Summary
En protokoll for å nøyaktig identifisere og analysere synapser i hippocampus skiver med immunofluorescence er beskrevet i denne artikkelen.
Abstract
I hjernen er synapser spesialisert veikryss mellom neurons, bestemme styrken og spredning av neuronal signalering. Antall synapser er strengt regulert under utvikling og neuronal modning. Viktigere, kan underskudd i synapse antall føre til kognitiv dysfunksjon. Derfor er evalueringen av synapse nummer en integrert del av nevrobiologi. Men som synapser er liten og svært kompakt i intakt hjernen, er vurdering av absolutt utfordrende. Denne protokollen beskriver en metode for å lett identifisere og evaluere synapser i hippocampus gnager skiver med immunofluorescence mikroskopi. Det inkluderer en tre-trinns prosedyre for å evaluere synapser i høy kvalitet AC confocal mikroskopi bilder ved å analysere den co lokaliseringen av pre- og postsynaptic proteiner i hippocampus skiver. Det forklarer også hvordan analyser utføres og gir eksemplene fra både eksitatoriske og inhibitory synapser. Denne protokollen gir et solid grunnlag for analyse av synapser og kan brukes på noen forskning undersøker struktur og funksjon av hjernen.
Introduction
Den menneskelige hjernen består av ca 1014 synapser. Synapse tall er strengt regulert under utviklingen og modningen av sentralnervesystemet (CNS). Gjennom utvikling, synapse nummer modulert av synaptogenesis og beskjæring til funksjonelle nevrale nettverk. Læring og hukommelse støttes av regulering av synapse nummeret og styrke, en prosess kjent som synaptic potensiering og depresjon1. Viktigere, er stabilisering av modne synapser avgjørende for å opprettholde nevronale nettverkstilkoblinger. Videre er underskudd i synapse tetthet rapportert i de tidlige stadiene av nevrodegenerative tilstander som Alzheimers sykdom (AD)2. Evnen til å nøyaktig identifisere og evaluere synapse tall er derfor grunnleggende for vurdering av hjernen fysiologi og patologi.
Den ekstreme tetthet og kompakt natur synapser gjør det utfordrende for å beregne nøyaktig antall i intakt hjernen områder. Kjemisk synapser i CNS er laget av to neurons i nærheten apposition, atskilt av en synaptic leppe3. Pre synaptic terminal, eller synaptic bouton, kommer fra en axon og består av akkumulert blemmer, som inneholder signalstoffer som definerer spesifisitet av en synapse-nemlig glutamat og gamma - aminobutyric acid (GABA) for eksitatoriske og hemmende synapser, henholdsvis. Membraner av blemmer inneholder vesicula transportører gjelder for hver nevrotransmitter: vesicula glutamat transporter (vGlut) for glutamat og vesicula GABA transporter (vGAT) for GABA. Etter synaptic terminalen er en svært tett struktur som består av flere proteiner, inkludert reseptorer, vedheft molekyler og stillaset proteiner. I eksitatoriske synapser er etter synaptic tetthet-95 protein (PSD-95) den mest tallrike stillaset protein4, modulerende eksitatoriske N-methyl-D-aspartate(NMDA-) og α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syre (AMPA-) reseptoren funksjonen, mens gephyrin forankrer hemmende reseptorer til hemmende etter synaptic terminal5. Samlet spesifisiteten av proteiner til pre- og post synaptic rom hjelp i differensiering og identifikasjon av synapse undertyper.
Evalueringen av synapse tall kan utføres med ulike teknikker. Den vanligste er bruk av elektronmikroskop (EM), som gjør at analyse av synapse i kompakt og intakt hjernen områder med høy forstørrelse og oppløsning. Men denne teknikken er svært dyrt, krever komplisert eksempel forberedelse, og er svært tidkrevende. Andre teknikker inkluderer bruk av matrise tomografi6, som har en stor ulempe ved at den krever spesialisert og dyrt utstyr for å utføre analysen. Videre transgene linjer uttrykke bestemt synaptic markører er nyttig vurdere synapse nummer7, men generasjonen av nye linjer kan være restriktiv og kostbare, og overuttrykte proteiner kan resultere i uønskede off-målet fenotyper.
