Ein Protokoll für die präzise Identifizierung und Analyse von Synapsen im Hippokampus Scheiben mit Immunfluoreszenz ist in diesem Artikel beschrieben.
Im Gehirn sind Synapsen spezialisierte Verbindungen zwischen den Neuronen, Bestimmung der Stärke und Ausbreitung der neuronalen Signalisierung. Die Anzahl der Synapsen ist während der Entwicklung und neuronale Reifung streng reguliert. Wichtig ist, können Defizite in der Synapse Anzahl zu kognitiven Dysfunktion führen. Daher ist die Bewertung der Synapse Anzahl Bestandteil der Neurobiologie. Wie Synapsen im intakten Gehirn klein und sehr kompakt sind, ist die Beurteilung der absoluten Zahl jedoch anspruchsvoll. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um leicht erkennen und bewerten Sie Synapsen im Hippokampus Nagetier Scheiben mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie. Freuen Sie sich auf eine drei-Schritt-Verfahren um Synapsen im konfokalen Mikroskopie qualitativ hochwertige Bilder zu bewerten, durch die Analyse der Co Lokalisierung der Prä- und postsynaptischen Proteine in hippocampal Scheiben. Es erklärt auch, wie die Analyse durchgeführt wird und repräsentative Beispiele von erregenden und hemmenden Synapsen. Dieses Protokoll stellt eine solide Grundlage für die Analyse von Synapsen und kann auf jede mögliche Forschung untersucht die Struktur und Funktion des Gehirns angewendet werden.
Das menschliche Gehirn besteht aus ca. 1014 Synapsen. Synapse ist eng in die Entwicklung und Reifung des zentralen Nervensystems (ZNS) geregelt. Während der gesamten Entwicklung Anzahl der Synapse moduliert von Synaptogenese und beschneiden, funktioneller neuronaler Netzwerke zu bilden. Lernen und Gedächtnis werden durch die Verordnung der Synapse Anzahl und Stärke, ein Prozeß bekannt als synaptische Potenzierung und Depression1unterstützt. Wichtig ist, ist die Stabilisierung der Reife Synapsen unerlässlich für die Aufrechterhaltung der neuronalen Netzwerk-Verbindungen. Darüber hinaus wurden Defizite in der Synapse Dichte in den frühen Stadien von neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit (AD)2gemeldet. Daher ist die Fähigkeit, genau zu identifizieren und zu bewerten Synapse Anzahl grundlegender Bedeutung für die Beurteilung der Gehirnphysiologie und Pathologie.
Die extreme Dichte und kompakte Art der Synapsen machen es schwierig, um ihre genaue Zahl in intakten Hirnareale zu schätzen. Chemische Synapsen im ZNS bestehen aus zwei Neuronen in enge Apposition, getrennt durch eine synaptic cleft3. Die präsynaptischen Terminal oder synaptische Bouton, ergibt sich aus einem Axon und besteht aus angesammelten Vesikel, die Neurotransmitter enthalten, die die Besonderheit einer Synapse zu definieren – nämlich, Glutamat und Gamma – Aminobuttersäure (GABA) für exzitatorische und hemmende Synapsen, beziehungsweise. Die Membranen der Vesikel enthalten vesikuläre Transporter spezifisch für jedes Neurotransmitter: vesikuläre Glutamat Transporter (vGlut) für Glutamat und vesikuläre GABA-Transporter (vGAT) für GABA. Die postsynaptischen Terminal ist eine sehr dichte Struktur, bestehend aus mehreren Proteinen, einschließlich Rezeptoren, Adhäsionsmoleküle und Gerüst Proteine. In exzitatorischen Synapsen ist postsynaptischen Dichte-95 Protein (PSD-95) das am häufigsten vorkommende Gerüst Protein4, modulierenden erregenden N-methyl-D-aspartate(NMDA-) und α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Säure (AMPA)-Rezeptor funktionieren Sie, während Gephyrin inhibitorische Rezeptoren an der inhibitorischen postsynaptischen Klemme5verankert. Insgesamt, die Spezifität der Proteine zu prä- und postsynaptischen Fächer Beihilfen in der Differenzierung und Identifikation von Synapse-Subtypen.
