En protokoll for å nøyaktig identifisere og analysere synapser i hippocampus skiver med immunofluorescence er beskrevet i denne artikkelen.
I hjernen er synapser spesialisert veikryss mellom neurons, bestemme styrken og spredning av neuronal signalering. Antall synapser er strengt regulert under utvikling og neuronal modning. Viktigere, kan underskudd i synapse antall føre til kognitiv dysfunksjon. Derfor er evalueringen av synapse nummer en integrert del av nevrobiologi. Men som synapser er liten og svært kompakt i intakt hjernen, er vurdering av absolutt utfordrende. Denne protokollen beskriver en metode for å lett identifisere og evaluere synapser i hippocampus gnager skiver med immunofluorescence mikroskopi. Det inkluderer en tre-trinns prosedyre for å evaluere synapser i høy kvalitet AC confocal mikroskopi bilder ved å analysere den co lokaliseringen av pre- og postsynaptic proteiner i hippocampus skiver. Det forklarer også hvordan analyser utføres og gir eksemplene fra både eksitatoriske og inhibitory synapser. Denne protokollen gir et solid grunnlag for analyse av synapser og kan brukes på noen forskning undersøker struktur og funksjon av hjernen.
Den menneskelige hjernen består av ca 1014 synapser. Synapse tall er strengt regulert under utviklingen og modningen av sentralnervesystemet (CNS). Gjennom utvikling, synapse nummer modulert av synaptogenesis og beskjæring til funksjonelle nevrale nettverk. Læring og hukommelse støttes av regulering av synapse nummeret og styrke, en prosess kjent som synaptic potensiering og depresjon1. Viktigere, er stabilisering av modne synapser avgjørende for å opprettholde nevronale nettverkstilkoblinger. Videre er underskudd i synapse tetthet rapportert i de tidlige stadiene av nevrodegenerative tilstander som Alzheimers sykdom (AD)2. Evnen til å nøyaktig identifisere og evaluere synapse tall er derfor grunnleggende for vurdering av hjernen fysiologi og patologi.
Den ekstreme tetthet og kompakt natur synapser gjør det utfordrende for å beregne nøyaktig antall i intakt hjernen områder. Kjemisk synapser i CNS er laget av to neurons i nærheten apposition, atskilt av en synaptic leppe3. Pre synaptic terminal, eller synaptic bouton, kommer fra en axon og består av akkumulert blemmer, som inneholder signalstoffer som definerer spesifisitet av en synapse-nemlig glutamat og gamma – aminobutyric acid (GABA) for eksitatoriske og hemmende synapser, henholdsvis. Membraner av blemmer inneholder vesicula transportører gjelder for hver nevrotransmitter: vesicula glutamat transporter (vGlut) for glutamat og vesicula GABA transporter (vGAT) for GABA. Etter synaptic terminalen er en svært tett struktur som består av flere proteiner, inkludert reseptorer, vedheft molekyler og stillaset proteiner. I eksitatoriske synapser er etter synaptic tetthet-95 protein (PSD-95) den mest tallrike stillaset protein4, modulerende eksitatoriske N-methyl-D-aspartate(NMDA-) og α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syre (AMPA-) reseptoren funksjonen, mens gephyrin forankrer hemmende reseptorer til hemmende etter synaptic terminal5. Samlet spesifisiteten av proteiner til pre- og post synaptic rom hjelp i differensiering og identifikasjon av synapse undertyper.
Evalueringen av synapse tall kan utføres med ulike teknikker. Den vanligste er bruk av elektronmikroskop (EM), som gjør at analyse av synapse i kompakt og intakt hjernen områder med høy forstørrelse og oppløsning. Men denne teknikken er svært dyrt, krever komplisert eksempel forberedelse, og er svært tidkrevende. Andre teknikker inkluderer bruk av matrise tomografi6, som har en stor ulempe ved at den krever spesialisert og dyrt utstyr for å utføre analysen. Videre transgene linjer uttrykke bestemt synaptic markører er nyttig vurdere synapse nummer7, men generasjonen av nye linjer kan være restriktiv og kostbare, og overuttrykte proteiner kan resultere i uønskede off-målet fenotyper.
På grunn av disse begrensningene og enkelhet vurdere mange forskere synapse nummer ved å undersøke total synaptic protein nivå. Imidlertid kan synapse tap observeres før vesentlige endringer i protein, som strukturelle synaptic remodeling resulterer i spredning av pre- eller post synaptic apposition, uten degradering av synaptic proteiner. Videre i Annonsen er synaptic protein nivå redusert følgende synapse degenerasjon eller neuronal død8,9. Kvantifisering av totale aktiveres ikke dette skillet. Dermed er det behov for å utvikle en pålitelig, tilgjengelig og nøyaktig metode for vurdering av synapse nummer i hjernen.
I denne artikkelen beskriver vi hvordan du grundig identifisere og bestemme antall synapser bruker immunofluorescence mikroskopi i hippocampus gnager hjernen skiver. Synapser defineres av colocalization av pre- og post synaptic merkene som vises i en vises punctate distribusjon. Viser vi gyldigheten av denne teknikken gjennom studiet av Wnt signalering i hjernen. Wnts er secreted proteiner viktig for dannelsen, eliminering og vedlikehold av synapser. I vivo induksjon av en secreted antagonist av Wnt cascade, Dickkopf-1 (Dkk1), fører til eksitatoriske synaptic tap samtidig bevare hemmende synapser i hippocampus10. Vi illustrerer identifikasjon og opptelling av eksitatoriske og inhibitory synapser i hippocampus skiver fra en voksen mus uttrykke Dkk1 og markere omsetningsbegrensninger på denne teknikken til andre typer vev/kultur forberedelser.
