Summary
Dieses Manuskript wird beschrieben, wie verschiedene Nematoden Fernfeld Beugung Signaturen zu unterscheiden. Wir vergleichen die Fortbewegung von 139 Wildtyp und 108 "Roller" C. Elegans durch Mittelung Frequenzen die zeitliche Fraunhofer Beugung Signatur an einem Standort mit Hilfe eines Lasers kontinuierliche Welle zugeordnet.
Abstract
Dieses Manuskript beschreibt die Nematoden mit zeitlichen Fernfeld Beugung Signaturen zu klassifizieren. Ein einzelnes C. Elegans ruht in einer Wassersäule in einer optischen Küvette. Ein 632 nm kontinuierliche Welle HeNe-Laser wird durch die Küvette unter Verwendung der vorderen Oberfläche Spiegel gerichtet. Ein deutlichen Abstand von mindestens 20-30 cm reiste nach das Licht die Küvette durchläuft gewährleistet eine nützliche Fernfeld (Fraunhofer) Beugungsmuster. Die Beugung Muster Änderungen in Echtzeit wie die Nematoden schwimmt in den Laserstrahl. Die Fotodiode wird in das Beugungsmuster außermittig platziert. Das Spannungssignal von der Photodiode wird in Echtzeit beobachtet und über ein digitales Oszilloskop aufgezeichnet. Dieser Vorgang ist für 139 Wildtyp und 108 "Roller" C. Eleganswiederholt. Wildtyp-Würmer zeigen eine schnelle Schwingungsmuster in Lösung. Die "Roller" Würmer haben eine Mutation in eine Schlüsselkomponente der Nagelhaut, die mit glatten Fortbewegung behindert. Zeitintervalle, die nicht frei von Sättigung und Inaktivität werden verworfen. Es ist praktisch jeder Schnitt durch seine maximale relative Intensität zu vergleichen zu teilen. Das Signal für jeden Wurm ist, dass Fourier transformiert, damit ergibt sich die Frequenzmuster für jeden Wurm. Das Signal für jede Art von Wurm wird gemittelt. Die gemittelten Fourier-Spektren für die wilde Art und der "Roller" C. Elegans unterscheiden sich deutlich und zeigen, dass die dynamische Wurm Formen der beiden anderen Wurm Stämme mit Hilfe der Fourier-Analyse unterschieden werden können. Die Fourier-Spektren von jedem Wurm Stamm passen eine ungefähre Modell mit zwei verschiedenen binären Wurm-Formen, die Muskeln Momente entsprechen. Der Umschlag der gemittelten Häufigkeitsverteilung für tatsächliche und modellierten Würmer bestätigt, dass das Modell die Daten übereinstimmt. Diese Methode dient als Grundlage für die Fourier-Analyse für viele mikroskopisch kleine Arten, wie jeder Mikroorganismus seine einzigartige Fourier-Spektrum haben.
Introduction
Diese Methode vergleicht experimentelle und modellierten Frequenzspektren der Fortbewegung von C. Elegans mit zwei Sorten mit sehr unterschiedlichen lokomotorischen Muster. Die Ergebnisse zeigen, dass das Frequenzspektrum von zeitlichen Veränderungen abhängt, da die Nematoden in einer Wassersäule schwimmt, so dass klare mikroskopische Bilder nicht für die Analyse benötigt werden. Diese Methode ermöglicht die quantitative Echtzeit-Analyse und bietet ergänzende Informationen, Bilder und Videos mit traditionellen Mikroskope erhalten. Fraunhofer Beugung, auch genannt Fernfeld Beugung, bildet die Grundlage für den Erhalt der live Beugung Daten1,2. Die Lichtintensität an jedem einzelnen Punkt in das Beugungsmuster ist das Ergebnis der Überlagerung von Licht aus allen Richtungen in der Gliederung der Nematoden3. Infolgedessen trägt die Lichtintensität im Laufe der Zeit gesammelt Informationen über die Fortbewegung der Nematoden. Analyse der zeitabhängigen Beugung-Signal kann die charakteristische Bewegung der entsprechenden Mutante identifizieren, da analysieren alle Beteiligten in der Fortbewegung Frequenzen die traditionellen video-Analyse ergänzt. In diesem Fall werden die charakteristischen Unterschiede zwischen der Fortbewegung der "Walze" und Wildtyp C. Elegans bestätigt durch den Vergleich der Frequenz-Spektren von zwei verschiedenen Stämmen von Nematoden.
