正確に特定および蛍光抗体法を用いた海馬スライスにおけるシナプスの分析のためのプロトコルは、この資料に記載されています。
脳内のシナプスは強度と神経伝達の広がりを決定するニューロン間の特殊結合です。シナプスの数が開発と神経細胞の成熟の間に堅く調整されます。重要なは、シナプス数で赤字は認知機能障害につながることができます。したがって、シナプス結合の数の評価は、神経生物学の不可欠な部分です。ただし、シナプスは、そのまま脳に小さくてコンパクトな絶対数の評価は難しいです。このプロトコルでは、簡単に識別し、蛍光顕微鏡を用いた海馬スライス標本齧歯動物のシナプスを評価する方法について説明します。海馬スライスにおける前及びシナプス後のタンパク質の共局在を分析することによって高品質の共焦点顕微鏡画像におけるシナプスを評価する 3 つの手順が含まれています。また、分析の実行し、興奮性および抑制性のシナプスから代表的な例を与える方法について説明します。このプロトコルは、シナプスの分析のための強固な基盤を提供し、構造と脳の機能を調査している任意の調査に適用することができます。
人間の脳は、約 10 の14のシナプスで構成されます。シナプス結合の数が開発と中枢神経系 (CNS) の成熟の間に堅く調整されます。シナプス結合の数の変調、開発全体を通してシナプス形成と機能的神経ネットワークを形成するために刈り込み。学習と記憶は、シナプス結合の数と強さでシナプス増強とうつ病の1として知られているプロセスの規則によってサポートされます。重要なは、成熟したシナプスの安定化は、神経ネットワーク接続を維持するために不可欠です。さらに、シナプス密度で赤字はアルツハイマー病 (AD)2等に神経変性の初期の段階で報告されています。したがって、正確に識別し、シナプス結合の数を評価する能力は、脳生理学と病理学の評価に不可欠です。
極端な密度とシナプスのコンパクトな性質はそのまま脳の領域の正確な数を推定するために挑戦、です。中枢神経系における化学シナプスは、近い同格、シナプス裂3で区切られた 2 つのニューロンから成っています。シナプス前ターミナル、またはシナプスブートン、軸索から出現し、神経伝達物質シナプスの特異性を定義するを含む蓄積された小胞で構成されています-すなわち、グルタミン酸、γ-アミノ酪酸 (GABA) の興奮と抑制性シナプス、それぞれ。小胞の膜を含む小胞トランスポーター各神経伝達物質に固有: グルタミン酸や GABA の小胞の GABA トランスポーター (vgat ノックアウト)、小胞グルタミン酸トランスポーター (vGlut)。後シナプス受容体、接着分子足場タンパク質など、複数のタンパク質から成る高密度構造であります。興奮性のシナプスのシナプス密度 95 蛋白質 (PSD-95) は、最も豊富な足場蛋白質4、興奮性の N-methyl-D-aspartate(NMDA-) および α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic 酸 (AMPA) 受容体を調節することgephyrin アンカー抑制性シナプス ターミナル5抑制性受容体に対し、機能します。全体的にみて、前およびシナプス後細胞のコンパートメントに蛋白質の特異性は、分化とシナプスのサブタイプの同定支援します。
シナプス結合の数の評価は、さまざまなテクニックを実行できます。最も一般的なは、高倍率と分解能でコンパクトでそのまま脳領域におけるシナプスの分析を可能にする電子顕微鏡 (EM) を使用です。この手法は非常に高価、複雑な前処理を必要とし、非常に時間がかかります。その他のテクニックは、配列トモグラフィ6解析を実行する特殊な高価な機器を必要とするという点で、主要な不利な点を持っているの使用を含みます。さらに、特定のシナプス マーカー値を表現する形質転換線、シナプス数7の評価に有用な新しい行の生成は制限し、高価なをすることができます、望ましくないオフのターゲット蛋白質の過剰発現があります。表現型。
これらの制限のため、簡略化のため、多くの研究者は合計シナプス蛋白質のレベルを調べることによってシナプス結合の数を評価します。ただし、シナプス蛋白質の劣化はありませんが前またはシナプスの同格の散布でシナプス構造の改造結果として、蛋白質の相当な変更の前にシナプス損失を観察できます。さらに、広告、シナプス蛋白質レベルが減少次シナプス変性または神経細胞死8,9です。合計レベルの定量化は、この区別を有効にしません。従って、脳のシナプス結合の数を評価するための信頼性の高い、アクセス、および正確なメソッドを開発する必要があります。
この記事では徹底的に識別し、シナプスを蛍光顕微鏡を用いて海馬齧歯動物脳スライスの数を決定する方法をについて説明します。シナプスは、点状の分布に表示される前およびシナプス後細胞のマーカーの共存によって定義されます。脳における Wnt シグナル伝達の研究を通して本手法の有効性を示す.Wnts は、分泌された蛋白質の形成、除去、およびシナプスのメンテナンスが重要です。Wnt シグナルのカスケード、Dickkopf-1 (Dkk1) の分泌の拮抗薬の生体内で誘導は10海馬の抑制性シナプスを維持しながら興奮性シナプス損失につながります。同定と海馬スライス標本 Dkk1 を表現する大人のマウスからの興奮性および抑制性のシナプスの数を説明をし、他の種類/培養の準備のためにこの手法の伝達性。
神経科学の分野には、シナプス結合の数の正確な評価が欠かせません。ここでは、モデル システムとしての海馬スライスの地層結腸寄生虫 ca1 のシナプス密度を評価する方法を示します。既存のメソッドに関して意義は単一セクション10によって Wnt 欠乏海馬と我々 もシナプス結合の数を評価の効果に関する私たちの最近の研究の記事で示されます。シナプス損失の大きさが単一セクション EM と脳スライス間で類似メソッドがここで10を説明。したがって、この発見は、精度と技術の信頼性を示します。
