؤقتة المستخدمة لتلوين إيمونوفلوريسسينت.
Discussion
التقييم الدقيق لعدد المشبك أمر ضروري في مجال علم الأعصاب. وهنا نعرض كيفية تقييم كثافة الاشتباكات العصبية في منطقة CA1 رادياتوم طبقة من شرائح هيبوكامبال كنظام نموذجي. ويتجلى في المادة البحوث الأخيرة على الأثر نقص Wnt في قرن آمون وحيث أننا أيضا تقييم عدد المشبك أهمية فيما يتعلق بالأساليب القائمة مقطع واحد-م10. حجم الخسارة المشبك متشابهة بين واحد-قسم طب الطوارئ والدماغ-الشريحة الأسلوب الموصوفة هنا10. وهكذا، يوضح هذا الاستنتاج بدقة وموثوقية تقنية.
الأهم من ذلك، هو حد من واحد-قسم طب الطوارئ والاشتباكات العصبية إيمونوستينينج، كما عرضت هنا، عدم القدرة على دقة تقدير عدد المشبك المطلق لمنطقة معينة من الدماغ. في الواقع، من المهم تحديد أية تغييرات مورفولوجية العالمية، كما يمكن أن تؤثر التغيرات في حجم إجمالي عدد متشابك. قيد آخر أن بعض الأجسام المضادة أقل كفاءة في تلوين المناطق الدماغ سليمة، جزئيا بسبب كثافة الاتصالات متشابك المتطرفة. عانينا من تلطيخ جودة أعلى من vGlut1 وجيفيرين استخدام هذا إعداد شريحة واللاحقة PFA التثبيت بحد أقصى 1 إتش، مقارنة بالتثبيت الفوري لكامل الدماغ في منهاج عمل بيجين (الشكل 2). هذا الأخير أدى إلى تلطيخ متشابك تحبب خفيف، مع ثقوب في الأنسجة. ومع ذلك، لا يزال مقيد باختراق جسم vGlut1 في كلتا الطريقتين (بضع عشرات من ميكرون). لم نتغلب على هذا القيد، حتى مع زيادة جسم الحضانة، ولكن توفير اختراق جسم أكبر من عمق الإجمالية التي يتم تصويرها، ينبغي أن يكون هناك أي تأثير على النتيجة النهائية. وعلاوة على ذلك، ينبغي إيلاء عناية خاصة لضمان أن تلطيخ حتى خلال المكدس المكتسبة بأكملها.
وفي دراستنا، أردنا أن يميز ضادات من الاشتباكات العصبية المثبطة. ونتيجة لذلك، اخترنا vGlut1/مديرية الأمن العام-95 وفجأت/جيفيرين، على التوالي، كما أن هذه البروتينات يتم التعبير عن درجة عالية في قرن آمون الماوس الكبار وهي محددة لكل نوع فرعي المشبك4،5. علامات أخرى متشابك ضادات والمثبطة يمكن أن تستخدم لتحديد كل المشبك كل منها، مثل مستقبلات أثري في كل المشبك، بما في ذلك مستقبلات NMDA وامبا ضادات ومستقبلات جابا للاشتباكات العصبية المثبطة. يمكن أيضا تحديد العصبية أو نيورومودولاتورس أخرى مع بروتوكول لدينا، وضمان أن الأجسام المضادة المحددة متوفرة، كما هو موضح لنهايات تتميز في المخطط22. وبالإضافة إلى ذلك، تقليل سمك كل شريحة إلى 120 ميكرون جزئيا يمكن التغلب على كمية منخفضة من العينات التي تم الحصول عليها مع شرائح الحادة، التي لا بد للدراسات في هياكل الدماغ الصغيرة مثل اللوزة.
التطبيقات المستقبلية لأن البروتوكول يمكن أن تنفذ في دراسة مناطق الدماغ المختلفة والاضطرابات. على سبيل المثال، يمكن استخدام مزيج من vGlut2/مديرية الأمن العام-95 أو vGlut1/مديرية الأمن العام-95 في المخطط (منطقة الدماغ المرتبطة بمرض باركنسون)، للتفريق بين نهايات ضادات من أفيرينتس القادمة من اللحاء أو المهاد، على التوالي22.
وفي الختام، أننا أظهرنا طريقة موثوقة لفحص العدد من الاشتباكات العصبية في أنسجة الدماغ باستخدام علامات ما قبل وما بعد متشابك لتعريف المشبك. وتشمل الخطوات الحاسمة إعداد شرائح هيبوكامبال جيدة، وقت تثبيت ليصل إلى 1 ح في منهاج عمل بيجين، وتطبيق ما يكفي المتوسطة تصاعد، استخدام الأجسام المضادة يمكن الاعتماد عليها، وإعدادات اقتناء الصورة المناسبة، والكشف بونكتا متشابك الصارمة. وفي نهاية المطاف، هذا الأسلوب هو سريعة نسبيا وهو استنساخه بسهولة بأي المختبرات التي يمكنها الوصول إلى مجهر [كنفوكل].
