Summary
Dit manuscript wordt beschreven hoe onderscheiden verschillende nematoden ver-veld diffractie handtekeningen gebruiken. We vergelijken de motoriek van 139 wild type en 108 "Roller" C. elegans door gemiddeld frequenties de temporele Fraunhofer diffractie handtekening op een enkele plaats met behulp van een continu wave laser is gekoppeld.
Abstract
Dit manuscript wordt beschreven hoe classificeren nematoden temporele ver-veld diffractie handtekeningen gebruiken. Een enkele C. elegans is opgeschort in een waterkolom binnen een optische cuvette. Een 632 nm continuous wave HeNe laser is geregisseerd door middel van de Cuvet met behulp van front oppervlakte spiegels. Een aanzienlijke afstand van ten minste 20-30 cm reisde nadat het licht de cuvette passeert zorgt voor een nuttige ver-veld (Fraunhofer) diffractie patroon. De diffractie patroon veranderingen in real time de nematode zwemt binnen de laserstraal. De fotodiode is uit het midden geplaatst in het patroon van diffractie. Het signaal van de spanning van de fotodiode is waargenomen in real-time en opgenomen met behulp van een digitale oscilloscoop. Dit proces wordt herhaald voor 139 wild type en 108 "roller" C. elegans. Wild type wormen vertonen een snelle oscillatie patroon in oplossing. De "roller" wormen hebben een mutatie in een essentieel onderdeel van de epidermis die met smooth locomotion interfereert. Tijdsintervallen die niet vrij van verzadiging en inactiviteit zijn verwijderd. Het is praktisch elke gemiddelde delen door het maximum te vergelijken van de relatieve intensiteiten. Het signaal voor elke worm is dat Fourier omgezet, zodat het patroon van de frequentie voor elke worm naar voren komt. Het signaal voor elk type van worm is gemiddeld. De gemiddelde Fourier spectra voor het wild type en de "roller" C. elegans zijn duidelijk verschillend en onthullen dat de shapes dynamische worm van de twee verschillende worm stammen kunnen worden onderscheiden met behulp van Fourier-analyse. De Fourier-spectra van elke stam worm overeenkomen met een geschatte model met behulp van twee verschillende binaire worm shapes die met motorische momenten corresponderen. De envelop van de gemiddelde verdeling van de frequentie voor werkelijke en gemodelleerd wormen bevestigt het model komt overeen met de gegevens. Deze methode kan dienen als een basislijn voor Fourier-analyse voor vele microscopische soorten, aangezien elk micro-organisme zijn unieke Fourier-spectrum zal hebben.
Introduction
Deze methode vergelijkt experimentele en gemodelleerd frequentie spectra van de motoriek van C. elegans met behulp van twee stammen met zeer verschillende motorische patronen. De resultaten tonen aan dat het frequentiespectrum afhankelijk van temporele veranderingen zoals de nematode in een waterkolom zwemt zodat duidelijke microscopische afbeeldingen niet nodig zijn voor de analyse. Deze methode zorgt voor kwantitatieve real-time analyse en aanvullende informatie verkregen met traditionele microscopen afbeeldingen/video's. Fraunhofer diffractie, ook wel ver-veld diffractie, vormt de basis voor het verkrijgen van levende diffractie gegevens1,2. De lichtintensiteit op enkel punt in de diffractie-patroon is het resultaat van het licht vanuit elk punt in de omtrek van de nematode3boven elkaar plaatsen. Dientengevolge, draagt de lichtintensiteit verzameld na verloop van tijd informatie over de motoriek van het dennenaaltje. Analyseren van het signaal van de tijd-afhankelijke diffractie herkent de karakteristieke motie van de overeenkomstige mutant aangezien analyseren van alle frequenties die betrokken zijn in de motoriek is een aanvulling op de traditionele video-analyse. In dit geval zijn de kenmerkende verschillen tussen de motoriek van het "roller" en wilde type C. elegans bevestigd door het vergelijken van de spectra van de frequentie van de twee verschillende stammen van nematode.
Sommige eerdere kenmerken zijn bevestigd met behulp van de frequentie-analyse van diffractie signalen zoals zwemmen frequenties2,4. Wat nog belangrijker is, kan deze methode worden gebruikt als een aanvullende methode om traditionele microscopie te observeren motoriek in real time op het computerscherm van een als de gegevens worden verzameld. Het frequentiespectrum van wormen met verschillende motorische patronen kan worden gekwantificeerd door te overwegen dat de Fourier getransformeerd signaal van het signaal van diffractie.