重要なは、単一セクション EM の免疫シナプス、ここに示された制限は、特定の脳領域の絶対的なシナプス結合の数を正確に推定できないことです。確かに、総容積の変化がシナプスの数に影響を与えると、グローバルの形態学的変化を識別するために重要です。別の制限は、特定の抗体はシナプス接続の極端な密度のために部分的にそのまま脳の領域を染色でより少なく効率的ということです。高品質 vGlut1 と gephyrin PFA (図 2) で全体の脳の即時の固定に比べて、1 時間の最大のこのスライスの準備とその後の PFA 固定を使用して染色を経験しました。後者は、組織の穴と、周辺固定支持シナプス染色につながった。それにもかかわらず、vGlut1 抗体の浸透はまだ両方の方法 (数十ミクロンの数) に制限されます。我々 はこの制限を克服しなかったも増加抗体培養が、提供抗体浸透イメージ深さの合計より大きい、最終的な結果に影響はないはず。さらに、特別な注意は、染色されるようにも全体にわたって取得すべき。
本研究で我々 は興奮性抑制性シナプスから区別するためにいました。その結果、我々 vGlut1/PSD-95 と選んだ vgat ノックアウト/gephyrin、それぞれ、これらの蛋白質は成体マウス海馬で高発現している、各シナプス サブタイプ4,5に固有。他の興奮性および抑制性シナプス マーカー値が受容体 NMDA 及び AMPA 受容体を含む各シナプスで濃縮など各それぞれシナプスを識別するために使用されている興奮性と抑制性シナプスの GABAA 受容体。22線条体におけるドーパミン作動性シナプスの示すように、特定の抗体が提供されたことを確保する我々 のプロトコルとは、他の神経伝達物質や neuromodulators も識別できます。さらに、120 μ m の各スライスの厚みを減らすは部分的には扁桃体などの小さな脳構造の研究のために不可欠である急性スライスで得られた試料の少量を克服できます。
プロトコルの将来のアプリケーションは、異なる脳領域と障害の研究で実装できます。たとえば、線条体 (パーキンソン病に関連する脳の領域)、vGlut2/PSD-95 または vGlut1/PSD-95 の組み合わせに使える皮質や視床からの求心性神経の興奮性のシナプスを区別それぞれ22。
結論としては、シナプスを定義する前およびシナプス後細胞のマーカーを用いた脳組織におけるシナプスの数を確認する信頼性の高い方法を示しています。重要なステップには、PFA、十分な取付中のアプリケーション、信頼性の高い抗体、適切なイメージの取得設定、および厳格なシナプス涙点検出の使用まで 1 時間の固定時間良い海馬スライスの準備が含まれます。最終的には、このメソッドは比較的短時間、共焦点顕微鏡にアクセスした所、簡単に再現できます。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、MRC、EU FP7、ARUK、Wellcome の信頼、およびパーキンソン病イギリスによって支えられました。共焦点画像の彼女の貢献および原稿と方法論に対する彼らの建設的な意見のラボのメンバーさんヨハンナ Buchler に感謝したいと思いますも。
Vibratome | Leica | VT1000S | |
Primary antibody | Millipore | AB5905 | vGlut1 (1:2000) |
Primary antibody | Thermo Scientific | MA1-046 | PSD-95 (1:500) |
Primary antibody | Synaptic Systems | 131 004 | vGAT (1:500) |
Primary antibody | Synaptic Systems | 147011 | Gephyrin (1:500) |
Primary antibody | Abcam | ab5392 | MAP2 (1:10000) |
Secondary antibody | Jackson Laboratories | 706-545-148 | Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600) |
Secondary antibody | Abcam | ab175470 | Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600) |
Mounting medium | SouthernBiotech | 00-4958-02 | Fluoromount-G |
Confocal Microscope | Olympus | NA | FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%. |
Analysis software | PerkinElmer | NA | Volocity |
Scalpel | Swann-Morton | 203 | No 11 |
Super Glue | Loctite | 1446875 | |
95% O2, 5% CO2 | BOC | NA | Cylinder |
24-well plate | Corning | 3524 | |
Glass slides | Thermo | 7107 | 08-1.0mm thick |
Petri Dish | Corning | 430167 | |
iDkk1 mice | N/A | N/A | Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKIIα rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKIIα rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents for solutions: | |||
NaCl | Sigma | V800372 | |
KCl | Sigma | P9333 | |
Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
Ca2Cl | Sigma | 223506 | |
Mg2Cl | Sigma | M9272 | |
NaH2PO4 | Sigma | 71505 | |
Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
EDTA | Sigma | E6758 | |
D-Glucose | Sigma | G5767 | |
Sucrose | Sigma | S8501 | |
Triton-X | Sigma | T8787 | |
Donkey Serum | Millipore | S30-100ml | |
PFA | Sigma | P6148 |