Summary
Een protocol voor het nauwkeurig identificeren en analyseren van synapsen in hippocampal plakjes met immunofluorescentie wordt in dit artikel beschreven.
Abstract
In de hersenen zijn synapsen gespecialiseerde aansluitingen tussen neuronen, bepaling van de sterkte en de verspreiding van neuronale signalering. Het aantal synapsen is strak geregeld tijdens het ontwikkelen en neuronale rijping. Bovenal kunnen tekorten in de synaps nummer leiden tot cognitieve dysfunctie. De evaluatie van SYNAPS nummer daarom een integraal onderdeel van neurobiologie. Echter, zoals synapsen klein en zeer compact in de hersenen intact zijn, de beoordeling van absolute nummer is uitdagend. Dit protocol beschrijft een methode om gemakkelijk identificeren en evalueren van synapsen in hippocampal knaagdier plakjes met immunofluorescentie microscopie. Het bevat een drie-stappen-procedure te evalueren synapsen in confocale microscopie van hoge kwaliteit beelden door het analyseren van de co lokalisatie van pre- en postsynaptisch eiwitten in hippocampal plakjes. Ook wordt uitgelegd hoe de analyse wordt uitgevoerd en geeft representatieve voorbeelden van zowel excitatory en inhiberende synapsen. Dit protocol verschaft een solide basis voor de analyse van synapsen en kan worden toegepast op elk onderzoek onderzoek naar de structuur en functie van de hersenen.
Introduction
Het menselijk brein is samengesteld uit ongeveer 1014 synapsen. Synaps nummer is strak geregeld tijdens de ontwikkeling en rijping van het centrale zenuwstelsel (CNS). In de gehele ontwikkeling, synaps nummer wordt gemoduleerd door synaptogenese en snoeien om te vormen van de functionele neuronale netwerken. Leren en geheugen worden ondersteund door de verordening van SYNAPS nummer en sterkte, een proces dat bekend staat als synaptic potentiëring en depressie1. Belangrijker, is de stabilisering van de volwassen synapsen essentieel voor het behoud van de neuronale netwerkverbindingen. Bovendien zijn tekorten in de synaps dichtheid gemeld in de vroege stadia van neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer (AD)2. De mogelijkheid om nauwkeurig identificeren en evalueren van SYNAPS nummer daarom fundamenteel voor de beoordeling van de hersenen fysiologie en pathologie.
De extreme dichtheid en compacte karakter van synapsen maken het uitdagend om te schatten hun precieze aantal in intact hersengebieden. Chemische synapsen in het VNV zijn gemaakt van twee neuronen in nauwe apposition, gescheiden door een synaptic gespleten3. De vooraf synaptic terminal of synaptic bouton, blijkt uit een axon en bestaat uit de geaccumuleerde blaasjes, die neurotransmitters die de specificiteit van een synaps bepalen bevatten — namelijk, glutamaat en gamma - aminoboterzuur (GABA) voor excitatory en remmende synapses, respectievelijk. De membranen van de blaasjes bevatten vesiculaire vervoerders die specifiek zijn voor elke neurotransmitter: vesiculaire glutamaat vervoerder (vGlut) voor glutamaat en vesiculaire GABA vervoerder (vGAT) voor GABA. De post synaptic terminal is een zeer dichte structuur bestaat uit meerdere eiwitten, met inbegrip van receptoren, celadhesie-moleculen en steiger eiwitten. In excitatory synapsen is post synaptic dichtheid-95 eiwit (PSD-95) de meest voorkomende steiger eiwit4, modulerende excitatory N-methyl-D-aspartate(NMDA-) en α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic zuur (AMPA-) receptor functioneren, terwijl gephyrin ankers remmende receptoren op de remmende post synaptic terminal5. Over het geheel genomen de specificiteit van eiwitten te pre- en post synaptic compartimenten steun bij de differentiatie en de identificatie van SYNAPS subtypen.
De evaluatie van SYNAPS nummer kan worden uitgevoerd met verschillende technieken. De meest voorkomende is het gebruik van elektronenmicroscopie (EM), waarmee de analyse van de synaps in compact en intact hersengebieden met hoge vergroting en resolutie. Deze techniek is echter erg duur, gecompliceerd monstervoorbereiding vereist, en is zeer tijdrovend. Andere technieken omvatten het gebruik van matrix tomografie6, die een groot nadeel is dat het vereist gespecialiseerde en dure apparatuur de analyses uit te voeren. Bovendien, transgene lijnen uiting van specifieke synaptic markers zijn handig bij het evalueren van SYNAPS nummer7, maar de generatie van nieuwe lijnen kan beperkende en duur, en de overexpressie van eiwitten kan resulteren in ongewenste af-target fenotypen.