Die Auswertung der Synapse Zahl kann mit verschiedenen Techniken durchgeführt werden. Am weitesten verbreitet ist der Einsatz der Elektronenmikroskopie (EM), die die Analyse der Synapse in kompakter und intakte Hirnareale mit hoher Vergrößerung und Auflösung ermöglicht. Aber diese Technik ist sehr teuer, erfordert komplizierte Probenvorbereitung und ist sehr zeitaufwendig. Andere Techniken umfassen die Verwendung von Array-Tomographie6, was einen großen Nachteil ist, dass es spezielle und teure Ausrüstung erfordert um die Analyse durchzuführen. Darüber hinaus transgene Linien mit dem Ausdruck spezifischer synaptischen Marker eignen sich Bewertung Synapse Nummer7, aber die Generation der neuen Linien kann restriktive und kostspielig sein, und die Überexpression von Proteinen kann zu unerwünschten Ziel führen Phänotypen.
Aufgrund dieser Einschränkungen und der Einfachheit halber bewerten viele Forscher Synapse Anzahl durch die Untersuchung insgesamt synaptischen Protein-Ebene. Synapse Verlust kann jedoch als strukturelle synaptischen Umbau Ergebnisse in die Zerstreuung der Pre- oder Post-synaptische Apposition, keine Verschlechterung der synaptischen Proteine vor erhebliche Änderungen im Protein, beobachtet werden. Darüber hinaus sind in AD, synaptischen Protein-Ebene reduzierten folgende Synapse Degeneration oder neuronalen Tod8,9. Die Quantifizierung der gesamten Ebenen ermöglicht es diese Unterscheidung nicht. So gibt es eine Notwendigkeit, eine zuverlässige, zugänglich und genaue Methode für die Bewertung der Anzahl der Synapsen im Gehirn zu entwickeln.
In diesem Artikel beschreiben wir wie Sie gründlich ermitteln und bestimmen Sie die Anzahl der Synapsen mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie im Hippokampus Nagetier Gehirnscheiben. Die Synapsen sind durch die NS1 der Prä- und postsynaptischen Marker definiert, die in eine punktförmige Verteilung angezeigt. Wir zeigen die Gültigkeit dieser Technik durch das Studium der Wnt signalisieren in das Gehirn. Wnts sind wichtig für die Bildung, die Beseitigung und die Wartung von Synapsen sekretierten Proteine. Die in Vivo -Induktion des sekretierten Antagonisten der Wnt Kaskade, Dickkopf-1 (Dkk1), führt zu erregenden synaptischen Verlust unter Beibehaltung der hemmende Synapsen in der Hippocampus-10. Wir zeigen die Identifikation und Graf von erregenden und hemmenden Synapsen im Hippokampus Scheiben aus einer erwachsenen Maus mit dem Ausdruck Dkk1 und markieren Sie die Übertragbarkeit dieser Technik auf andere Arten von Gewebekultur/Vorbereitungen.
Die genaue Auswertung der Synapse Anzahl gilt auf dem Gebiet der Neurowissenschaften. Hier zeigen wir, wie die Dichte der Synapsen im Großraum CA1 Stratum Radiatum der hippocampalen Scheiben als Modellsystem zu bewerten. Die Bedeutung in Bezug auf bestehende Methoden wird in unserem jüngsten Forschungsartikel über die Wirkung der Wnt-Mangel im Hippocampus und wo wir auch Synapse Zahl ausgewertet durch einteiligen EM10gezeigt. Das Ausmaß des Verlustes der Synapse sind ähnlich zwischen einteiligen EM und die Gehirn-Scheibe hier beschriebenen Methode10. So zeigt dieses Ergebnis, die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Technik.
Wichtig ist, ist eine Einschränkung des einteiligen EM und Immunostaining Synapsen, wie hier vorgestellt, die Unfähigkeit, genau zu schätzen, die absolute Synapse-Anzahl für eine bestimmte Gehirnregion. In der Tat ist es wichtig, jede globale morphologischen Veränderungen zu identifizieren, wie Veränderungen im Gesamtvolumen synaptischen Anzahl auswirken könnte. Eine weitere Einschränkung ist, dass bestimmte Antikörper bei Färbung intakt Hirnregionen, teilweise aufgrund der extremen Dichte von synaptischen Verbindungen weniger effizient sind. Wir haben erlebt, hochwertigere Färbung des vGlut1 und Gephyrin mit diesem Stück Vorbereitung und anschließende PFA Fixierung für maximal 1 h, im Vergleich zur sofortigen Fixierung des gesamten Gehirns in PFA (Abbildung 2). Letzteres führte zu aufgehäuften synaptischen Färbung, mit Löchern im Gewebe. Dennoch beschränkt sich die vGlut1 Antikörper Penetration noch bei beiden Methoden (ein paar zehntausend von Mikron). Wir diese Einschränkung nicht überwinden, sogar mit erhöhten Antikörper Inkubationszeit, sondern die die Antikörper-Penetration ist größer als die Gesamttiefe, die abgebildet ist, sollte keinen Einfluss auf das Endergebnis. Darüber hinaus sollte besondere Vorsicht geboten, um sicherzustellen, dass die Färbung auch während der gesamten erworbenen Stack ist.
