Um protocolo para com precisão, identificando e analisando as sinapses em fatias hippocampal usando a imunofluorescência é descrito neste artigo.
No cérebro, sinapses são junções especializadas entre os neurônios, determinar a força e a propagação da sinalização neuronal. O número de sinapses é fortemente regulamentado durante o desenvolvimento e maturação neuronal. Importante, os défices em número de sinapse podem levar a disfunção cognitiva. Portanto, a avaliação do número de sinapse é parte integrante da neurobiologia. No entanto, como as sinapses são pequenas e altamente compacta no cérebro intacto, a avaliação do número absoluto é um desafio. Este protocolo descreve um método para identificar e avaliar as sinapses em fatias hippocampal roedores, utilizando microscopia de imunofluorescência facilmente. Ele inclui um processo de três etapas para avaliar as sinapses em imagens de alta qualidade de microscopia confocal, analisando a localização co das proteínas pré e pós-sinápticas em fatias hippocampal. Ele também explica como a análise é realizada e dá exemplos representativos de sinapses excitatórios e inibitórios. Este protocolo fornece uma base sólida para a análise de sinapses e pode ser aplicado a qualquer pesquisa investigando a estrutura e função do cérebro.
O cérebro humano é composto de aproximadamente 1014 sinapses. Número de sinapse é fortemente regulamentado durante o desenvolvimento e maturação do sistema nervoso central (SNC). Durante todo o desenvolvimento, o número de sinapse é modulado por sinaptogênese e poda para formar redes neuronais funcionais. Aprendizagem e memória são suportados pelo Regulamento da sinapse número e força, um processo conhecido como potenciação sináptica e depressão1. Importante, a estabilização das sinapses maduras é essencial para manter as conexões de rede neuronal. Além disso, déficits na densidade de sinapse foram relatados nas fases iniciais das condições neurodegenerativas como a doença de Alzheimer (AD)2. Portanto, a capacidade de precisão de identificar e avaliar o número de sinapse é fundamental para a avaliação da patologia e fisiologia do cérebro.
A extrema densidade e natureza compacta de sinapses tornam desafiadora para estimar seu número exacto em áreas do cérebro intacto. Sinapses químicas no SNC são feitas de dois neurônios em aposição perto, separados por uma fissura sináptica3. O terminal pré-sináptica, ou bouton sináptica, emerge de um axônio e consiste de vesículas acumuladas, que contêm os neurotransmissores que definem a especificidade de uma sinapse — ou seja, glutamato e ácido gama – aminobutírico (GABA) para excitatórios e inibitório sinapses, respectivamente. As membranas das vesículas contêm vesiculares transportadores específicos para cada neurotransmissor: transporte vesicular glutamato (vGlut) para glutamato e transportador vesicular de GABA (vGAT) para GABA. O terminal pós-sináptica é uma estrutura altamente densa composta de várias proteínas, incluindo moléculas de adesão, receptores e proteínas de andaime. Nas sinapses excitatórias, proteína pós-sináptica de densidade-95 (PSD-95) é o mais abundante andaime proteína4, modulando excitatórios N-methyl-D-aspartate(NMDA-) e receptor de ácido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (Leandro) função, Considerando que gephyrin Ancora receptores inibitórios para o terminal pós-sináptica inibitória5. Total, a especificidade das proteínas para compartimentos pré e pós-sináptica auxílio na diferenciação e identificação dos subtipos de sinapse.
A avaliação do número de sinapse pode ser realizada com diferentes técnicas. O mais comum é o uso da microscopia de elétron (EM), que permite a análise da sinapse em áreas do cérebro intacto e compacto com alta ampliação e resolução. No entanto, esta técnica é muito cara, exige a preparação da amostra complicado e é muito demorada. Outras técnicas incluem o uso de matriz tomografia computadorizada6, que tem uma grande desvantagem em que requer equipamento especializado e caro para realizar a análise. Além disso, linhas transgênicas expressando marcadores sinápticos específicos são úteis na avaliação de sinapse número7, mas a geração de novas linhas pode ser restritivas e caro, e a superexpressão de proteínas pode resultar em indesejável fora do alvo fenótipos.