Einige frühere Merkmale wurden mit Frequenzanalyse der Beugung Signale wie Schwimmbad Frequenzen2,4bestätigt. Noch wichtiger ist, kann diese Methode verwendet werden als ergänzende Methode zur traditionellen Mikroskopie, um Fortbewegung in Echtzeit auf einem Computerbildschirm zu beobachten, wie die Daten erhoben werden. Das Frequenzspektrum der Würmer mit unterschiedlichen lokomotorischen Muster kann quantifiziert werden, unter Berücksichtigung, dass die Fourier Signal von der Beugung Signal umgewandelt.
Des interdisziplinären Charakters der Fourier-basierte Beugung in dieser Arbeit umfasst die Bereiche der Biologie und Physik. Beugung durch unter Probenahme wurde lange zur Kristallstrukturen in Biologie5 und anderen Bereichen zu untersuchen. In diesem Experiment schafft jedoch oversampling6,7 der Fernfeld Beugungsmuster so dass der Organismus in den Laserstrahl zentriert ist. Oversampling ist in der Regel für Objektiv-weniger bildgebende8 in Verbindung mit einer Phase Retrieval-Algorithmus verwendet, die ein Bild des ursprünglichen Objekts rekonstruiert. Phase Retrieval ist schwer zu erreichen wenn Streusignal vorhanden sind, wie der Fall mit einem Fadenwurm ist. Die zeitliche Beugung Unterschrift genügt, um Schlüsselfrequenzen der Wurm Bewegung zu bewerten. Diese Methode ist weniger rechnerisch Besteuerung und bietet eine optische Möglichkeit zur Fortbewegung zu quantifizieren. Diese Technik könnte ohne weiteres zur Analyse von Mutationen oder Umgebungsbedingungen, die Verhalten ändern angepasst werden.
Protocol
1. C. Elegans Wachstum und Pflege
- Nematoden Kultur Gerichte vorbereiten.
- Füllen die Petrischalen mit einer Agar-Lösung und lassen Sie sie zu festigen, dann Samen mit einer E. Coli-Kultur von der OP50 9 , 10 Stamm.
- Start Einwohner Erwachsenen Nematoden auf jeder Platte indem mehrere Erwachsene Würmer auf frischen Agar gefüllten Petrischalen mit einem E. Coli-Patch vorzubereiten. Pflegen die Nematoden Kulturen bei 20 ° C in einem Inkubator.
Hinweis: Nematoden Sorten erhalten Sie bei Caenorhabditis Elegans Genome Center. Für diese Studie, dem Wildtyp, N2, Dehnung und die OH7547 (otls199 [Katze-2::GFP + Rgel-1 (F25B3.3):: DsRed + rol-6(su1006)]) Stamm, der einen Walze Phänotyp zeigt, waren ausgelastet. - Würmer Propagate für zukünftige Kulturen.
- Entfernen die Petri-Schale mit C. Elegans und einen ungenutzten Lebensraum Petrischale aus dem temperierten Inkubator. Legen Sie sie auf der Bühne eines sezierenden Mikroskops.
- Licht der Bunsenbrenner und sterilisieren die Platin Nematoden Pick indem man das Metall in die Flamme, bis es rot glüht. Lassen Sie die Kommissionierung auf Raumtemperatur abkühlen. Nicht die Abholung festgelegt oder lassen die Pick in Kontakt mit Verunreinigungen kommen.
- Berühren sanft die Spitze der Abholung an den Rand des Kreises der Bakterien. Diese Substanz ist klebrig und Kommissionierung einzelnen Erwachsenen Nematoden einfacher machen.
- Bis zu 4 trächtige Nematoden auf eine Nematode Wachstum Medium (NGM) Agar gefüllt Petri Platte übertragen und bei 20 ° c inkubieren Die Würmer legen Eiern, die in vier Tagen fällig werden.