Het multidisciplinaire karakter van Fourier gebaseerde diffractie in dit werk omvat het gebied van biologie en natuurkunde. Diffractie door onder bemonstering heeft lange tijd gebruikt om kristalstructuren in biologie5 en andere gebieden te onderzoeken. In dit experiment echter maakt oversampling6,7 het ver-veld diffractie patroon zodat het organisme wordt gecentreerd in de laserstraal. Oversampling wordt meestal gebruikt voor lens-minder imaging8 in combinatie met een algoritme voor het ophalen van fase dat Hiermee reconstrueert u een afbeelding van het oorspronkelijke object. Fase ophalen is moeilijk te bereiken als er scatterers aanwezig zijn, zoals het geval met een nematode. De temporele diffractie handtekening volstaat om te evalueren van de belangrijkste frequenties van de beweging van de worm. Deze methode is minder computationeel belasten en biedt een optische manier te kwantificeren van de motoriek. Deze techniek kan gemakkelijk worden aangepast voor analyse van mutaties of milieuomstandigheden die gedrag aanpassen.
Protocol
1. C. elegans groei en het onderhoud
- voorbereiden nematode cultuur gerechten.
- Vullen de petrischaaltjes met een agar-oplossing en laat ze te stollen, en vervolgens het zaad met een E. coli cultuur van de OP50 stam 9 , 10.
- Bereiden een startende bevolking van volwassen nematoden op elke plaat door verschillende volwassen wormen te verplaatsen naar verse agar gevulde petrischaaltjes met een patch van E. coli. Handhaven van de nematode culturen bij 20 ° C in een broedstoof.
Opmerking: Nematode stammen kunnen worden verkregen vanuit het midden van de genoom Caenorhabditis elegans. Voor deze studie, de wild-type, N2, stam en de OH7547 (otls199 [kat-2::GFP + rgel-1 (F25B3.3):: dsRed + rol-6(su1006)]) stam, dat vertoont een roller fenotype, werden gebruikt. - Doorgeven wormen voor toekomstige culturen.
- Verwijderen de Petri schotel met C. elegans en een ongebruikte habitat petrischaal uit de incubator temperatuurgevoelig. Plaats ze op het podium van een ontleden Microscoop.
- Licht de Bunsenbrander en steriliseren van de platina nematode pick door het plaatsen van het metaal in de vlam totdat het rood gloeit. Laat de pick afkoelen tot kamertemperatuur. Niet de pick vastgelegd of laat de pick komen in contact met contaminanten.
- Voorzichtig raak het uiteinde van de pick aan de rand van de cirkel van bacteriën. Deze stof is plakkerig en maakt individuele volwassen nematoden makkelijker oppakken.
- Tot 4 gravid aaltjes overbrengen in een Nematode groei Medium (NGM) agar gevulde Petri plaat en Incubeer bij 20 ° C. De wormen zullen leggen eieren die in vier dagen zullen vervallen.
- De resterende nematoden terugkomen in de incubator na het verplaatsen van vier volwassen nematoden.
2. Optische Setup ( Figuur 1)
- Secure de helium-neon laser in de buurt van de hoek van de rug links van de optische workbench en het aansluiten op een voedingsbron.
Opmerking: De laser ' s beam moet voldoen aan de eisen voor oversampling. De C. elegans zijn ongeveer 1 mm lang, dus de laserstraal moeten een diameter groter dan 2 mm tijdens het incident op de nematode, maar niet groter dan 5 mm zodat het diffractie-patroon is niet moeilijk te vinden. - Plaats een filter met neutrale dichtheid tussen de helium neon laser en het monster zodanig zijn dat de laserstraal de filter passeert alvorens het monster.
- Met twee voorste oppervlakte aluminium stuurinrichting spiegels, bouwen een periscoop door het veiligstellen van de eerste spiegel na de filter met neutrale dichtheid. Beveilig de tweede mirror ongeveer 10 cm onder de eerste spiegel om ruimte invoegen de cuvette tussen de spiegels te sturen van de laserstraal te geven. Uitlijnen van de laserstraal en meetcel zodat de laserstraal verticaal door de cuvette reist.