Veel onderzoekers evalueren als gevolg van deze beperkingen en voor eenvoud, synaps nummer door het onderzoek van totale synaptic eiwitniveaus. Echter kan Synaps verlies voor aanzienlijke veranderingen in eiwit, als structurele synaptic remodelleert resultaten in de versnippering van de pre- of post synaptic apposition, met geen afbraak van synaptic eiwitten worden waargenomen. Bovendien, in AD, synaptic eiwitniveaus zijn verminderde volgende synapse degeneratie of neuronale dood8,9. De kwantificering van totale niveaus wordt dit onderscheid niet ingeschakeld. Er is dus behoefte aan een betrouwbare, toegankelijke en correcte methode voor de beoordeling van SYNAPS nummer in de hersenen.
In dit artikel beschrijven we hoe grondig identificeren en bepalen van het aantal synapsen met immunofluorescentie microscopie in hippocampal knaagdier hersenen plakjes. De synapsen worden gedefinieerd door de colocalization van pre- en post synaptic markeringen die worden weergegeven in een punctate verdeling. We laten zien dat de geldigheid van deze techniek door de studie van de Wnt signalering in de hersenen. Wnts zijn secreted eiwitten belangrijk voor de vorming, verwijdering en onderhoud van synapsen. De in vivo inductie van een secreted antagonist van de Wnt cascade, Dickkopf-1 (Dkk1), leidt tot excitatory synaptic verlies inhiberende synapsen in de hippocampus10aan te tasten. We illustreren de identificatie en de graaf van excitatory en inhiberende synapsen in hippocampal segmenten van een volwassen muis uiting van Dkk1 en markeer de overdraagbaarheid van deze techniek voor andere soorten weefselkweek/preparaten.
Protocol
alle de experimenten met behulp van muizen en ratten werden goedgekeurd en uitgevoerd met behulp van schema 1 procedures vallen onder de thuiskantoor dieren (wetenschappelijke Procedures) act 1986. Het recept van kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) kan worden gevonden in tabel 1.
1. acute Hippocampal Slice voorbereiding
- verwijderen van de hersenen van de muis zo snel mogelijk, met behulp van een spatel en scherpe schaar te snijden van de schedel, en plaatst u deze in ijskoude, zuurstof (95% O 2, 5% CO 2), hoge-sacharose ACSF (~ 100 mL).
- Plaats van de muis hersenen op een petrischaal en verwijder het cerebellum en een klein deel van de frontale cortex met een scalpel voor hemisecting beneden de middellijn van de hersenen.
- Plaats van de twee hemisferen op de kant dat gewoon knippen was en lijm van elk halfrond op het podium van een vibratome.
- Snij 200-300 µm dik secties van het volledige gebied van belang. In het geval van de hippocampus, ongeveer 3-4 plakjes per halfrond moeten worden verkregen.
- De segmenten met behulp van een plastic pipet van Pasteur, overbrengen naar een kamer ondergedompeld in zuurstofrijk (95% O 2, 5% CO 2) ACSF. Zorg ervoor dat u 34 ° C gedurende 30 min.
Opmerking: De behandeling van segmenten met actieve farmacologische stoffen, zoals recombinante eiwitten van de Dkk1, kan worden uitgevoerd in dit stadium door toevoeging van de agenten naar de vergaderzaal segment. - De plakjes uit de kamer met behulp van een penseel verwijderen, plaats ze in een 24-well-plaat en positiebepaling voor 20 min tot 1U in 4% paraformaldehyde (PFA)/4% sacharose bij kamertemperatuur (RT).
Let op: PFA is giftig, adequate bescherming dragen. - Wassen de plakjes driemaal in 1 X PBS (elke 10 min).
Opmerking: Het protocol kan worden onderbroken hier voor 1-2 dagen, zo lang als de segmenten worden bewaard bij 4 ° C in 1 X PBS.
2. Immunofluorescentietest voor Synaptic Markers
Opmerking: de recepten van alle buffers gebruikt kunnen worden gevonden in tabel 2.
- Vervangt de PBS met buffer blokkeren/permeabilizing (tabel 2) in het segment wells en Incubeer bij RT voor 4-6 h.
- Verdund het cavia polyclonal antilichaam tegen vGlut1 bij een verdunning 1:2,000 in blokkeren/permeabilization buffer.