På grunn av disse begrensningene og enkelhet vurdere mange forskere synapse nummer ved å undersøke total synaptic protein nivå. Imidlertid kan synapse tap observeres før vesentlige endringer i protein, som strukturelle synaptic remodeling resulterer i spredning av pre- eller post synaptic apposition, uten degradering av synaptic proteiner. Videre i Annonsen er synaptic protein nivå redusert følgende synapse degenerasjon eller neuronal død8,9. Kvantifisering av totale aktiveres ikke dette skillet. Dermed er det behov for å utvikle en pålitelig, tilgjengelig og nøyaktig metode for vurdering av synapse nummer i hjernen.
I denne artikkelen beskriver vi hvordan du grundig identifisere og bestemme antall synapser bruker immunofluorescence mikroskopi i hippocampus gnager hjernen skiver. Synapser defineres av colocalization av pre- og post synaptic merkene som vises i en vises punctate distribusjon. Viser vi gyldigheten av denne teknikken gjennom studiet av Wnt signalering i hjernen. Wnts er secreted proteiner viktig for dannelsen, eliminering og vedlikehold av synapser. I vivo induksjon av en secreted antagonist av Wnt cascade, Dickkopf-1 (Dkk1), fører til eksitatoriske synaptic tap samtidig bevare hemmende synapser i hippocampus10. Vi illustrerer identifikasjon og opptelling av eksitatoriske og inhibitory synapser i hippocampus skiver fra en voksen mus uttrykke Dkk1 og markere omsetningsbegrensninger på denne teknikken til andre typer vev/kultur forberedelser.
Protocol
alle eksperimenter ved hjelp av mus og rotter ble godkjent og utført med vedlegg 1 prosedyrer dekket under hjemmekontor dyr (vitenskapelig prosedyrer) act 1986. Kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) oppskriften kan finnes i tabell 1.
1. akutt hippocampus skive forberedelse
- Fjern musen hjernen så raskt som mulig, ved hjelp av en slikkepott og skarp saks til å klippe skallen, og plasser den i iskalde, oksygenert (95% O 2, 5% CO 2) høy-sukrose ACSF (~ 100 mL).
- Plasserer musen hjernen på en Petriskål og fjerne lillehjernen og en liten del av frontal cortex med skalpell før hemisecting ned midtlinjen av hjernen.
- Plassere de to halvdelene på siden som var klippe og lime hver halvkule på scenen av en vibratome.
- Klippe 200-300 µm tykke deler av hele regionen rundt. I hippocampus, ca 3-4 skiver per halvkule bør anskaffes.
- Bruker en plast Pasteur pipette, overføre sektorene til et kammer neddykket i oksygenrikt (95% O 2, 5% CO 2) ACSF. Opprettholde på 34 ° C i 30 min.
Merk: Behandling av skiver med aktive farmakologiske agenter, som rekombinant Dkk1 proteiner, kan utføres på dette stadiet ved å legge til agenter til sektor chamber. - Fjerne skiver fra kammeret ved hjelp av en pensel, plassere dem i en 24-vel plate og fastsette for 20 min til 1 h i 4% paraformaldehyde (PFA)/4% sukrose ved romtemperatur (RT).
Forsiktig: PFA er giftig, ha passende beskyttelse. - Vask skiver tre ganger i 1 X PBS (10 min hver).
Merk: Protokollen kan pauses her for 1-2 dager, så lenge skiver holdes i 4 ° C i 1 X PBS.
2. Immunofluorescence for Synaptic markører
Merk: oppskrifter på alle buffere brukt kan finnes i tabell 2.
- Erstatte PBS med blokkering/permeabilizing buffer (tabell 2) i skive brønnene og ruge på RT for 4-6 h.
- Fortynne polyklonale marsvin antistoffer mot vGlut1 på en 1:2,000 fortynning blokkerer/permeabilization buffer.
