本文概述了一种用免疫荧光法准确识别和分析海马切片突触的协议。
在大脑中, 突触是神经元之间的特殊接合点, 决定神经元信号的强度和传播。突触的数量在发育和神经元成熟过程中受到严格的调控。重要的是, 突触数的缺陷会导致认知功能障碍。因此, 对突触数的评价是神经生物学的一个组成部分。然而, 由于突触在完整的大脑中是小而紧凑的, 对绝对数的评估是有挑战性的。本协议描述了一种使用免疫荧光显微镜轻松识别和评价海马鼠切片突触的方法。它包括一个三步的过程, 以评估突触的高品质共聚焦显微镜图像通过分析共存的前后突触蛋白在海马切片。它还解释了如何进行分析, 并给出了有代表性的例子, 从兴奋和抑制突触。该协议为神经突触的分析提供了坚实的基础, 可用于任何研究大脑结构和功能的调查。
人脑由大约 1014突触组成。突触数在中枢神经系统的发育和成熟过程中受到严格的调控。在整个发展过程中, 突触数通过突和修剪来调制, 形成功能性神经网络。学习和记忆是由突触数和强度的调节所支持的, 这一过程称为突触增强和抑郁症1。重要的是, 成熟突触的稳定对于维持神经元网络连接至关重要。此外, 在神经退行性疾病 (AD)2的早期阶段, 也报告了突触密度的缺陷。因此, 准确识别和评价突触数的能力是评估脑生理和病理的基础。
突触的极端密度和致密性使得在完整的脑区估计其精确数目具有挑战性。中枢神经系统中的化学突触由两个紧密并列的神经元组成, 由突触分裂的3分离。pre-synaptic 端, 或突触溥, 从轴突产生, 包括累积的囊泡, 其中含有神经递质, 定义突触的特异性, 即谷氨酸和伽玛丁酸 (GABA) 的兴奋性和抑制突触, 分别。囊泡中含有特定于每种神经递质的水泡转运体: 用于 gaba 的谷氨酸和水泡型 gaba 转运蛋白 (vGAT) 的水泡谷氨酸转运蛋白 (vGlut)。后终端是由多种蛋白质组成的高度致密的结构, 包括受体、黏附分子和支架蛋白。在兴奋性突触中, 后 density-95 蛋白 (PSD-95) 是最丰富的支架蛋白4, 调制兴奋性 n-甲基-d-天门冬氨酸 (NMDA) 和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-isoxazolepropionic 酸 (AMPA) 受体功能, 而 gephyrin 锚定抑制受体的抑制后终端5。总的来说, 蛋白质对前后室的特异性有助于突触亚型的分化和鉴定。
对突触数的评价可采用不同的方法进行。最常见的是使用电子显微镜 (EM), 这使得分析的突触在紧凑和完整的脑区, 高放大率和分辨率。然而, 这种技术是非常昂贵的, 需要复杂的样品准备, 是非常耗时。其他技术包括使用阵列层析成像6, 这是一个主要的缺点, 因为它需要专门的和昂贵的设备来执行分析。此外, 表达特定突触标记的转基因线条在评估突触数7时很有用, 但新品系的产生可能是限制性的, 代价高昂的, 而蛋白质的过度使用会导致不良的不相干型.
由于这些限制和简单性, 许多研究人员通过检查突触蛋白水平来评估突触数。然而, 在蛋白质发生重大变化之前, 突触丧失可以观察到, 因为结构突触重塑导致或后并列的扩散, 没有突触蛋白的降解。此外, 在 AD 中, 突触变性或神经元死亡后, 触点蛋白水平降低8,9。总体水平的量化并不能使这种区别。因此, 有必要建立一个可靠的, 容易接近的, 准确的方法来评价突触数在大脑中。
在这篇文章中, 我们描述如何用免疫荧光显微镜在海马鼠脑切片中彻底识别和确定突触的数量。突触的定义是定位前和后标记, 出现在一个有点分布。通过对大脑中 Wnt 信号的研究, 证明了该技术的有效性。Wnts 是分泌蛋白重要的形成, 消除和维持的突触。在体内诱导的 Wnt 叶栅分泌拮抗剂, Dickkopf-1 (Dkk1), 导致兴奋性突触丧失, 同时保留抑制性突触在海马体10。我们说明了在表达 Dkk1 的成年小鼠海马切片中的兴奋和抑制突触的识别和计数, 并强调了这种技术对其他类型组织/培养制剂的可转让性。
对突触数的精确评估是神经科学领域的关键。在这里, 我们展示了如何评价 CA1 层 radiatum 区的突触密度作为一个模型系统。关于现有方法的意义, 在我们最近的一篇关于海马 Wnt 缺乏效应的研究中得到了证明, 我们也通过开路 EM10来评估突触数。突触损失的大小类似于开路 EM 和脑切片方法在这里描述的10。因此, 这一发现证明了该技术的准确性和可靠性。
重要的是, 开路 EM 和免疫突触的限制, 如这里所介绍的, 是无法准确估计的绝对突触数的特定大脑区域。事实上, 确定任何全球性的形态学变化是很重要的, 因为总体积的变化会影响突触的数量。另一个限制是, 某些抗体是不太有效的染色完整的脑区, 部分由于极端密度突触连接。我们经历了更高质量的染色 vGlut1 和 gephyrin 使用此切片准备和后续的粉煤灰固定最多1小时, 与即时固定的整个大脑在煤灰 (图 2C)。后者导致成群突触染色, 在组织中有孔。尽管如此, vGlut1 抗体的渗透仍然是限制在两种方法 (一对夫妇几十微米)。我们没有克服这个限制, 即使增加了抗体的培养, 但提供的抗体渗透大于总深度, 是成像, 不应该对最终结果的影响。此外, 应特别小心, 以确保染色甚至在整个获得的堆栈。