- Rückkehr die restlichen Nematoden in den Inkubator nach dem Umzug von vier Erwachsenen Nematoden.
2. Optischen Aufbau ( Abbildung 1)
- Secure die Helium-Neon laser nahe der Rückseite linke Ecke der optischen Workbench und schließen Sie es an eine Stromquelle.
Hinweis: Der Laser ' s-Beam muss erfüllen die Anforderungen für Oversampling. C. Elegans sind etwa 1 mm lang, daher sollte der Laserstrahl einen Durchmesser größer als 2 mm während der Vorfall auf der Nematoden, aber nicht größer als 5 mm haben, so dass das Beugungsmuster nicht schwer zu lokalisieren ist. - Ein Graufilter zwischen der Helium-Neon-Laser und der Probe zu platzieren, so dass der Laserstrahl durch den Filter vor dem Erreichen der Probenmaterials reist.
- Mit zwei vorderen Oberfläche Aluminium Lenkung Spiegel, bauen ein Periskop durch die Sicherung des ersten Spiegels nach der Graufilter. Den zweite Spiegel ca. 10 cm unterhalb der erste Spiegel geben Raum, um den Laserstrahl zu steuern und legen die Küvette zwischen den Spiegeln zu sichern. Der Laserstrahl und Küvette so ausrichten, dass der Laserstrahl senkrecht durch die Küvette reist.
Hinweis: Der Abstand zwischen den diffracting Organismus die Fotodiode muss viel größer als der Organismus selbst Fernfeld Beugung zu erreichen sein. In diesem Experiment aus der Küvette die Fotodiode erreichen Sie nach 20 cm. - Sichern die Photodiode direkt gegenüber den zweiten Spiegel mit seinem Sensor vor dem Spiegel.
Hinweis: Die Küvette mit der Fadenwurm wird zwischen den beiden spiegeln mit Chemie Klammern platziert werden. Siehe Abschnitte 4 und 5. - Setzen ein Wasser gefüllten Küvette auf die Halterung. Die Höheneinstellung des Standes. Die Höhen und Winkel der Spiegel 1 und 2 Spiegel so einstellen, dass der Laserstrahl die Küvette gerichtet durchläuft, in der Nähe aber nicht direkt auf die Fotodiode.
- Hilfe einer Wasserwaage die Stände Form eine flache Oberfläche für die Küvette sicherzustellen. Ggf. die Spiegel weiter.
- Verbinden die Fotodiode, die digitales Oszilloskop mithilfe des USB-Kabels mit dem digital Oszilloskop zur Verfügung gestellt. Digitale Oszilloskop an den Computer, die verwendet werden, aufnehmen und Speichern der Daten anschließen.
3. Oszilloskop-Setup
- mit der Software für das Oszilloskop auf dem Computer soll mindestens 8 Hz, den Prügel-Zyklus des Wurms hinreichend zu lösen die Sample-Rate.
Hinweis: Die Sample-Rate sollte mehr als das Doppelte der erwarteten Prügel Frequenzen der Gattung so dass Nyquist Theorem 11 erfüllt ist.
4. Vorbereitung der Wurm und Küvette zur Datenerfassung
- übertragen vier Erwachsenen Nematoden auf einen frischen NGM 10 Agar gefüllt Petri Teller mit einem dünnen, flachen Platindraht Pick (siehe Abschnitt 1.3).
- Entfernen eine Einweg-Plastik-Küvette aus der Verpackung, wobei Sie darauf achten, nur die Küvette auf seine geriffelten Seiten berühren.
- Verwendung einer Mikropipette, destilliertes Wasser in die Küvette pipette, bis die Küvette ca. 80 % ist gefüllt mit destilliertem Wasser.
Hinweis: Es ist wichtig, nur mit destilliertem Wasser oder ionisierten Puffer z. B. M9 10 oder Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) beim Umgang mit der Nematodes wie Leitungswasser Mikroorganismen töten Verbindungen enthält. - Legen die Petrischale mit C. Elegans sezierenden Rahmen verwendet werden.
- Mit dem Platin Pick, eine Reife C. Elegans aus der Petrischale und tauchen die Abholung in der Küvette, die Kommissionierung in Kreisen bewegen, wenn nötig, die Nematoden zu verdrängen.