Merk: vGlut1 er en markør for pre synaptic eksitatoriske terminal visualisering. Etter synaptic eksitatoriske synapse identifikasjon, bruker et polyklonale antistoff mot PSD-95 og fortynnet 1:500 i den samme løsningen. Bruke et minimum antall 300 µL i hver brønn. For å identifisere hvor anatomiske hippocampus, kan du bruke et antistoff som kan også identifisere neuronal strukturen, for eksempel MAP2 eller Tubulin. Trene riktig konsentrasjonen av alle primære antistoffer for synaptic indikatorene valgfrihet (pre og post synaptic) og fortynne frisk blokkerer/permeabilizing buffer. - Ruge sektorene i den primære antistoff løsningen natten (eller 1-2 dager) på 4 ° C. Bruk en risting plattform med sterk bevegelse.
- Vask skiver tre ganger i PBS (10 min hver).
- Fortynne den aktuelle sekundære antistoffer 1:500 blokkerer buffer. For eksempel når du bruker vGlut1 marsvin antistoffer, bruke en sekundær antistoff som gjenkjenner marsvin komponenten (f.eks esel anti-guinea-gris) konjugert til en bestemt fluorophore. Når du bruker PSD-95 kanin antistoffer, bruke en sekundær antistoff som gjenkjenner kanin komponenten (f.eks esel anti-kanin) konjugert til en annen bestemt fluorophore.
- Ruge sektorene i denne løsningen for 2-3 h på RT. sikre at sektorene er beskyttet mot lyset, som sekundær antistoffer er lysfølsom.
- Vask skiver tre ganger i PBS (10 min hver).
- Nøye fjerne skiver fra 24-vel platen ved hjelp av en pensel og plassere dem jevnt på pre merket glass lysbilder. Legg en dråpe montering medium over hver skive og deretter forsiktig plassere et glass dekkglassvæske på sektorene. Unngå dannelse av luftbobler. Pass på å bruke nok montering medium (300-400 µL), som et lite beløp kan føre til tørr skiver.
- La tørke i minst 1-2 dager på RT og holde lysbildene beskyttet mot lyset.
- Lagre skliene i 4 ° C på kort sikt, men for langvarig lagring, holde dem på -20 ° C.
3. AC confocal bildeopptak og analyse
- Imaging bruker AC confocal mikroskopi for laserskanning.
- Identifisere regionen hippocampus til å avbildes (f.eks cornu ammonis 1 og 3 (CA1, CA3) eller det dentate gyrus (DG)) ved hjelp av en 10 x eller 20 x målet.
- Endre til en 40 x eller 63 x oljeneddyp målet sektor anatomi er intakt ved å identifisere kontinuerlig neurites og organisert struktur. Bruke en neuronal markør, som MAP2, som referanse ( figur 1A).
- Deretter bytte til en 60 x oljeneddyp mål (NA = ~1.3 - 1.4) og justere innstillingene for hver kanal å motta optimale signaler og kontrast. Angi intensiteten på hvert laser å unngå metning av bildepunkter en høy / lav kontrast alternativet.
Merk: Disse innstillingen vil avhenge av mikroskopet brukes, men bruke Tabellen for materiale om laser strøminnstillingene i figur 2, Figur 3, og Figur 4. For best resultat, bruk en 1024 x 1024-pikslers oppløsning. Innstillingene skal være konstant gjennom de ulike forholdene av samme eksperiment. Ekstra zoom kan brukes om nødvendig. - Vurdere dybden der den flekker er selv og tilegne seg bildestakker minst 8 equidistant (250 nm) fly. Så ta 3 tilstøtende representant bilder stabler fra det samme området rundt per sektor.
Merk: Dybden kan variere fra én sektor til en annen, men bør alltid være ca 2-5 µm fra overflaten av sektoren. - Gjenta oppkjøpet i minst 3 skiver per tilstand og fra 6-8 dyr per behandlingsgruppe.
- Bildeanalyse.