Opmerking: vGlut1 is een marker voor vooraf synaptische excitatory terminal visualisatie. Voor post synaptische excitatory SYNAPS identificatie, gebruikt u een polyclonal antilichaam tegen PSD-95 en verdunde 1:500 in dezelfde oplossing. Een minimale volume van 300 µL gebruiken in elk putje. Ter identificatie van de anatomische locatie van de hippocampus, een antilichaam dat kan ook het identificeren van de neuronale structuur, zoals MAP2 of tubuline te gebruiken. Uitwerken van de juiste concentraties van alle primaire antilichamen voor de synaptische markers van keuze (pre- en post synaptic) en verdund in verse blokkeren/permeabilizing buffer. - Incubeer de segmenten in het primaire antilichaam oplossing 's nachts (of 1-2 dagen) bij 4 ° C. gebruik een schudden platform met krachtige beweging.
- Wassen van de segmenten drie keer in PBS (elke 10 min).
- Verdun de passende secundaire antilichamen-1:500 in de blokkeerbuffer. Bijvoorbeeld bij het gebruik van het antilichaam vGlut1 cavia, toepassen een secundair antilichaam dat de cavia component (bijvoorbeeld ezel-anticavia-herkent) geconjugeerd met een specifieke fluorophore. Bij het gebruik van het PSD-95 konijn antilichaam, toepassing een secundair antilichaam dat het konijn onderdeel (bijvoorbeeld ezel anti-konijn herkent) geconjugeerd met een verschillende specifieke fluorophore.
- Broeden segmenten van deze oplossing voor 2-3 h op RT. Zorg ervoor dat de segmenten worden beschermd tegen het licht, zoals secundaire antilichamen licht gevoelig zijn.
- Wassen van de segmenten drie keer in PBS (elke 10 min).
- Zorgvuldig verwijderen van de segmenten van de 24-well plaat met behulp van een penseel en plaats ze gelijkmatig op vooraf gelabelde glas dia's. Voeg een druppel van montage medium op de top van elk segment en plaats vervolgens voorzichtig een dekglaasje glas aan boven op de segmenten. De vorming van luchtbellen vermijden. Zorg aan gebruik genoeg montage medium (300-400 µL), als een ontoereikend bedrag leiden kan tot droge segmenten.
- Laat drogen voor minimaal 1-2 dagen bij RT en houden van de dia's beschermd tegen licht.
- Opslaan van de dia's bij 4 ° C op de korte termijn, maar voor langdurige opslag, houd ze bij -20 ° C.
3. Confocale Beeldacquisitie en analyse
- Imaging met behulp van confocale laser scanning microscopie.
- Identificeren de regio van de hippocampus op het image worden gemaakt (b.v., het cornu ammonis 1 en 3 (CA1, CA3) of de getand gyrus (DG)) door middel van een 10 x of 20 x doelstelling.
- Verandering aan een 40 x of 63 x olie-immersie doelstelling om ervoor te zorgen de anatomie van het segment door het identificeren van continu neurites intact is en structuur georganiseerd. Een neuronale marker, zoals MAP2, gebruiken als een referentie ( figuur 1A).
- Vervolgens overschakelen naar een 60 x olie-immersie doelstelling (NB = ~1.3 - 1.4) en pas de instellingen voor elk kanaal om optimale signaal en contrast te verkrijgen. Instellen van de intensiteit van elke laser om te voorkomen dat de verzadiging van alle pixels met behulp van de optie van een hoog- / laag-contrast.
Opmerking: Deze instelling zal afhangen van de Microscoop gebruikt, maar verwijzen naar de Tabel van materialen voor de energiebeheerinstellingen van de laser gebruikt in Figuur 2 Figuur 3, en Figuur 4. Voor de beste resultaten, kiest u een resolutie van 1024 x 1024 pixels. De instellingen moeten de verschillende omstandigheden van hetzelfde experiment constant blijven. Extra zoom kan worden toegepast indien nodig. - Evalueren de diepte waar de kleuring zelfs is en verwerven afbeeldingsstapels van ten minste 8 equidistante (250 nm) vliegtuigen. Neem 3 stapels van de aangrenzende representatieve beelden uit hetzelfde gebied van rente per slice.
Opmerking: De diepte kan variëren van één segment naar het andere maar altijd moet ongeveer 2-5 µm van het oppervlak van het segment. - De overname in ten minste 3 plakjes per voorwaarde en van 6-8 dieren per groep van de behandeling herhalen.
- Image analyse.