Devido a essas limitações e para manter a simplicidade, muitos pesquisadores avaliam número de sinapse, examinando os níveis de proteína total sináptica. No entanto, perda de sinapse pode ser observada antes de alterações substanciais em proteína, como resultados de remodelação sinápticos estruturais na dispersão de aposição de pré ou pós-sináptica, com nenhuma degradação de proteínas sinápticas. Além disso, no anúncio, os níveis de proteína sináptica são seguir reduzida sinapse degeneração ou morte neuronal8,9. A quantificação dos níveis totais não permite que esta distinção. Assim, há uma necessidade de desenvolver um método confiável, acessível e preciso para a avaliação do número de sinapses no cérebro.
Neste artigo, descrevemos como completamente identificar e determinar o número de sinapses usando microscopia de imunofluorescência em fatias hippocampal cérebro de roedor. As sinapses são definidas pelo colocalization de marcadores pré e pós-sináptica, que aparecem em uma distribuição punctate. Vamos demonstrar a validade desta técnica através do estudo da Wnt sinalização no cérebro. Wnts são secretadas proteínas importantes para a formação, eliminação e manutenção das sinapses. A indução na vivo de um antagonista secretada da cascata da Wnt, Dickkopf-1 (Dkk1), leva à perda sináptica excitatória preservando sinapses inibitórias no hipocampo10. Podemos ilustrar a identificação e contagem das sinapses excitatórias e inibitórias em fatias hippocampal de um rato adulto expressar Dkk1 e destacar a possibilidade de transferência desta técnica a outros tipos de preparações de cultura do tecido.
A avaliação precisa do número da sinapse é essencial para o campo da neurociência. Aqui, nós mostramos como avaliar a densidade das sinapses região CA1 stratum radiatum de fatias hippocampal como um sistema modelo. O significado no que diz respeito a métodos existentes é demonstrado em nosso recente artigo de pesquisa sobre o efeito da deficiência de Wnt no hipocampo, e onde também foram avaliados o número sinapse por single-seção EM10. A magnitude da perda de sinapse são semelhantes entre EM single-seção e o cérebro-fatia método descrito aqui10. Assim, esta constatação demonstra a precisão e a confiabilidade da técnica.
Importante, uma limitação tanto EM single-seção e imunocoloração sinapses, tal como apresentado aqui, é a incapacidade para estimar com precisão o número absoluto de sinapse para uma região específica do cérebro. Com efeito, é importante identificar quaisquer alterações morfológicas globais, como mudanças no volume total poderiam impactar número sináptico. Outra limitação é que certos anticorpos são menos eficientes na coloração de regiões do cérebro intacto, parcialmente devido à extrema densidade de conexões sinápticas. Nós experimentamos maior qualidade coloração de vGlut1 e gephyrin usando esta fatia preparação e fixação de PFA subsequente para um máximo de 1 h, comparado à fixação imediata do cérebro inteiro em PFA (Figura 2). Este último levou a coloração sináptica agrupados, com buracos no tecido. No entanto, a penetração de anticorpo vGlut1 ainda é restrito em ambos os métodos (um par de dezenas de mícrons). Nós não superar essa limitação, mesmo com aumento de anticorpos incubação, mas fornecendo a penetração de anticorpo é maior que a profundidade total que é fotografada, não deve haver nenhuma influência no resultado final. Além disso, especial deve ter cuidado para garantir que a mancha está mesmo em toda a pilha inteira adquirida.