Merk: Bruk en automatisert image analyseprogramvare (se Tabell for materiale). Merk at noen systemer krever en lisens, mens andre er gratis, som ImageJ. Programvaren som brukes må analysere bildene i 3D ved å ta hensyn alle fly av stabelen fotografert. Se Tabellen for materiale for detaljer om programvaren som brukes i bildeanalyse ( figur 1).- Bruk en egendefinert-baserte intensitet terskelen protokoll å identifisere alle synaptic puncta og neuronal markører, som er optimalisert og valgt i programvaren manuelt [se Tabellen for materiale for bestemte programvare i denne protokollen].
Merk: Programvaren identifiserer et minimum og maksimum intensitet for hver fluorophore og knytter en prosentandel av intensitet for hvert anerkjent objekt. Merk at andelen intensitet vil variere fluorophore brukt og antistoffer mot synaptic markøren. - For synaptic markører, sikre at størrelse filtre (> 0.1µm 3 og < 0.8µm 3) er valgt i programvaren og brukes på bildet. Justere parametere for å sikre at objektene ikke overlapper. Utelate objekter som er for stor eller for liten vurderes synaptic puncta (se figur 2B).
Merk: Når optimalisert, til samme terskelverdiene gjelder deretter alle avbildninger i en bestemt eksperiment. - Kvantifisere gjennomsnittlig antall, intensitet og volumet av individuelle synaptic puncta (pre eller post synaptic) med optimalisert terskelen protokollene valgt i programvaren. Normalisere puncta tallet volumet av bildefeltet (omtrent 16,928 µm 3 i systemet brukes her). Normalisere synaptic puncta intensiteten til intensiteten av referanse neuronal markøren.
Merk: Synapser er definert som den co lokaliseringen mellom både før og etter synaptic markører. Når terskelen protokollene for pre- og post synaptic puncta hAve er etablert, programvaren bør identifisere den co lokaliseringen av synaptic puncta som overlapper 1 bildepunkt eller mer i et enkelt fly.
Merk: For statistisk analyse, Bekreft at alle sett av prøver følger normalitet og homogenitet avvikstype, som bestemmes av Lilliefords og χ2-tester, henholdsvis. Eksempler viser en normalfordeling og homogenitet avvik skal analyseres med parametriske tester, som beskrevet nedenfor. For eksempel bør eksitatoriske synaptic puncta analyse utføres med en én-veis VARIANSANALYSE med blokkering og replikering. Hvert enkelt eksperiment bør betraktes som en blokk; Det er vanligvis tre uavhengige eksperimenter, hver med 1-3 mus fra hver betingelse.
- Bruk en egendefinert-baserte intensitet terskelen protokoll å identifisere alle synaptic puncta og neuronal markører, som er optimalisert og valgt i programvaren manuelt [se Tabellen for materiale for bestemte programvare i denne protokollen].
figur 1: analyse av synaptic puncta bruke bildeanalyser serverprogramvaren. (A) skjermbilde av protokollen for tilpassing av intensitet terskel. Eksempelet er for PSD-95, der den valgte puncta har en definert størrelse > 0,1 µm 3 og < 0,8 µm 3 og nåværende minimerte overlappende objekter. Merk at bildet som vises for en AC confocal flyet aktivere enklere visualisering av synaptic puncta og nøyaktig parameteren utvalg. (B) skjermbilde av analysen utgang fra programvaren (etter valget av optimalisert protokollen). Et eksempel på rå synaptic puncta nummer målinger basert på volumet. Disse verdiene blir deretter eksportert til et regnearkprogram. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