- Verhindern Blasenbildung in der Küvette, die Küvette mit Wasser füllen, bis es leicht wölbt sich über die Küvette ' s oben. Füllen Sie die Küvette ' s-GAP vollständig mit Wasser dann schnell setzen Sie die Kappe auf die Küvette.
- Verwenden eine optische Reinigungstuch Wassertropfen zu entfernen, die vorbei und optische Reinigungspapier zur Reinigung kleinen verbleibenden Tropfen verschüttet haben kann.
5. Echtzeit-Datenerfassung von Beugung Muster Intensität Änderungen
- schalten Sie die Helium-Neon laser und Einstellung der Frequenz/Farbe, so dass es einen roten Strahl erzeugt. Schalten Sie den Sensor.
Vorsicht: Verwenden Sie einen niedrig-Energie-Strahl auf 632 nm, als C. Elegans vermeiden Hochfrequenz (blau) Licht 12. - Suchen Sie den Wurm in die Küvette. Halten die Küvette auf seine geriffelten Seiten die Küvette leicht kippen, bis etwa in der Mitte des Teils der Küvette Nematoden ist.
Hinweis: Wackeln oder kippen die Küvette heftig bewirkt, dass den Wurm mit den Wänden der Küvette zu kollidieren. Dies kann die Nematode beschädigen.- Ort die Küvette auf dem Ständer in das optische System, Zentrierung des Wurms innerhalb der Laser ' s-Beam von Mirror 1 Mirror 2 reflektiert. Achten Sie darauf, um Streulicht zu vermeiden.
- Center die Wurm in den Laserstrahl.
- Die Fotodiode in das Beugungsmuster zu platzieren, so dass die Lage der Fotodiode und zentrale maximal das Beugungsmuster stimmen nicht überein.
- Einstellen der Graufilter zur Sättigung der Fotodiode zu verhindern. Das neutrale Dichte Filterrad drehen, regelt die Lichtintensität.
- Drehen die neutrale Dichte so filtern, dass erhöht die Spannung, die Ausgabe von der Photodiode.
Hinweis: Die Ausgangsspannung wird mit der Software für die digitale Fotodiode beobachtet. Die Fotodiode ist gesättigt, wenn die Spannung nicht ändert. In diesem Fall drehen Sie die Graufilter, bis die Spannung reduziert, ohne eine minimale Lesung Verflachung. Sicherstellen Sie, dass das Spannungssignal nicht in den Peak-Lesungen, Angabe Sättigung der Fotodiode abflachen wird. Reduzieren Sie die Lichtintensität durch Drehen der neutralen Dichte Filterrad wenn Sättigung beobachtet wird.
- Drehen die neutrale Dichte so filtern, dass erhöht die Spannung, die Ausgabe von der Photodiode.
- Sobald die beweglichen Beugungsmuster sichtbar, sammeln Daten mit der Fotodiode ist durch Klicken auf die Schaltfläche "Start" auf die Software steuert das Oszilloskop während der Überwachung des Wurms ' s-Bewegung. Nehmen Sie Messungen bis bewegt sich der Wurm aus der Laserstrahl und die diffracTion Muster verschwindet, das dauert in der Regel etwa 20 s.
- Stop der Datenerfassung Prozess indem Sie auf die Stopp-Taste auf die Software für das Oszilloskop. Speichern Sie jede Prüfung ' s-Daten im CSV oder txt Format.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.2-5.3 bis mindestens 50 Datensätze für jede Phänotyp gesammelt wurden. Acht bis zehn Tiere pro Testversion verwenden.
- Wenn die Küvette ist zerkratzt entsorgen und der Wurm, und wiederholen Sie Schritt 4. Wenn der Wurm bei der Übertragung beschädigt ist, entsorgen Sie ihn und die Küvette mit destilliertem Wasser spülen, bevor wiederholen Schritt 4 unter Verwendung der gleichen Küvette.
- Wiederholen Sie Schritt 5 mit der OH7547 " Walze " Stamm, achten Sie darauf, die Daten, um den Wurm Belastung zeigen beschriften.