Presis evalueringen av synapse er avgjørende for feltet av nevrovitenskap. Her viser vi hvordan man skal vurdere tettheten av synapser i CA1 stratum radiatum regionen hippocampus skiver som modellsystem. Betydningen med hensyn til eksisterende metoder er demonstrert i vår siste artikkel forskning på effekten av Wnt mangel prefiks og hvor vi også vurdert synapse nummer av enkelt-delen EM10. Omfanget av synapse tap ligner mellom enkelt-delen EM og hjerne-skive metoden beskrevet her10. Dermed viser dette funnet nøyaktigheten og påliteligheten av teknikken.
Viktigere, er en begrensning av både enkelt-delen EM og immunostai-synapser, som presenteres her, manglende evne til å nøyaktig beregne absolutt synapse nummeret for en bestemt hjernen regionen. Faktisk, det er viktig å identifisere globale morfologiske endringer, som endringer i totale volumet kan påvirke synaptic tall. En annen begrensning er at visse antistoffer er mindre effektiv på flekker intakt hjernen regioner, delvis på grunn av ekstrem tettheten av synaptic tilkoblinger. Vi opplevde høyere kvalitet farging av vGlut1 og gephyrin i denne sektoren forberedelser og etterfølgende PFA fiksering maksimalt 1 h, sammenlignet med umiddelbare fiksering av hele hjernen PFA (figur 2C). Sistnevnte førte til klumpet seg synaptic flekker, med hull i vevet. Likevel er vGlut1 antistoff gjennomtrengning fortsatt begrenset i begge metoder (et par titalls mikrometer). Vi overvinne ikke denne begrensningen, selv med økt antistoff inkubering, men gi antistoff gjennomtrengning er større enn totalt dybden som er fotografert, bør det være ingen innvirkning på sluttresultatet. Videre bør forsiktighet tas å sikre at den flekker er selv gjennom hele ervervet stakken.
I vår studie ønsket vi å skille eksitatoriske fra hemmende synapser. Derfor valgte vi vGlut1/PSD-95 og vGAT/gephyrin, henholdsvis som disse proteinene er svært uttrykt voksen mus prefiks og gjelder for hver synapse undertype4,5. Andre eksitatoriske og inhibitory synaptic markører kunne blitt brukt til å identifisere hver respektive synapse, som reseptorer beriket på hver synapse, inkludert NMDA og AMPA reseptorer for eksitatoriske og GABAA reseptorer for hemmende synapser. Andre nevrotransmittere eller neuromodulators kan også bli identifisert med våre protokollen, at spesifikke antistoffer er tilgjengelig, som vist for dopaminergic synapser i striatum22. I tillegg kan å hver skive til 120 µm delvis overvinne lav antall prøver innhentet med akutt skiver, som er viktig for studier i liten hjerne strukturer som amygdala.
Fremtidige anvendelser av våre protokollen kan implementeres i studiet av ulike hjernen områder og lidelser. For eksempel i striatum (en region av hjernen knyttet Parkinson’s sykdom), kan en kombinasjon av vGlut2/PSD-95 eller vGlut1/PSD-95 brukes til å skille mellom de eksitatoriske synapser fra afferente kommer fra cortex eller thalamus, henholdsvis22.
I konklusjonen, har vi vist en pålitelig metode for å undersøke antall synapser i hjernen vev bruker pre og post synaptic markører til å definere en synapse. Kritisk trinnene omfatter utarbeidelse av god hippocampus skiver, gangen fiksering på opptil 1 h i PFA, anvendelse av nok montering middels, bruk av pålitelig antistoffer, aktuelle bildet oppkjøpet innstillinger og strenge synaptic puncta gjenkjenning. Til slutt, denne metoden er relativt rask og er å reprodusere av noen laboratorier som har tilgang til AC confocal mikroskop.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av MRC, EU FP7, ARUK, Wellcome Trust og Parkinson’s UK. Vi ønsker også å takke Ms. Johanna Buchler for hennes bidrag av AC confocal bilder og medlemmer av laboratoriet konstruktiv innspill på manuskriptet og metodikk.
Vibratome | Leica | VT1000S | |
Primary antibody | Millipore | AB5905 | vGlut1 (1:2000) |
Primary antibody | Thermo Scientific | MA1-046 | PSD-95 (1:500) |
Primary antibody | Synaptic Systems | 131 004 | vGAT (1:500) |
Primary antibody | Synaptic Systems | 147011 | Gephyrin (1:500) |
Primary antibody | Abcam | ab5392 | MAP2 (1:10000) |
Secondary antibody | Jackson Laboratories | 706-545-148 | Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600) |
Secondary antibody | Abcam | ab175470 | Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600) |
Mounting medium | SouthernBiotech | 00-4958-02 | Fluoromount-G |
Confocal Microscope | Olympus | NA | FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%. |
Analysis software | PerkinElmer | NA | Volocity |
Scalpel | Swann-Morton | 203 | No 11 |
Super Glue | Loctite | 1446875 | |
95% O2, 5% CO2 | BOC | NA | Cylinder |
24-well plate | Corning | 3524 | |
Glass slides | Thermo | 7107 | 08-1.0mm thick |
Petri Dish | Corning | 430167 | |
iDkk1 mice | N/A | N/A | Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKIIα rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKIIα rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents for solutions: | |||
NaCl | Sigma | V800372 | |
KCl | Sigma | P9333 | |
Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
Ca2Cl | Sigma | 223506 | |
Mg2Cl | Sigma | M9272 | |
NaH2PO4 | Sigma | 71505 | |
Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
EDTA | Sigma | E6758 | |
D-Glucose | Sigma | G5767 | |
Sucrose | Sigma | S8501 | |
Triton-X | Sigma | T8787 | |
Donkey Serum | Millipore | S30-100ml | |
PFA | Sigma | P6148 |