Opmerking: Gebruik de software van de analyse van een geautomatiseerde beeld (Zie de Tabel van de materialen). Merk op dat sommige systemen een licentie vereisen, terwijl anderen gratis, zoals ImageJ zijn. De software die wordt gebruikt moet de beelden in 3D analyseren door rekening houdend met alle vliegtuigen van de stack beeld. Verwijzen naar de Tabel van materialen voor de details van de software die wordt gebruikt in de beeldanalyse ( Figuur 1).- Gebruik een aangepaste gebaseerde intensiteit drempel protocol te identificeren alle synaptische puncta en neuronale markers, die handmatig zijn geoptimaliseerd en geselecteerd binnen de software [Zie Tabel van materialen voor de specifieke software die wordt gebruikt in dit Protocol].
Opmerking: De software identificeert een minimale en maximale intensiteit voor elke fluorophore en een percentage van de intensiteit van elke erkende object koppelt. Merk op dat het percentage van de intensiteit varieert naar gelang van de fluorophore gebruikt en het antilichaam tegen de synaptische markering. - Voor synaptic markers, zorgen dat grootte filters (> 0.1µm 3 en < 0.8µm 3) worden binnen de software geselecteerd en toegepast op de afbeelding. Aanpassen van de parameters om ervoor te zorgen dat de geselecteerde objecten elkaar niet overlappen. Uitsluiten van elk object dat te groot of te klein beschouwd synaptische puncta (Zie figuur 2B).
Opmerking: Zodra geoptimaliseerd, de dezelfde drempelwaarden worden vervolgens toegepast op alle afbeeldingen binnen een gegeven experiment. - Kwantificeren de uurgemiddelde per, intensiteit en volume van individuele synaptische puncta (vóór of na synaptic) met behulp van de protocollen van de geoptimaliseerde drempel geselecteerd binnen de software. Normaliseren van het nummer van de puncta aan het volume van het afbeeldingsveld (ongeveer 16,928 µm 3 in het systeem hier gebruikt). Normaliseren van de intensiteit van de synaptische puncta op de intensiteit van de verwijzing neuronale markering.
Opmerking: De synapsen worden gedefinieerd als de co lokalisatie tussen zowel pre- en post synaptic markeringen. Eenmaal de drempel protocollen voor pre- en post synaptische puncta hAve is gevestigd, moet de software de co lokalisatie van synaptische puncta identificeren als de overlapping van 1 pixel of meer in een enkel vliegtuig.
Opmerking: Voor statistische analyse, bevestigen dat alle soorten monsters normaliteit en de homogeniteit van de afwijking volgen, zoals bepaald door Lilliefords en χ2-tests, respectievelijk. Toont een normale verdeling en de homogeniteit van variantie monsters moeten worden geanalyseerd met parametrische toetsen, zoals hieronder beschreven. Bijvoorbeeld moet excitatory synaptische puncta analyse worden uitgevoerd met behulp van een one-way ANOVA met blokkeren en replicatie. Elke individuele experiment moet worden beschouwd als een blok; Er zijn gewoonlijk drie onafhankelijke experimenten, elk met 1-3 muizen van elke voorwaarde.
- Gebruik een aangepaste gebaseerde intensiteit drempel protocol te identificeren alle synaptische puncta en neuronale markers, die handmatig zijn geoptimaliseerd en geselecteerd binnen de software [Zie Tabel van materialen voor de specifieke software die wordt gebruikt in dit Protocol].