figur 2: kvalitetskontroll skive og parameteren innstillingene for synaptic puncta. (A) representant AC confocal bilder (40 x objektiv) i regionen rundt: CA1 stratum radiatum (sr) og stratum oriens (så) en hippocampus sektoren identifiseres av MAP2 flekker. Skala bar = 2 µm. (B) AC Confocal bilder (60 x mål og en ekstra 1,3 X forstørrelse på oppkjøp programvare) av CA1 stratum radiatum, med eksitatoriske markører-vGlut1 (grønn) og PSD-95 (rød)-fra hippocampus sektorene. Merk identifikasjon av klare pre og post synaptic puncta. Puncta større enn 0,8 µm 3 utelates fra kvantifisering (hvite piler). Skala bar = 2 µm (C) Confocal bilder (60 x mål og en ekstra 1,3 X forstørrelse på oppkjøp programvare) av CA1 stratum radiatum, med eksitatoriske markører-vGlut1 (grønn)-fra kryostaten-kutt hippocampus inndelinger fra hele hjernen fast PFA. Merk store hull og uregelmessig, klumpet seg vGlut1 flekker. Skala bar = 2 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Representative Results
Synapse brutt tidlig i nevrodegenerative sykdommer som Annonsen og Parkinsons sykdom2,11,12. Molekylære mekanismer underliggende disse underskudd beholdes imidlertid dårlig forstått. Mangler i Wnt signalnettverk er forbundet med Annonsen,13,,14,,15,,16,,17. Wnts er secreted glykoproteiner og spiller en viktig rolle i synapse dannelse og modulering av synaptic overføring18,19,20,21. Nylig har identifisert vi Wnts som nøkkel regulatorer synaptic vedlikehold i de eldre nervesystem10,22. Å nøyaktig studere virkningen av Wnt signalisering på synapser prefiks av genmodifiserte mus, tok vi fordel av hjernen stykke forberedelse og AC confocal mikroskopi evaluere synapse tallet endres. Vi identifisert sunn skiver som strukturen var godt bevart (figur 2A). Videre var den synaptiske puncta nøye definert, med utelukkelse av stor farget objekter sannsynligvis som representerer aggregert proteiner (figur 2B). Dette kriteriet ble brukt på alle bilder, med samme strenge analyse parametere.
Vi brukte en transgene modellsystem som induserer uttrykk for secreted Wnt antagonist Dkk1 i voksen mus (iDkk1) under tetracycline styre (se Tabell for materiale)10,22. Vi viste at blokaden av Wnt signalering i voksen hippocampus utløser eksitatoriske synapse tap i CA1 stratum radiatum regionen (Figur 3). Figur 3A illustrerer representant AC confocal bilder av eksitatoriske pre og post synaptic markører (vGlut1 og PSD-95, henholdsvis) kjøpt fra hippocampus skiver av iDkk1 mus uttrykke Dkk1 for to uker, samt sine respektive kontroller. Vi analyserte disse bildene med Volocity programvare og viste en betydelig reduksjon i antall eksitatoriske synapser, kvantifisert ved den co lokaliseringen av vGlut1 - og PSD-95-merket puncta i området CA1 hippocampus iDkk1 mus etter den induksjon av Dkk1 i to uker (figur 3B, * p < 0,05; Kruskal-Wallis test; 6 mus per genotype). I CA1 stratum radiatum, ble hvor eksitatoriske synapse puncta per 1000 µm3 redusert fra 500 i kontroll mus til 300 iDkk1 mus. Derimot indusert Dkk1 uttrykk ikke påvirke antall hemmende synapser (identifisert av den co lokaliseringen mellom pre og post synaptic markørene vGAT og gephyrin, henholdsvis), som vist i figur 4A-B (p > 0,05; Kruskal-Wallis test; 3 mus per genotype).
Viktigere, utført vi en statistisk styrke analyse for å beregne det aktuelle antallet skiver og dyr å generere disse robust resultatene. Bruker R, vi beregnet at omtrent 35 stykker per betingelse var nødvendig (3 bilder x 3 skiver x 6 dyr = 36) å oppdage en stor effekt størrelse (f = 0,4) med 80% sikkerhet (makt = 0,8) i en enveis VARIANSANALYSE med blokkering og replikering, som beskrevet i trinn 3.2.6.