Opmerking: De afstand van het diffracting organisme tot de fotodiode moeten veel groter dan het organisme zelf tot ver-veld diffractie. In dit experiment, de afstand van de Cuvet tot de fotodiode is 20 cm. - De fotodiode direct tegenover de tweede mirror secure met haar geconfronteerd met de spiegel sensor.
Opmerking: De Cuvet met de nematode wordt geplaatst tussen de twee spiegels met behulp van chemie klemmen. Zie de hoofdstukken 4 en 5. - Plaats een water gevulde Cuvet op de stand. De hoogte van de stand aangepast. De hoogten en de hoeken van de spiegel 1 en spiegel 2 zodanig aanpassen dat de laserstraal door het gericht in de buurt van, maar niet rechtstreeks op de fotodiode cuvette reist.
- Gebruik een niveau om ervoor te zorgen het formulier staat een geëgaliseerd oppervlak voor de meetcel. Pas zo nodig de spiegels verder aan.
- De fotodiode verbinden met de digitale oscilloscoop met behulp van de USB-kabel voorzien van de digitale oscilloscoop. De digitale oscilloscoop verbinden met de computer die wordt gebruikt voor het opnemen en opslaan van de gegevens.
3. Oscilloscoop Setup
- de samplefrequentie met behulp van de software voor de oscilloscoop op de computer ingesteld op ten minste 8 Hz op te lossen de pak slaag-cyclus van de worm voldoende.
Opmerking: De samplefrequentie moet meer dan tweemaal die van de frequenties van de verwachte pak slaag soorten zodat de Nyquist stelling 11 is tevreden.
4. Voorbereiding van de Worm en Cuvette voor gegevensverzameling
- vier volwassen nematoden overbrengen in een verse NGM 10 agar gevulde Petri plaat met behulp van een dunne, platte platina-draad pick (zie punt 1.3).
- Een wegwerp plastic cuvette verwijderen uit het pakket, voorzichtig om te alleen raken van de Cuvet aan haar geribbelde zijden.
- Gebruik een micropipet om Pipetteer gedestilleerd water in de meetcel totdat de cuvette ongeveer 80 is % gevuld met gedestilleerd water.
Opmerking: Het is belangrijk om alleen gebruik gedestilleerd water of geïoniseerd buffers zoals M9 10 of -fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij het verwerken van de nematoden, zoals leidingwater micro-organisme-doden verbindingen bevat. - Plaats de petrischaal met de C. elegans om te worden gebruikt onder een ontleden.
- Met behulp van de platina pick, een volwassen C. elegans verwijderen uit de petrischaal en de pick onderdompelen in de meetcel, verplaatsen de pick in cirkels indien nodig te verjagen van de nematode.
- Ter voorkoming van bubbels vormen in de meetcel, vul de Cuvet met water totdat het iets over de cuvette uitstulpingen ' s boven. Vul de cuvette ' s cap geheel met water dan snel legde het GLB op de cuvette.
- Gebruiken een optische poetsdoek voor het verwijderen van de waterdruppels die kunnen hebt gemorst over en optische schoonmaken van papier om eventuele kleine overgebleven druppels schoon.
5. Real Time Data-acquisitie van diffractie patroon intensiteit wijzigingen
- inschakelen de helium-neon laser en de frequentie/kleurinstelling zodanig aanpassen dat het produceert een rode balk. Inschakelen van de sensor.
Let op: Gebruik van een lage-energiestraal op 632 nm, als C. elegans voorkomen hoge-frequentie (blauw) licht 12. - Zoek de worm in de meetcel. Houden van de Cuvet aan haar geribbelde zijden, zachtjes de cuvette kantelen totdat nematode is ongeveer in het midden van het gedeelte van de Cuvet.
Opmerking: Schudden of kantelen van de Cuvet heftig zorgt ervoor dat de worm te botsen met de wanden van de Cuvet. Dit kan schade aan de nematode.- Plaats de cuvette op de stand in het optische systeem, centreren van de worm binnen de laser ' s beam weerkaatst door de spiegel 1 spiegel 2. Zorg ervoor dat u elimineren strooilicht.
- Centreren van de worm in de laserstraal.
- Plaatst de fotodiode in het diffractie-patroon, zodat de locatie van de fotodiode en het centrale maximum van het diffractie-patroon niet samenvallen.