Figuur 1: analyse van synaptische puncta met behulp van de beeldanalyse serversoftware. (A) Screenshot van de intensiteit aanpassing van het protocol van de drempel. Het gegeven voorbeeld is voor PSD-95, waarin de geselecteerde puncta hebben een gedefinieerde grootte van > 0.1 µm 3 en < 0.8 µm 3 en huidige geminimaliseerde overlappende objecten. Merk op dat de afbeelding weergegeven voor één van de confocal vlakken om het gemakkelijker visualisatie van synaptische puncta en nauwkeurige parameter selectie. (B) Screenshot van de output van de software (na de selectie van de geoptimaliseerde protocol) analyse. Een voorbeeld van ruwe synaptische puncta aantal metingen op basis van het volume. Deze waarden worden vervolgens geëxporteerd naar een spreadsheet-software. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: kwaliteitscontrole van de instellingen van het segment en de parameter voor de synaptische puncta. (A) representatieve confocal beelden (40 x doelstelling) van de regio van belang: de CA1 stratum radiatum (sr) en stratum oriens (dus) van een hippocampal segment worden geïdentificeerd door MAP2 kleuring. Schaal bar = 2 µm. (B) Confocal beelden (60 x doelstelling en een extra 1.3 X vergroting op de acquisitie software) van de CA1 stratum radiatum, met excitatory markeringen-vGlut1 (groen) en PSD-95 (rood)-van hippocampal segmenten. Opmerking de identificatie van duidelijke pre en post synaptische puncta. Puncta groter dan 0,8 µm 3 zijn uitgesloten van de kwantificering (witte pijlen). Schaal bar = 2 µm (C) Confocal beelden (60 x doelstelling en een extra 1.3 X vergroting op de acquisitie software) van de CA1 stratum radiatum, met excitatory markeringen-vGlut1 (groen)-uit de cryostaat-cut hippocampal gedeelten van de gehele hersenen vaste in PFA. Let op de aanwezigheid van grote gaten en het onregelmatige, samengeklonterd vGlut1 vlekken. Schaal bar = 2 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Representative Results
Synaps verlies optreedt in het begin van neurodegeneratieve ziekten zoals AD en11,12van de2,van de ziekte van Parkinson. De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze tekorten blijven echter slecht begrepen. Tekortkomingen in het Wnt signalering zijn geassocieerd met AD13,14,15,16,17. Wnts zijn secreted glycoproteïnen en spelen een essentiële rol in de synaps formatie en de modulering van de synaptische transmissie18,19,20,21. Onlangs, we Wnts aangemerkt als belangrijke regelgevers van synaptic onderhoud in de volwassen zenuwstelsel10,22. Om het nauwkeurig bestuderen van de gevolgen van de Wnt signalering op synapsen in de hippocampus van genetisch gemodificeerde muizen, profiteerde we van een hersenen segment voorbereiding en confocale microscopie te evalueren van de veranderingen in de synaps nummer. We geïdentificeerd gezonde segmenten waarin de structuur goed was bewaard (figuur 2A). De selectie van synaptische puncta was bovendien nauwkeurig omschreven, met uitzondering van grote gekleurde objecten vertegenwoordigen waarschijnlijk geaggregeerde eiwitten (figuur 2B). Dit criterium werd toegepast op alle afbeeldingen, met dezelfde strikte analyseparameters.
We gebruikten een transgene modelsysteem dat de expressie van de secreted antagonist van de Wnt Dkk1 in volwassen induceert muizen (iDkk1) onder tetracycline bepalen (Zie de Tabel van materialen)10,22. We toonden aan dat de blokkade van de Wnt signalering in de volwassen hippocampus triggers excitatory SYNAPS verlies specifiek regio CA1 stratum radiatum (Figuur 3). Figuur 3A illustreert representatieve confocal beelden van excitatory pre-en post synaptic markers (vGlut1 en PSD-95, respectievelijk) verworven van hippocampal plakjes van iDkk1 muizen uiting van Dkk1 voor twee weken, evenals hun respectieve besturingselementen. Wij deze beelden met behulp van de Volocity software geanalyseerd en aangetoond dat een aanzienlijke vermindering van het aantal excitatory synapsen, gekwantificeerd door de co lokalisatie van vGlut1 - en PSD-95-label puncta in de CA1-regio van de hippocampus van iDkk1 muizen na de inductie van Dkk1 voor twee weken (figuur 3B, * p < 0.05; Kruskal-Wallis test; 6 muizen per genotype). In de CA1 stratum radiatum, werd de excitatory SYNAPS puncta aantal per 1.000 µm3 teruggebracht van 500 in controle muizen tot 300 bij iDkk1 muizen. Daarentegen geïnduceerde expressie van het Dkk1 had geen invloed op het aantal inhiberende synapsen (geïdentificeerd door de co lokalisatie tussen de pre- en post synaptic markeringen vGAT en gephyrin, respectievelijk), als aangegeven in figuur 4A-B (p > 0.05; Kruskal-Wallis test; 3 muizen per genotype).
Nog belangrijker is, wij uitgevoerd een statistisch onderscheidingsvermogen analyse voor het inschatten van het juiste aantal segmenten en dieren nodig om deze robuuste resultaten te genereren. Met behulp van R, wij berekend dat ongeveer 35 segmenten per voorwaarde nodig waren (3 beelden x 3 segmenten x 6 dieren = 36) om op te sporen van de grootte van een groot effect (f = 0,4) met 80% zekerheid (macht = 0.8) in een one-way ANOVA met blokkeren en replicatie, zoals beschreven in stap 3.2.6.