Em nosso estudo, nós quisemos distinguir excitatórios de sinapses inibitórias. Consequentemente, nós escolhemos vGlut1/PSD-95 e vGAT/gephyrin, respectivamente, como estas proteínas são altamente expressa no hipocampo de rato adulto e são específicas para cada subtipo de sinapse4,5. Outros marcadores sinápticos excitatórios e inibitórios poderiam ter sido utilizados para identificar cada sinapse respectivo, tais como enriquecido em cada sinapse, incluindo receptores NMDA e Leandro para os receptores excitatórios e receptores GABAA para sinapses inibitórias. Outros neurotransmissores ou neuromodulators também podem ser identificados com nosso protocolo, garantindo que os anticorpos específicos estão disponíveis, como mostrado por sinapses dopaminérgicos no striatum22. Além disso, reduzindo a espessura de cada fatia de 120 µm pode parcialmente superar a baixa quantidade de amostras obtidas com fatias agudas, que é imperativo para estudos em estruturas do cérebro pequeno como a amígdala.
As aplicações futuras do nosso protocolo poderiam ser implementadas no estudo de áreas diferentes do cérebro e transtornos. Por exemplo, no corpo estriado (uma região do cérebro associada com a doença de Parkinson), uma combinação de vGlut2/PSD-95 ou vGlut1/PSD-95 pode ser usada para diferenciar entre as sinapses excitatórias de afferents provenientes do córtex ou tálamo, respectivamente22.
Em conclusão, temos mostrado um método confiável para examinar o número de sinapses nos tecidos do cérebro usando marcadores pré e pós-sináptica para definir uma sinapse. Passos críticos incluem a preparação de fatias hippocampal boas, um tempo de fixação de até 1 h em PFA, a aplicação de suficiente meio de montagem, o uso de anticorpos fiáveis, configurações de aquisição de imagem apropriada e a detecção de partitura sináptica rigorosas. Em última análise, este método é relativamente rápido e facilmente reproduzível por alguns laboratórios que têm acesso a um microscópio confocal.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo MRC, UE FP7, PHELIPE, Wellcome Trust e Parkinson UK. Também gostaríamos de agradecer a Sra. Johanna Buchler por sua contribuição de imagens confocal e os membros do laboratório para a sua entrada construtivo sobre o manuscrito e metodologia.
Vibratome | Leica | VT1000S | |
Primary antibody | Millipore | AB5905 | vGlut1 (1:2000) |
Primary antibody | Thermo Scientific | MA1-046 | PSD-95 (1:500) |
Primary antibody | Synaptic Systems | 131 004 | vGAT (1:500) |
Primary antibody | Synaptic Systems | 147011 | Gephyrin (1:500) |
Primary antibody | Abcam | ab5392 | MAP2 (1:10000) |
Secondary antibody | Jackson Laboratories | 706-545-148 | Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600) |
Secondary antibody | Abcam | ab175470 | Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600) |
Mounting medium | SouthernBiotech | 00-4958-02 | Fluoromount-G |
Confocal Microscope | Olympus | NA | FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%. |
Analysis software | PerkinElmer | NA | Volocity |
Scalpel | Swann-Morton | 203 | No 11 |
Super Glue | Loctite | 1446875 | |
95% O2, 5% CO2 | BOC | NA | Cylinder |
24-well plate | Corning | 3524 | |
Glass slides | Thermo | 7107 | 08-1.0mm thick |
Petri Dish | Corning | 430167 | |
iDkk1 mice | N/A | N/A | Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKIIα rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKIIα rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents for solutions: | |||
NaCl | Sigma | V800372 | |
KCl | Sigma | P9333 | |
Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
Ca2Cl | Sigma | 223506 | |
Mg2Cl | Sigma | M9272 | |
NaH2PO4 | Sigma | 71505 | |
Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
EDTA | Sigma | E6758 | |
D-Glucose | Sigma | G5767 | |
Sucrose | Sigma | S8501 | |
Triton-X | Sigma | T8787 | |
Donkey Serum | Millipore | S30-100ml | |
PFA | Sigma | P6148 |