- Aanpassen om te voorkomen dat de verzadiging van de fotodiode filter met neutrale dichtheid. Draaien van de neutrale densiteit filterwiel regelt de lichtintensiteit.
- Draaien de neutrale densiteit filteren, zodat de output van de fotodiode spanning verhoogt.
Opmerking: De uitvoer van de spanning wordt waargenomen met behulp van de software voor de digitale fotodiode. De fotodiode is verzadigd als de spanning niet verandert. In dat geval draai de filter met neutrale dichtheid totdat de spanning vermindert zonder afvlakken uit een minimale lezing. Zorg ervoor dat het signaal van de spanning niet wordt plat tijdens de piek lezingen, met vermelding van de verzadiging van de fotodiode. De lichtintensiteit verminderen door het draaien van de neutrale densiteit filterwiel als verzadiging is nageleefd.
- Draaien de neutrale densiteit filteren, zodat de output van de fotodiode spanning verhoogt.
- Zodra het bewegende diffractie-patroon zichtbaar, verzamelen gegevens met de fotodiode is door te klikken op de startknop op de beheersing van de oscilloscoop observatie van de worm tijdens software ' s verkeer. Metingen blijven totdat de worm de laserstraal en de diffrac verlaattion patroon verdwijnt, die duurt meestal ongeveer 20 s.
- Stop het verzamelen van gegevens proces door te klikken op de stopknop op de software voor de oscilloscoop. Sla elk afzonderlijk experiment ' s gegevens in CSV- of TXT-indeling.
- Herhaal stap 5.2-5.3 tot ten minste 50 datasets zijn verzameld voor elke fenotype. Gebruik maken van acht tot tien dieren per proef.
- Als de cuvette is gekrast Gooi en de worm, en herhaal stap 4. Als de worm is geschaad in de overdracht, het vervreemden en spoel de Cuvet met gedestilleerd water voordat herhalende stap 4 gebruik van de dezelfde cuvette.
- Herhaal stap 5 met behulp van de OH7547 " Roller " stam, voorzichtig aan de gegevens om aan te geven van de worm stam labelen.
6. Fourier Spectrum of Data
- importeren van de gegevens die zijn verworven in een data-analyseprogramma staat uit te voeren van Discrete Fourier transformaties 3.
- Uitvoeren Fourier transforms op iedere gegevensset met behulp van de snelle Fourier transformatie (FFT) optie van de software.
- Gemiddelde van de frequenties van de FFT-resultaten voor elke amplitude voor de N2 wild type wormen.
- Herhaal stap 6.3 met behulp van de FFTs van de OH7547 " roller " wormen.
7. Het modelleren van de Fourier-Spectrum
- programma, een binaire model van de nematode motoriek (Zie programma opgenomen in de aanvullende materialen).
Opmerking: Dit model is een ruwe benadering, die op de prominente kenmerken van worm beweging het eerst wordt weergegeven. Het model kan worden verfijnd als de resultaten worden vergeleken met de werkelijke wormen. Worm shapes zijn benaderingen met behulp van de Microscoop beelden 13.- De sequentiële frames maken van het binaire model bewegen door ten minste twee worm cycli ( Figuur 2a). Bekijk de video's in de aanvullende materialen; C-Worm (CWorm.avi) en W Worm video (WWorm.avi).
- Sequentiële diffractie patronen produceren. Zie de video's in de aanvullende materialen. C Worm diffractie video (CWormDiff.avi) en W Worm video (WWormDiff.avi).
- Fouriertransformatie elke binaire frame van de afbeelding van de worm. Hoe groter de bekleding van het frame rond de worm, hoe beter de resolutie van de afbeelding diffractie zullen.
Opmerking: De absolute waarde van elk Fourier getransformeerde frame is evenredig aan het overeenkomstige diffractie patroon ( Figuur 2b). - Stemmen het contrast van de diffractie patroon door de intensiteiten van de diffractie patroon toe te wijzen aan een logaritmische schaal.
Opmerking: Camera's en ogen hebben de neiging om te kunnen functioneren op een niet-lineaire schaal. Een logaritmische schaal kunt simuleren hoe een diffractie patroon wordt meestal ervaren door het menselijk oog.