Figuur 3: verlies van excitatory synapsen in hippocampal plakjes van iDkk1 muizen. (A) representatieve confocal beelden van de CA1 stratum radiatum Toon excitatory synapsen, geïdentificeerd door co lokalisatie tussen vGlut1 en PSD-95 (witte pijlen). Het lagere paneel een hogere vergroting van de gemarkeerde rechthoek aangeeft. Schaal bars = 2 µm. (B) het percentage van excitatory synapsen tussen controle en iDkk1 werd gekwantificeerd aan de hand van de software vermeld in Tabel van materialen (* p < 0.05; Kruskal-Wallis test; 6 muizen per genotype). De gegevens zijn vertegenwoordigd ± SEM. Dit cijfer is gewijzigd van referentie10. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: inhiberende synapsen zijn ongewijzigd in hippocampal plakjes van iDkk1 muizen. (A) representatieve confocal beelden van de CA1 stratum radiatum van inhiberende synapsen geïdentificeerd door de co lokalisatie tussen vGAT en gephyrin (witte pijlen). Het lagere paneel een hogere vergroting van de gemarkeerde rechthoek aangeeft. Schaal bars = 2 µm. (B) Percentage van inhiberende synapsen tussen controle en iDkk1 muizen, zoals gekwantificeerd aan de hand van de Volocity software (p > 0.05; Kruskal-Wallis test; 3 muizen per genotype). De gegevens zijn vertegenwoordigd ± SEM. Dit cijfer is gewijzigd van referentie10. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Hoge sacharose ACSF onderdelen | Concentratie | Notities |
| NaCl | 75 mM | |
| NaHCO3 | 25 mM | |
| KCl | 2.5 mM | |
| NaH2PO4, 2 H2O | 1.25 mM | |
| Kynurenic zuur | 1.25 mM | |
| Pyrodruivenzuur | 2 mM | |
| EDTA | 0.1 mM | |
| CaCl2 | 1 mM | Voeg na oxygenatie van oplossing |
| MgCl2 | 4 mM | Voeg na oxygenatie van oplossing |
| D-Glucose | 25 mM | |
| Sacharose | 100 mM | |
| Verzonken kamer ACSF onderdelen | ||
| NaCl | 125 mM | |
| NaHCO3 | 25 mM | |
| KCl | 2.5 mM | |
| NaH2PO4, 2 H2O | 1.25 mM | |
| CaCl2 | 1 mM | Voeg na oxygenatie van oplossing |
| MgCl2 |
Tabel 1: ACSF samenstelling.
| Blokkeren/permeabilizing Buffer | Concentratie | Notities |
| Ezel serum | 10% | |
| Triton-X | 0,50% | |
| PBS | 1 x | |
| 10 x PBS | pH aan 7.4 | |
| NaCl | 1.37 M | |
| KCl | 27 mM | |
| NaH2PO4 | 100 mM | |
| KH2PO4 | 18 mM | |
| 4% PFA/4% Sucrose | pH aan 7.4 | |
| PBS | 1 x | Verdunnen van 10 x |
| PFA | 1.33 M | |
| Sacharose | 117 mM |
Tabel 2: Buffers gebruikt voor immunefluorescentie kleuring.
Discussion
De precieze evaluatie van SYNAPS nummer is essentieel voor het gebied van de neurowetenschappen. Hier laten we zien hoe de dichtheid van synapsen in de CA1 stratum radiatum regio van hippocampal segmenten als een modelsysteem evalueren. De betekenis ten opzichte van bestaande methoden wordt aangetoond in ons recente onderzoeksartikel over het effect van deficiëntie van de Wnt in de hippocampus en waar we ook geëvalueerd synapse nummer door single-sectie EM10. De omvang van de synaps verlies zijn vergelijkbaar tussen single-sectie EM en de hersenen-delige methode beschreven hier10. Aldus, deze bevinding toont de nauwkeurigheid en de betrouwbaarheid van de techniek.