Figur 3: tap av eksitatoriske synapser i hippocampus skiver fra iDkk1 mus. (A) representant AC confocal bilder av de CA1 stratum radiatum Vis eksitatoriske synapser, identifisert av co lokalisering mellom vGlut1 og PSD-95 (hvite piler). Nedre panel representerer en høyere forstørrelse på merkede rektanglet. Skalere barer = 2 µm. (B) prosentandelen av eksitatoriske synapser mellom kontrollen og iDkk1 ble kvantifisert bruker programvaren som er nevnt i Tabellen av materialer (* p < 0,05; Kruskal-Wallis test; 6 mus per genotype). Dataene er representert ± SEM. Dette tallet er endret fra referanse10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: hemmende synapser er uendret i hippocampus skiver fra iDkk1 mus. (A) representant bilder AC confocal av CA1 stratum radiatum av hemmende synapser identifisert av den co lokaliseringen mellom vGAT og gephyrin (hvite piler). Nedre panel representerer en høyere forstørrelse på merkede rektanglet. Skalere barer = 2 µm. (B) andelen hemmende synapser mellom kontroll og iDkk1 mus, som kvantifisert ved hjelp av Volocity programvare (p > 0,05; Kruskal-Wallis test; 3 mus per genotype). Dataene er representert ± SEM. Dette tallet er endret fra referanse10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| High Sukrose ACSF komponenter | Konsentrasjon | Notater |
| NaCl | 75 mM | |
| NaHCO3 | 25 mM | |
| KCl | 2.5 mM | |
| NaH2PO4, 2 H2O | 1,25 mM | |
| Kynurenic syre | 1,25 mM | |
| Pyruvic syre | 2 mM | |
| EDTA | 0,1 mM | |
| CaCl2 | 1 mM | Legge etter oksygenering av løsning |
| MgCl2 | 4 mM | Legge etter oksygenering av løsning |
| D-glukose | 25 mM | |
| Sukrose | 100 mM | |
| Neddykket kammer ACSF komponenter | ||
| NaCl | 125 mM | |
| NaHCO3 | 25 mM | |
| KCl | 2.5 mM | |
| NaH2PO4, 2 H2O | 1,25 mM | |
| CaCl2 | 1 mM | Legge etter oksygenering av løsning |
| MgCl2 |
Tabell 1: ACSF komposisjon.
| Blokkering/permeabilizing Buffer | Konsentrasjon | Notater |
| Esel serum | 10% | |
| Triton-X | 0,50% | |
| PBS | 1 x | |
| 10 x PBS | pH 7,4 | |
| NaCl | 1.37 M | |
| KCl | 27 mM | |
| NaH2PO4 | 100 mM | |
| KH2PO4 | 18 mM | |
| 4% PFA/4% sukrose | pH 7,4 | |
| PBS | 1 x | Fortynne fra 10 x |
| PFA | 1.33 M | |
| Sukrose | 117 mM |
Tabell 2: Buffere brukes for immunofluorescent flekker.
Discussion
Presis evalueringen av synapse er avgjørende for feltet av nevrovitenskap. Her viser vi hvordan man skal vurdere tettheten av synapser i CA1 stratum radiatum regionen hippocampus skiver som modellsystem. Betydningen med hensyn til eksisterende metoder er demonstrert i vår siste artikkel forskning på effekten av Wnt mangel prefiks og hvor vi også vurdert synapse nummer av enkelt-delen EM10. Omfanget av synapse tap ligner mellom enkelt-delen EM og hjerne-skive metoden beskrevet her10. Dermed viser dette funnet nøyaktigheten og påliteligheten av teknikken.
Viktigere, er en begrensning av både enkelt-delen EM og immunostai-synapser, som presenteres her, manglende evne til å nøyaktig beregne absolutt synapse nummeret for en bestemt hjernen regionen. Faktisk, det er viktig å identifisere globale morfologiske endringer, som endringer i totale volumet kan påvirke synaptic tall. En annen begrensning er at visse antistoffer er mindre effektiv på flekker intakt hjernen regioner, delvis på grunn av ekstrem tettheten av synaptic tilkoblinger. Vi opplevde høyere kvalitet farging av vGlut1 og gephyrin i denne sektoren forberedelser og etterfølgende PFA fiksering maksimalt 1 h, sammenlignet med umiddelbare fiksering av hele hjernen PFA (figur 2C). Sistnevnte førte til klumpet seg synaptic flekker, med hull i vevet. Likevel er vGlut1 antistoff gjennomtrengning fortsatt begrenset i begge metoder (et par titalls mikrometer). Vi overvinne ikke denne begrensningen, selv med økt antistoff inkubering, men gi antistoff gjennomtrengning er større enn totalt dybden som er fotografert, bør det være ingen innvirkning på sluttresultatet. Videre bør forsiktighet tas å sikre at den flekker er selv gjennom hele ervervet stakken.