- Fouriertransformatie elke binaire frame van de afbeelding van de worm. Hoe groter de bekleding van het frame rond de worm, hoe beter de resolutie van de afbeelding diffractie zullen.
- Extract van het signaal van de gemodelleerde diffractie.
- Kies een locatie uit het midden, die overeenkomt met naar de locatie van de fotodiode in het patroon van diffractie.
- De naburige matrixelementen rond de locatie van de fotodiode te simuleren de omvang van de fotodiode toevoegen. De grootte van de fotodiode is meestal 0,1% van het patroon van de gemodelleerde diffractie.
- Record en plot de volgorde van de omvang van de diffractie signalen. Controleer of het signaal fysiek redelijk is (dat wil zeggen, in het geval van periodieke pak slaag, het signaal van de fotodiode moeten periodieke evenals).
- Fourier transform van het signaal van de diffractie verkregen in 7.3 en resultaten te vergelijken met de experimentele gegevens.
- Herhalen voor verschillende worm stammen en vergelijk.
Representative Results
De optische experimentele opzet afgebeeld in Figuur 1 staat voor de studie van micro-organismen zonder wordt gebonden aan een brandvlak. Het pak slaag signaal van de fotodiode kan worden waargenomen in real time op het computerscherm, naarmate de gegevens worden verzameld. Ongebruikelijke patronen zal onmiddellijk zichtbaar zijn zonder te analyseren van een video in detail.
Voorbeelden van gemodelleerde sequentiële worm verkeer en bijbehorende diffractie patronen zijn afgebeeld in Figuur 2. De patronen van de gemodelleerde diffractie kwalitatief lijken op experimentele patronen1 en zijn een eerste indicatie dat de simulaties met succes de nematode model.
Een monster temporele diffractie handtekening van de twee soorten C. elegans studeerde hier is afgebeeld in Figuur 3. Het kan worden kwalitatief gezien dat elke nematode thrashes op verschillende tarieven en amplitudes. Enkele van de verschillen kunnen worden gekwantificeerd door bocht montage zoals in een eerdere publicatie1werd gedaan. De discrete Fouriertransformatie, blijkt echter meer informatie over ingesloten frequenties:
, (1)
waar Fk is de digitale Fourier-transformatie (FT) en fn is het signaal van de tijd-afhankelijke rauwe diffractie met de discrete tijd is variabele n en de discrete frequentie variabele N k. het totale aantal gegevenspunten. De gemiddelde digitale Fourier-transformatie zorgt voor de nematode worden geïdentificeerd door de amplitude van de diffractie frequentiespectrum (Figuur 4). Het wild type spectrum wordt gedomineerd door lagere frequenties dan de roller motion spectrum.
Een model dat het wild type versus de roller C. elegans notities benadert het wild type neiging om thrash in een wavelike beweging (W of S-vorm) (Figuur 2a), terwijl de roller neigt om de gunst van de ene kant strekking ruwweg een oscillerende C-vorm ( Figuur 5). Dit biedt enige uitleg voor de verschillende spectra. De roller zal meestal een C aan de ene kant vormen, terwijl de W trilling kan worden beschouwd als twee tegengestelde C bewegingen. Om deze reden is de motie W complexer onthullen meer secundaire lage frequenties dan de C-motion. Dit resultaat wordt bevestigd in de computationele model. De W-vorm heeft een veel hogere frequentie-dichtheid dan de C-vorm (Figuur 6). Dit wordt bevestigd in de FFT in Figuur 4 waar de roller frequenties zijn meer geclusterd terwijl niet volledig discreet. De statistieken van de roller zijn vertekend omdat de roller naar de wild type motoriek tijdelijk terugkeren kunt.
De afgevlakte macht spectra van roller type C. elegans toont een brede piek op ~1.5 Hz, terwijl het zwemmen wilde type C. elegans een multimodale spectrum (inclusief pieken bij ~1.0 Hz en 1,75 Hz vertoont). De fotodiode (PD) heeft een eindige grootte verspreiden over verschillende matrixelementen. Afzonderlijke matrixelementen of punten op de diffractie patroon variëren in intensiteit aangezien constructieve en destructieve interferentie varieert; de frequenties waarop de intensiteiten variëren echter hetzelfde voor alle matrixelementen, zoals te zien is in Figuur 7. Gezien de tijdsafgeleide Eq. 1 blijkt dat de schommelingen van de frequentie niet afhankelijk van de fase-matrix maar alleen op de schommelingen van het oorspronkelijke object:
, (2).