Nog belangrijker is, is een beperking van zowel single-sectie EM en immunokleuring synapsen, zoals hier gepresenteerd het onvermogen om de absolute synapse nummer voor een specifieke hersenen regio nauwkeurig te schatten. Inderdaad, het is belangrijk om te identificeren van globale morfologische wijzigingen, zoals wijzigingen in het totale volume synaptic nummer kon beïnvloeden. Een andere beperking is dat bepaalde antilichamen minder efficiënt zijn bij kleuring intact hersengebieden, gedeeltelijk als gevolg van de extreme dichtheid van synaptic verbindingen. Wij ervaren hogere kwaliteit kleuring van vGlut1 en gephyrin met behulp van dit segment voorbereiding en latere PFA fixatie voor een maximum van 1 h, in vergelijking met de onmiddellijke fixatie van de gehele hersenen in PFA (figuur 2C). De laatste leidde tot geklonterd synaptic kleuring, met gaten in het weefsel. De penetratie van de antilichaam vGlut1 is echter nog steeds beperkt in beide methoden (een paar tientallen micron). We hebben niet deze beperking ondervangen, zelfs met verhoogde antilichaam-incubatie, maar het verstrekken van de antilichaam-penetratie is groter is dan de totale diepte die image is gemaakt, moet er geen invloed op het uiteindelijke resultaat. Bovendien moet speciale zorg worden genomen om ervoor te zorgen dat de kleuring zelfs gedurende de gehele verworven stack is.
In onze studie wilden we onderscheiden excitatory van inhiberende synapsen. Dus koos we vGlut1/PSD-95 en vGAT/gephyrin, respectievelijk, als deze eiwitten zeer in de hippocampus volwassen muis uitgedrukt zijn en specifiek voor elke synapse subtype4,5 zijn. Andere excitatory en remmende synaptic markeringen kunnen zijn gebruikt om te identificeren van elke respectieve synapse, zoals receptoren verrijkt in elke SYNAPS, met inbegrip van NMDA en AMPA receptoren voor excitatory en GABAA receptoren van inhiberende synapsen. Andere neurotransmitters of neurotransmitters kan ook worden geïdentificeerd met onze protocol, ervoor te zorgen dat specifieke antilichamen beschikbaar, zoals voor Dopaminerge synapsen in het striatum22. Bovendien, kan vermindering van de dikte van elk segment naar 120 µm gedeeltelijk overwonnen de lage hoeveelheid monsters met acute segmenten, die is absoluut noodzakelijk voor studies in de kleine hersenen structuren zoals de amygdala.
Toekomstige toepassingen van onze protocol konden worden geïmplementeerd in de studie van verschillende hersengebieden en stoornissen. Bijvoorbeeld in het striatum (een regio van de hersenen die is gekoppeld aan de ziekte van Parkinson), kan een combinatie van vGlut2/PSD-95 of vGlut1/PSD-95 worden gebruikt om te onderscheiden tussen de excitatory synapsen van afferents vanuit de cortex of thalamus, respectievelijk22.
Tot slot hebben wij een betrouwbare methode om het aantal synapsen in de weefsels van de hersenen een synaps definiëren met behulp van pre- en post synaptic markeringen onderzoeken aangetoond. Kritische stappen omvatten het opstellen van goede hippocampal segmenten, een fixatie tijd van maximaal 1 uur in de toepassing van genoeg montage medium, PFA, het gebruik van betrouwbare antilichamen, passende overname Afbeeldingsinstellingen en strenge synaptische puncta detectie. Uiteindelijk, deze methode is relatief snel en gemakkelijk reproduceerbaar is door alle laboratoria die toegang tot een confocal microscoop hebben.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door het MRC, EU FP7, ARUK, Wellcome Trust en Parkinson UK. Wij wil ook mevrouw Johanna Buchler bedanken voor haar bijdrage van confocal beelden en de leden van de lab voor hun constructieve inbreng over het manuscript en de methodologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Primary antibody | Millipore | AB5905 | vGlut1 (1:2000) |
| Primary antibody | Thermo Scientific | MA1-046 | PSD-95 (1:500) |
| Primary antibody | Synaptic Systems | 131 004 | vGAT (1:500) |
| Primary antibody | Synaptic Systems | 147011 | Gephyrin (1:500) |
| Primary antibody | Abcam | ab5392 | MAP2 (1:10000) |
| Secondary antibody | Jackson Laboratories | 706-545-148 | Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600) |
| Secondary antibody | Abcam | ab175470 | Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600) |
| Mounting medium | SouthernBiotech | 00-4958-02 | Fluoromount-G |
| Confocal Microscope | Olympus | NA | FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%. |
| Analysis software | PerkinElmer | NA | Volocity |
| Scalpel | Swann-Morton | 203 | No 11 |
| Super Glue | Loctite | 1446875 | |
| 95% O2, 5% CO2 | BOC | NA | Cylinder |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Glass slides | Thermo | 7107 | 08-1.0mm thick |
| Petri Dish | Corning | 430167 | |
| iDkk1 mice | N/A | N/A | Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKIIα rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKIIα rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for solutions: | |||
| NaCl | Sigma | V800372 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| Ca2Cl | Sigma | 223506 | |
| Mg2Cl | Sigma | M9272 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71505 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| D-Glucose | Sigma | G5767 | |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Triton-X | Sigma | T8787 | |
| Donkey Serum | Millipore | S30-100ml | |
| PFA | Sigma | P6148 |
References
- Malenka, R. C., Bear, M. F. LTP and LTD: an embarrassment of riches. Neuron. 44 (1), 5-21 (2004).