在我们的研究中, 我们想区分兴奋和抑制性突触。因此, 我们分别选择了 vGlut1/PSD-95 和 vGAT/gephyrin, 因为这些蛋白在成年小鼠海马中有很高的表达, 并且特定于每个突触子类型4,5。其他兴奋和抑制突触标记可以用来识别每个突触, 如在每个突触丰富的受体, 包括 NMDA 和 AMPA 受体的兴奋和 GABAA 受体抑制突触。其他的神经递质或调也可以与我们的协议, 以确保特定的抗体是可用的, 如在纹状体的多巴胺突触的显示22。此外, 减少每个切片的厚度到120µm 可以部分克服低数量的样品获得的急性切片, 这是必要的研究小大脑结构, 如杏仁核。
我们的议定书的未来应用可以在研究不同的脑区和疾病。例如, 在纹状体 (大脑中与帕金森病相关的区域), vGlut2/PSD-95 或 vGlut1/PSD-95 的组合可以用来区分从皮层或丘脑传入来的兴奋性突触,分别为22。
最后, 我们已经证明了一种可靠的方法来检查脑组织中的突触数量, 使用前后标记来定义突触。关键步骤包括制备良好的海马切片, 在粉煤灰中固定时间长达1小时, 应用足够的安装介质, 使用可靠的抗体, 适当的图像采集设置, 以及严格的突触点检测。最终, 这种方法是相对较快的, 很容易重现的任何实验室可以获得共焦显微镜。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了湄公河协会、欧盟 FP7、ARUK、惠康信托和帕金森英国的支持。我们还要感谢 Ms. Buchler 对共焦图像和实验室成员在手稿和方法方面的建设性投入的贡献。
Vibratome | Leica | VT1000S | |
Primary antibody | Millipore | AB5905 | vGlut1 (1:2000) |
Primary antibody | Thermo Scientific | MA1-046 | PSD-95 (1:500) |
Primary antibody | Synaptic Systems | 131 004 | vGAT (1:500) |
Primary antibody | Synaptic Systems | 147011 | Gephyrin (1:500) |
Primary antibody | Abcam | ab5392 | MAP2 (1:10000) |
Secondary antibody | Jackson Laboratories | 706-545-148 | Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600) |
Secondary antibody | Abcam | ab175470 | Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600) |
Mounting medium | SouthernBiotech | 00-4958-02 | Fluoromount-G |
Confocal Microscope | Olympus | NA | FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%. |
Analysis software | PerkinElmer | NA | Volocity |
Scalpel | Swann-Morton | 203 | No 11 |
Super Glue | Loctite | 1446875 | |
95% O2, 5% CO2 | BOC | NA | Cylinder |
24-well plate | Corning | 3524 | |
Glass slides | Thermo | 7107 | 08-1.0mm thick |
Petri Dish | Corning | 430167 | |
iDkk1 mice | N/A | N/A | Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKIIα rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKIIα rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents for solutions: | |||
NaCl | Sigma | V800372 | |
KCl | Sigma | P9333 | |
Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
Ca2Cl | Sigma | 223506 | |
Mg2Cl | Sigma | M9272 | |
NaH2PO4 | Sigma | 71505 | |
Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
EDTA | Sigma | E6758 | |
D-Glucose | Sigma | G5767 | |
Sucrose | Sigma | S8501 | |
Triton-X | Sigma | T8787 | |
Donkey Serum | Millipore | S30-100ml | |
PFA | Sigma | P6148 |