Als de PD over verschillende matrixelementen verspreidt, gemiddelde de piek locaties aan een consistente frequentie-profiel. Afwisseling kan worden verwacht en kan geven aanwijzingen over de oriëntatie van de worm. De frequentieverdeling zal veranderen als de gang van de veranderingen van de worm. Het huidige model is een eenvoudig model waarmee alleen voor de evaluatie van de top locaties in plaats van relatieve piekhoogten. Verschillende motorische patronen zal gemiddeld naar verschillende piek locaties.
Figuur 1. Experimentele opzet. De energiebesparende laser beam reizen door de filter met neutrale dichtheid, wordt weerspiegeld door de spiegel M1 naar beneden via de Cuvet met de worm op spiegel M2 en reizen naar de fotodiode. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Sequentiële Worm vormen en bijbehorende diffractie patronen. (een) Selecteer enkele sequentiële binaire afbeeldingen van gemodelleerde W vorm nematoden en de (b) overeenkomstige sequentiële diffractie patronen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Experimentele monster diffractie handtekeningen. Diffractie handtekeningen verzameld voor (een) OH7547 "roller" en (b) N2 wilde type C. elegans met behulp van een enkele fotodiode in de diffractie patroon. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Experimentele gemiddeld vermogen Spectra van de Roller en Wild Type Fraunhofer diffractie Series. De spectra Toon de frequenties in gemiddelde Fourier-transformatie van de tijdreeks presenteren opgenomen met de fotodiode. Een Gaussiaans filter van standaarddeviatie 0.075 Hz, afgekapt op 3 standaardafwijking; wordt gebruikt voor het vloeiend maken. Opmerking de brede spectrale piek op ~1.5 Hz in het spectrum van de afgevlakte roller, vergeleken met het spectrum van de multimodale afgevlakte wild-type (met inbegrip van pieken bij ~1.0 en 1.75 Hz). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. Diffractie vorming illustratie. Diffractie patronen kunnen worden gemodelleerd door te denken van elk lijnsegment als een oneindig kleine rechte lijn (links). Boven elkaar plaatsen deze lijnen (rechts) toont de bouw van ver-veld diffractie patronen gegenereerd door een C-vormige nematode. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6. Gesimuleerd Power Spectra van de Roller en Wild Type Fraunhofer diffractie Series. (een) C vorm en (b) W vorm wormen met de fotodiode gecentreerd op de matrixelementen 200 (verticaal) en 175 (horizontaal). De W-vorm toont een hogere dichtheid van frequenties als gevolg van de meer complexe motoriek. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7. Spectra van de macht van de Roller en Wild Type Fraunhofer diffractie serie op verschillende fotodiode locaties gesimuleerd. (een) W vorm- en (b) C vorm worm voor enkele matrixelementen op verschillende locaties verschillende locaties van de fotodiode simuleren. Piekhoogten variëren voor verschillende locaties; piek locaties blijven echter hetzelfde voor specifieke shapes. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Met inbegrip van stukken van gegevens met inactiviteit zal vertekenen de resultaten aangezien kunstmatige lagere frequenties zal worden gemiddeld in de resultaten. Verzadigen van de fotodiode kan worden herkend door de vlakke toppen of "afgesneden" pieken in de ruwe gegevens. Elke ruwe data set te delen door de piek intensiteit zal helpen met de boekhouding voor schommelingen in de intensiteit van de laser.
De frequenties van de piek zijn een indicatie van de totale dorsen frequentie; echter ingewikkeld beweging veroorzaakt storingen bij beat frequenties in het patroon diffractie en moeten zorgvuldig worden onderzocht.
Deze methode kan worden gebruikt om te onderzoeken van de motoriek van andere nematoden. Het milieu kan worden gewijzigd in een ander medium. Golflengten kunnen ook worden gewijzigd. Werken in het zichtbare bereik van het elektromagnetische spectrum is de gemakkelijkste en veiligste.
Een meer verfijnde model zal in de toekomst realistischer de diffractie spectra simuleren. Een toekomstig model bevatten een worm die richtsnoeren, die zou geen invloed op de frequentie locaties maar relatieve piekhoogten kunt wijzigen. Een meer realistische model zou voor een probabilistische verdeling van pak slaag frequenties, die zou het verbreden van de pieken in de experimentele gegevens. Een spreiding in frequenties zou meetvariaties te geselen frequenties.