- Arendt, T. Synaptic degeneration in Alzheimer's disease. Acta Neuropathol. 118 (1), 167-179 (2009).
- Missler, M., Sudhof, T. C., Biederer, T. Synaptic cell adhesion. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (4), a005694 (2012).
- Chua, J. J., Kindler, S., Boyken, J., Jahn, R. The architecture of an excitatory synapse. J Cell Sci. 123 (Pt 6), 819-823 (2010).
- Dobie, F. A., Craig, A. M. Inhibitory synapse dynamics: coordinated presynaptic and postsynaptic mobility and the major contribution of recycled vesicles to new synapse formation. J Neurosci. 31 (29), 10481-10493 (2011).
- Jackson, R. J., et al. Human tau increases amyloid beta plaque size but not amyloid beta-mediated synapse loss in a novel mouse model of Alzheimer's disease. Eur J Neurosci. 44 (12), 3056-3066 (2016).
- Heck, N., et al. A new automated 3D detection of synaptic contacts reveals the formation of cortico-striatal synapses upon cocaine treatment in vivo. Brain Struct Funct. 220 (5), 2953-2966 (2015).
- Sultana, R., Banks, W. A., Butterfield, D. A. Decreased levels of PSD95 and two associated proteins and increased levels of BCl2 and caspase 3 in hippocampus from subjects with amnestic mild cognitive impairment: Insights into their potential roles for loss of synapses and memory, accumulation of Abeta, and neurodegeneration in a prodromal stage of Alzheimer's disease. J Neurosci Res. 88 (3), 469-477 (2010).
- Harwell, C. S., Coleman, M. P. Synaptophysin depletion and intraneuronal Abeta in organotypic hippocampal slice cultures from huAPP transgenic mice. Mol Neurodegener. 11 (1), 44 (2016).
- Marzo, A., et al. Reversal of Synapse Degeneration by Restoring Wnt Signaling in the Adult Hippocampus. Curr Biol. 26 (19), 2551-2561 (2016).
- Zoghbi, H. Y., Bear, M. F. Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (3), (2012).
- Janezic, S., et al. Deficits in dopaminergic transmission precede neuron loss and dysfunction in a new Parkinson model. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), E4016-E4025 (2013).
- Caricasole, A., et al. Induction of Dickkopf-1, a negative modulator of the Wnt pathway, is associated with neuronal degeneration in Alzheimer's brain. J Neurosci. 24 (26), 6021-6027 (2004).
- De Ferrari, G. V., et al. Common genetic variation within the low-density lipoprotein receptor-related protein 6 and late-onset Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9434-9439 (2007).
- Liu, C. C., et al. Deficiency in LRP6-mediated Wnt signaling contributes to synaptic abnormalities and amyloid pathology in Alzheimer's disease. Neuron. 84 (1), 63-77 (2014).
- Purro, S. A., Dickins, E. M., Salinas, P. C. The Secreted Wnt Antagonist Dickkopf-1 Is Required for Amyloid beta-Mediated Synaptic Loss. J Neurosci. 32 (10), 3492-3498 (2012).
- Rosi, M. C., et al. Increased Dickkopf-1 expression in transgenic mouse models of neurodegenerative disease. J Neurochem. 112 (6), 1539-1551 (2010).
- Budnik, V., Salinas, P. C. Wnt signaling during synaptic development and plasticity. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 151-159 (2011).
- Ciani, L., et al. Wnt signalling tunes neurotransmitter release by directly targeting Synaptotagmin-1. Nat Commun. 6, 8302 (2015).
- Dickins, E. M., Salinas, P. C. Wnts in action: from synapse formation to synaptic maintenance. Front Cell Neurosci. 7, 162 (2013).
- Inestrosa, N. C., Varela-Nallar, L. Wnt signalling in neuronal differentiation and development. Cell Tissue Res. 359 (1), 215-223 (2015).
- Galli, S., et al. Deficient Wnt signalling triggers striatal synaptic degeneration and impaired motor behaviour in adult mice. Nat Commun. 5, 4992 (2014).