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
كان يؤيد هذا العمل لجنة نهر الميكونج والاتحاد الأوروبي FP7، عراك، مؤسسة ويلكوم ترست، والمملكة المتحدة باركنسون. كما نود أن نشكر السيدة جوانا بوتشلير لمساهمتها صور [كنفوكل] والأعضاء من مختبر لمساهماتهم البناءة على المخطوط ومنهجية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Primary antibody | Millipore | AB5905 | vGlut1 (1:2000) |
| Primary antibody | Thermo Scientific | MA1-046 | PSD-95 (1:500) |
| Primary antibody | Synaptic Systems | 131 004 | vGAT (1:500) |
| Primary antibody | Synaptic Systems | 147011 | Gephyrin (1:500) |
| Primary antibody | Abcam | ab5392 | MAP2 (1:10000) |
| Secondary antibody | Jackson Laboratories | 706-545-148 | Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600) |
| Secondary antibody | Abcam | ab175470 | Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600) |
| Mounting medium | SouthernBiotech | 00-4958-02 | Fluoromount-G |
| Confocal Microscope | Olympus | NA | FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%. |
| Analysis software | PerkinElmer | NA | Volocity |
| Scalpel | Swann-Morton | 203 | No 11 |
| Super Glue | Loctite | 1446875 | |
| 95% O2, 5% CO2 | BOC | NA | Cylinder |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Glass slides | Thermo | 7107 | 08-1.0mm thick |
| Petri Dish | Corning | 430167 | |
| iDkk1 mice | N/A | N/A | Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKIIα rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKIIα rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for solutions: | |||
| NaCl | Sigma | V800372 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| Ca2Cl | Sigma | 223506 | |
| Mg2Cl | Sigma | M9272 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71505 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| D-Glucose | Sigma | G5767 | |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Triton-X | Sigma | T8787 | |
| Donkey Serum | Millipore | S30-100ml | |
| PFA | Sigma | P6148 |
References
- Malenka, R. C., Bear, M. F. LTP and LTD: an embarrassment of riches. Neuron. 44 (1), 5-21 (2004).
- Arendt, T. Synaptic degeneration in Alzheimer's disease. Acta Neuropathol. 118 (1), 167-179 (2009).
- Missler, M., Sudhof, T. C., Biederer, T. Synaptic cell adhesion. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (4), a005694 (2012).
- Chua, J. J., Kindler, S., Boyken, J., Jahn, R. The architecture of an excitatory synapse. J Cell Sci. 123 (Pt 6), 819-823 (2010).
- Dobie, F. A., Craig, A. M. Inhibitory synapse dynamics: coordinated presynaptic and postsynaptic mobility and the major contribution of recycled vesicles to new synapse formation. J Neurosci. 31 (29), 10481-10493 (2011).
- Jackson, R. J., et al. Human tau increases amyloid beta plaque size but not amyloid beta-mediated synapse loss in a novel mouse model of Alzheimer's disease. Eur J Neurosci. 44 (12), 3056-3066 (2016).
- Heck, N., et al. A new automated 3D detection of synaptic contacts reveals the formation of cortico-striatal synapses upon cocaine treatment in vivo. Brain Struct Funct. 220 (5), 2953-2966 (2015).
- Sultana, R., Banks, W. A., Butterfield, D. A. Decreased levels of PSD95 and two associated proteins and increased levels of BCl2 and caspase 3 in hippocampus from subjects with amnestic mild cognitive impairment: Insights into their potential roles for loss of synapses and memory, accumulation of Abeta, and neurodegeneration in a prodromal stage of Alzheimer's disease. J Neurosci Res. 88 (3), 469-477 (2010).
- Harwell, C. S., Coleman, M. P. Synaptophysin depletion and intraneuronal Abeta in organotypic hippocampal slice cultures from huAPP transgenic mice. Mol Neurodegener. 11 (1), 44 (2016).
- Marzo, A., et al. Reversal of Synapse Degeneration by Restoring Wnt Signaling in the Adult Hippocampus. Curr Biol. 26 (19), 2551-2561 (2016).
- Zoghbi, H. Y., Bear, M. F. Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (3), (2012).
- Janezic, S., et al. Deficits in dopaminergic transmission precede neuron loss and dysfunction in a new Parkinson model. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), E4016-E4025 (2013).
- Caricasole, A., et al. Induction of Dickkopf-1, a negative modulator of the Wnt pathway, is associated with neuronal degeneration in Alzheimer's brain. J Neurosci. 24 (26), 6021-6027 (2004).
- De Ferrari, G. V., et al. Common genetic variation within the low-density lipoprotein receptor-related protein 6 and late-onset Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9434-9439 (2007).
- Liu, C. C., et al. Deficiency in LRP6-mediated Wnt signaling contributes to synaptic abnormalities and amyloid pathology in Alzheimer's disease. Neuron. 84 (1), 63-77 (2014).
- Purro, S. A., Dickins, E. M., Salinas, P. C. The Secreted Wnt Antagonist Dickkopf-1 Is Required for Amyloid beta-Mediated Synaptic Loss. J Neurosci. 32 (10), 3492-3498 (2012).
- Rosi, M. C., et al. Increased Dickkopf-1 expression in transgenic mouse models of neurodegenerative disease. J Neurochem. 112 (6), 1539-1551 (2010).
- Budnik, V., Salinas, P. C. Wnt signaling during synaptic development and plasticity. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 151-159 (2011).
- Ciani, L., et al. Wnt signalling tunes neurotransmitter release by directly targeting Synaptotagmin-1. Nat Commun. 6, 8302 (2015).
- Dickins, E. M., Salinas, P. C. Wnts in action: from synapse formation to synaptic maintenance. Front Cell Neurosci. 7, 162 (2013).
- Inestrosa, N. C., Varela-Nallar, L. Wnt signalling in neuronal differentiation and development. Cell Tissue Res. 359 (1), 215-223 (2015).
- Galli, S., et al. Deficient Wnt signalling triggers striatal synaptic degeneration and impaired motor behaviour in adult mice. Nat Commun. 5, 4992 (2014).