De huidige vorm van de worm is ruw, vooral in de regio kop en staart, die meer taps toelopende dan in het huidige model moet. Het wellicht interessant om uit te voeren van een gedetailleerde analyse van de tijdreeks van het signaal omdat het zou kunnen aanwijzingen over de complexiteit van het voortbewegen in verschillende mutanten geven.
Het is de uitvoerbaarheid van uitbreiding van deze techniek in de karakterisering van meerdere nematoden gelijktijdig overwegen waard. Deze methode moet worden opgevat als een aanvullende methode om bestaande methoden met behulp van traditionele microscopen. Deze methode heeft een voordeel niet verplichten een Microscoop tijdens de data-acquisitie zodat de worm uit het brandvlak kan verplaatsen. De gemiddelde frequentie spectra vertonen duidelijke verschillen in worm beweging en kunnen worden gekwantificeerd door de toppen van de voorkomende frequentie, die een nieuwe methode in het kwantificeren van de motoriek van de worm. Data-analyse van de diffractie handtekeningen is in de verdere ontwikkeling en hopelijk zal leiden tot een geautomatiseerde identificatieproces van meerdere mutanten en individuen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Juan Vasquez voor zijn computationele bijdragen met dit project. We zijn dankbaar voor de steun van de Vassar College Undergraduate Research zomer Instituut (URSI), het onderzoeksfonds voor Lucy Maynard zalm en de NSF award nr. 1058385.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tunable Helium-Neon laser | Research Electro-Optics | 30602 | Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm. |
| 2 Front Surface Aluminum Mirrors | Thorlabs | PF10-03-F01 | |
| Photodiode: SI Amplified Detector | Thorlabs | PDA 100A | |
| Quartz Cuvette | Starna Cells | 21/G/5 | Plastic cells may be used as well. |
| MatLab (Software) | MathWorks | R2016b (9.1.0.441655) | Use the fft command to simulate diffraction |
| Excel | Microsoft | 14.7.1 | Used for data analysis of Figure 4 |
| Caenorhabditis elegans Roller | University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC) | Strain: OH7547 Genotype: otIs199. |
https://cbs.umn.edu/cgc/home |
| Caenorhabditis elegans Wild Type | University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC) | Strain:N2 Genotype: C. elegans wild isolate | https://cbs.umn.edu/cgc/home |
References
- Magnes, J., et al. Analysis of Freely Swimming C. elegans Using Laser Diffraction. Open J. Biophys. 2, 101-107 (2012).
- Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Eells, R. Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction. J. Vis. Exp. (68), (2012).
- James, J. F. A Student's Guide to Fourier Transforms with Applications in Physics and Engineering. , Cambridge University Press. Cambridge. (1995).
- Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans. J. Exp. Biol. 210, (2007).
- Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology. Arch. Biochem. Biophys. 602, 32-47 (2016).
- Thibault, P., Rankenburg, I. C. Optical diffraction microscopy in a teaching laboratory. Amer. J. Phys. 75 (9), 827-832 (2007).
- Miao, J., Ishikawa, T., Anderson, E. H., Hodgson, K. O. Phase retrieval of diffraction patterns from non crystalline samples using the oversampling method. Phys. Rev. B. 67, 174104 (2003).
- Zhang, Y. P., Zhang, J. Q., Xu, W. Method for eliminating zero-order diffraction in lensless Fourier transform digital holography. Optik - International Journal for Light and Electron Optics. 124 (21), 4873-4875 (2013).
- Brody, A. H., Chou, E., Gray, J. M., Pokrywka, N. J., Raley-Susman, K. M. Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration. NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).
- Stiernagle, T. The C. elegans Research Community. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Dasalukunte, D., Öwall, V., Rusek, F., Anderson, J. B. Faster than Nyquist Signaling. Algorithms to Silicon. , Springer International Publishing. Switzerland. (2014).
- Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6 (8), e198 (2008).
- Bilbao, A., Wajnryb, E., Vanapalli, S. A., Blawzdziewicz, J. Nematode Locomotion in Confined and Unconfined Fluids. Phys. Fluids. 25, 081902 (2013).