I vår studie ønsket vi å skille eksitatoriske fra hemmende synapser. Derfor valgte vi vGlut1/PSD-95 og vGAT/gephyrin, henholdsvis som disse proteinene er svært uttrykt voksen mus prefiks og gjelder for hver synapse undertype4,5. Andre eksitatoriske og inhibitory synaptic markører kunne blitt brukt til å identifisere hver respektive synapse, som reseptorer beriket på hver synapse, inkludert NMDA og AMPA reseptorer for eksitatoriske og GABAA reseptorer for hemmende synapser. Andre nevrotransmittere eller neuromodulators kan også bli identifisert med våre protokollen, at spesifikke antistoffer er tilgjengelig, som vist for dopaminergic synapser i striatum22. I tillegg kan å hver skive til 120 µm delvis overvinne lav antall prøver innhentet med akutt skiver, som er viktig for studier i liten hjerne strukturer som amygdala.
Fremtidige anvendelser av våre protokollen kan implementeres i studiet av ulike hjernen områder og lidelser. For eksempel i striatum (en region av hjernen knyttet Parkinson's sykdom), kan en kombinasjon av vGlut2/PSD-95 eller vGlut1/PSD-95 brukes til å skille mellom de eksitatoriske synapser fra afferente kommer fra cortex eller thalamus, henholdsvis22.
I konklusjonen, har vi vist en pålitelig metode for å undersøke antall synapser i hjernen vev bruker pre og post synaptic markører til å definere en synapse. Kritisk trinnene omfatter utarbeidelse av god hippocampus skiver, gangen fiksering på opptil 1 h i PFA, anvendelse av nok montering middels, bruk av pålitelig antistoffer, aktuelle bildet oppkjøpet innstillinger og strenge synaptic puncta gjenkjenning. Til slutt, denne metoden er relativt rask og er å reprodusere av noen laboratorier som har tilgang til AC confocal mikroskop.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av MRC, EU FP7, ARUK, Wellcome Trust og Parkinson's UK. Vi ønsker også å takke Ms. Johanna Buchler for hennes bidrag av AC confocal bilder og medlemmer av laboratoriet konstruktiv innspill på manuskriptet og metodikk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Primary antibody | Millipore | AB5905 | vGlut1 (1:2000) |
| Primary antibody | Thermo Scientific | MA1-046 | PSD-95 (1:500) |
| Primary antibody | Synaptic Systems | 131 004 | vGAT (1:500) |
| Primary antibody | Synaptic Systems | 147011 | Gephyrin (1:500) |
| Primary antibody | Abcam | ab5392 | MAP2 (1:10000) |
| Secondary antibody | Jackson Laboratories | 706-545-148 | Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600) |
| Secondary antibody | Abcam | ab175470 | Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600) |
| Mounting medium | SouthernBiotech | 00-4958-02 | Fluoromount-G |
| Confocal Microscope | Olympus | NA | FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%. |
| Analysis software | PerkinElmer | NA | Volocity |
| Scalpel | Swann-Morton | 203 | No 11 |
| Super Glue | Loctite | 1446875 | |
| 95% O2, 5% CO2 | BOC | NA | Cylinder |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Glass slides | Thermo | 7107 | 08-1.0mm thick |
| Petri Dish | Corning | 430167 | |
| iDkk1 mice | N/A | N/A | Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKIIα rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKIIα rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for solutions: | |||
| NaCl | Sigma | V800372 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| Ca2Cl | Sigma | 223506 | |
| Mg2Cl | Sigma | M9272 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71505 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| D-Glucose | Sigma | G5767 | |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Triton-X | Sigma | T8787 | |
| Donkey Serum | Millipore | S30-100ml | |
| PFA | Sigma | P6148 |
References
- Malenka, R. C., Bear, M. F. LTP and LTD: an embarrassment of riches. Neuron. 44 (1), 5-21 (2004).