In unserer Studie wollten wir unterscheiden exzitatorischen von hemmenden Synapsen. Daher wählten wir vGlut1/PSD-95 und vGAT/Gephyrin, bzw. wie diese Proteine im Hippocampus erwachsener Mäuse sehr ausgedrückt werden und sind spezifisch für jede Synapse Subtyp4,5. Weitere exzitatorischen und inhibitorischen synaptischen Marker könnte verwendet werden können, um jedes jeweiligen Synapse, wie Rezeptoren, die an jeder Synapse, einschließlich NMDA und AMPA-Rezeptoren für bereichert identifizieren exzitatorischen und GABAA-Rezeptoren für die hemmenden Synapsen. Andere Neurotransmitter und Neuromodulatoren können auch identifiziert werden, mit unserem Protokoll, um sicherzustellen, dass spezifische Antikörper verfügbar sind, da für dopaminerge Synapsen im Striatum22gezeigt. Darüber hinaus überwinden reduziert die Dicke der einzelnen Segmente bis 120 µm teilweise die geringe Menge an Proben mit akuten Scheiben, die unbedingt für Studien in kleinen Gehirnstrukturen wie der Amygdala.
Zukünftige Anwendungen unseres Protokolls konnte in der Studie der verschiedenen Gehirnregionen und Störungen umgesetzt werden. Zum Beispiel im Striatum (eine Region des Gehirns verbunden mit Parkinson-Erkrankung), eine Kombination von vGlut2/PSD-95 oder vGlut1/PSD-95 ließe sich der exzitatorischen Synapsen von Afferenzen aus dem Kortex oder Thalamus unterscheiden, bzw.22.
Zusammenfassend haben wir gezeigt, eine zuverlässige Methode, um die Anzahl der Synapsen im Gehirn Gewebe mit Prä- und postsynaptischen Marker definieren eine Synapse zu untersuchen. Wichtige Schritte sind die Vorbereitung gute hippocampal Scheiben einer Fixierzeit von bis zu 1 h in PFA, die Anwendung genügend Eindeckmedium, den Einsatz von zuverlässigen Antikörper, entsprechenden Bildeinstellungen Erwerb und strengen synaptischen Puncta Erkennung. Letztlich ist diese Methode ist relativ schnell und leicht reproduzierbar ist, indem alle Laboratorien, die Zugang zu einem confocal Mikroskop haben.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von MRC, EU FP7, ARUK, Wellcome Trust und Parkinson UK unterstützt. Wir möchten auch Frau Johanna Buchler Danke für ihren Beitrag der konfokalen Bilder und den Mitgliedern des Labors für ihre konstruktiven Beiträge auf dem Manuskript und Methodik.
Vibratome | Leica | VT1000S | |
Primary antibody | Millipore | AB5905 | vGlut1 (1:2000) |
Primary antibody | Thermo Scientific | MA1-046 | PSD-95 (1:500) |
Primary antibody | Synaptic Systems | 131 004 | vGAT (1:500) |
Primary antibody | Synaptic Systems | 147011 | Gephyrin (1:500) |
Primary antibody | Abcam | ab5392 | MAP2 (1:10000) |
Secondary antibody | Jackson Laboratories | 706-545-148 | Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600) |
Secondary antibody | Abcam | ab175470 | Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600) |
Mounting medium | SouthernBiotech | 00-4958-02 | Fluoromount-G |
Confocal Microscope | Olympus | NA | FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%. |
Analysis software | PerkinElmer | NA | Volocity |
Scalpel | Swann-Morton | 203 | No 11 |
Super Glue | Loctite | 1446875 | |
95% O2, 5% CO2 | BOC | NA | Cylinder |
24-well plate | Corning | 3524 | |
Glass slides | Thermo | 7107 | 08-1.0mm thick |
Petri Dish | Corning | 430167 | |
iDkk1 mice | N/A | N/A | Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKIIα rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKIIα rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents for solutions: | |||
NaCl | Sigma | V800372 | |
KCl | Sigma | P9333 | |
Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
Ca2Cl | Sigma | 223506 | |
Mg2Cl | Sigma | M9272 | |
NaH2PO4 | Sigma | 71505 | |
Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
EDTA | Sigma | E6758 | |
D-Glucose | Sigma | G5767 | |
Sucrose | Sigma | S8501 | |
Triton-X | Sigma | T8787 | |
Donkey Serum | Millipore | S30-100ml | |
PFA | Sigma | P6148 |