- Arendt, T. Synaptic degeneration in Alzheimer's disease. Acta Neuropathol. 118 (1), 167-179 (2009).
- Missler, M., Sudhof, T. C., Biederer, T. Synaptic cell adhesion. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (4), a005694 (2012).
- Chua, J. J., Kindler, S., Boyken, J., Jahn, R. The architecture of an excitatory synapse. J Cell Sci. 123 (Pt 6), 819-823 (2010).
- Dobie, F. A., Craig, A. M. Inhibitory synapse dynamics: coordinated presynaptic and postsynaptic mobility and the major contribution of recycled vesicles to new synapse formation. J Neurosci. 31 (29), 10481-10493 (2011).
- Jackson, R. J., et al. Human tau increases amyloid beta plaque size but not amyloid beta-mediated synapse loss in a novel mouse model of Alzheimer's disease. Eur J Neurosci. 44 (12), 3056-3066 (2016).
- Heck, N., et al. A new automated 3D detection of synaptic contacts reveals the formation of cortico-striatal synapses upon cocaine treatment in vivo. Brain Struct Funct. 220 (5), 2953-2966 (2015).
- Sultana, R., Banks, W. A., Butterfield, D. A. Decreased levels of PSD95 and two associated proteins and increased levels of BCl2 and caspase 3 in hippocampus from subjects with amnestic mild cognitive impairment: Insights into their potential roles for loss of synapses and memory, accumulation of Abeta, and neurodegeneration in a prodromal stage of Alzheimer's disease. J Neurosci Res. 88 (3), 469-477 (2010).
- Harwell, C. S., Coleman, M. P. Synaptophysin depletion and intraneuronal Abeta in organotypic hippocampal slice cultures from huAPP transgenic mice. Mol Neurodegener. 11 (1), 44 (2016).
- Marzo, A., et al. Reversal of Synapse Degeneration by Restoring Wnt Signaling in the Adult Hippocampus. Curr Biol. 26 (19), 2551-2561 (2016).
- Zoghbi, H. Y., Bear, M. F. Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (3), (2012).
- Janezic, S., et al. Deficits in dopaminergic transmission precede neuron loss and dysfunction in a new Parkinson model. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), E4016-E4025 (2013).
- Caricasole, A., et al. Induction of Dickkopf-1, a negative modulator of the Wnt pathway, is associated with neuronal degeneration in Alzheimer's brain. J Neurosci. 24 (26), 6021-6027 (2004).
- De Ferrari, G. V., et al. Common genetic variation within the low-density lipoprotein receptor-related protein 6 and late-onset Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9434-9439 (2007).
- Liu, C. C., et al. Deficiency in LRP6-mediated Wnt signaling contributes to synaptic abnormalities and amyloid pathology in Alzheimer's disease. Neuron. 84 (1), 63-77 (2014).
- Purro, S. A., Dickins, E. M., Salinas, P. C. The Secreted Wnt Antagonist Dickkopf-1 Is Required for Amyloid beta-Mediated Synaptic Loss. J Neurosci. 32 (10), 3492-3498 (2012).
- Rosi, M. C., et al. Increased Dickkopf-1 expression in transgenic mouse models of neurodegenerative disease. J Neurochem. 112 (6), 1539-1551 (2010).
- Budnik, V., Salinas, P. C. Wnt signaling during synaptic development and plasticity. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 151-159 (2011).
- Ciani, L., et al. Wnt signalling tunes neurotransmitter release by directly targeting Synaptotagmin-1. Nat Commun. 6, 8302 (2015).
- Dickins, E. M., Salinas, P. C. Wnts in action: from synapse formation to synaptic maintenance. Front Cell Neurosci. 7, 162 (2013).
- Inestrosa, N. C., Varela-Nallar, L. Wnt signalling in neuronal differentiation and development. Cell Tissue Res. 359 (1), 215-223 (2015).
- Galli, S., et al. Deficient Wnt signalling triggers striatal synaptic degeneration and impaired motor behaviour in adult mice. Nat Commun. 5, 4992 (2014).