6. Fourier-Spektrum von Daten
- importieren die Daten in eine Daten-Analyse-Programm in der Lage, diskrete Fourier Transformationen 3.
- Führen Sie Fourier wandelt auf jeder Datensatz mit Hilfe der schnellen Fourier-Transformation (FFT) Option der Software.
- Durchschnitt der Frequenzen aus der FFT-Ergebnisse für jeden Amplitude für die N2-Wildtyp Würmer.
- Wiederholen Sie Schritt 6.3 mit dem FFTs von der OH7547 " Walze " Würmer.
7. Modellierung von Fourier-Spektrum
- Programm binäre Modellcharakter für die Nematoden Fortbewegung (siehe Programm in der ergänzenden Materialien enthalten).
Hinweis: Dieses Modell ist eine grobe Annäherung, die auf zunächst die herausragende Merkmale der Wurm Bewegung zeigt. Das Modell kann verfeinert werden, die Ergebnisse sind im Vergleich mit tatsächlichen Würmer. Wurm-Formen sind Annäherungen mit Mikroskop Bilder 13.- Sequentielle Frames Erstellen des binären Modells durch mindestens zwei Wurm-Zyklen ( Abbildung 2a). Sehen Sie die Videos in den ergänzenden Materialien; C-Wurm Video (CWorm.avi) und W Wurm Video (WWorm.avi).
- Sequentielle Beugungsmuster zu produzieren. Sehen Sie die Videos in den ergänzenden Materialien. C-Wurm Beugung Video (CWormDiff.avi) und W Wurm Video (WWormDiff.avi).
- Fourier-Transformation binäre Rahmen des Wurm-Bildes. Je größer der Abstand des Rahmens um den Wurm, desto besser die Auflösung des Bildes Beugung werden.
Hinweis: Der Absolute Wert jedes Fourier Transformierte Rahmens ist proportional zu den entsprechenden Beugungsmuster ( Abb. 2 b). - Tune den Kontrast des Beugungsmusters durch Zuordnen einer logarithmischen Skala die Intensitäten der Beugungsmuster.
Hinweis: Kameras und Augen neigen dazu, auf einem nicht-linearen Maßstab funktionieren. Eine logarithmische Skalierung kann simulieren, wie ein Beugungsmuster in der Regel vom menschlichen Auge wahrgenommen wird.
- Fourier-Transformation binäre Rahmen des Wurm-Bildes. Je größer der Abstand des Rahmens um den Wurm, desto besser die Auflösung des Bildes Beugung werden.
- Die modellierten Beugung Signal zu extrahieren.
- Wählen Sie eine exzentrische Lage, das entspricht auf den Speicherort der die Fotodiode in das Beugungsmuster.
- Fügen Sie die benachbarten Matrixelemente rund um den Speicherort der Fotodiode, die Größe der Fotodiode zu simulieren. Die Größe der Fotodiode ist typischerweise 0,1 % des modellierten Beugungsmuster.
- Rekord und Handlung signalisiert die Sequenz von der Größenordnung der Beugung. Überprüfen Sie, ob das Signal physikalisch sinnvoll ist (d. h., bei periodischen Prügel, das Signal von der Photodiode sollte regelmäßige sowie).
- Fourier transformieren die Beugung Signal in 7.3 erhalten und vergleichen Sie die Ergebnisse mit den experimentellen Daten.
- Für verschiedene Stämme der Wurm zu wiederholen und zu vergleichen.
Representative Results
Der optische Versuchsaufbau in Abbildung 1 dargestellte ermöglicht die Studie der Mikroorganismen ohne Bindung an eine Brennebene. Das Prügel-Signal von der Photodiode kann in Echtzeit auf dem Bildschirm beobachtet werden, wie die Daten gesammelt werden. Ungewöhnliche Muster werden sofort sichtbar sein, ohne eine Video im Detail zu analysieren.
Beispiele für modellierte sequentielle Wurm Bewegung und entsprechende Beugung Muster in Abbildung 2dargestellt. Die modellierten Beugungsmuster qualitativ ähneln experimentelle Muster1 und gibt einen ersten Hinweis, dass die Simulationen erfolgreich die Nematoden Modell.
Eine Probe zeitliche Beugung Signatur der zwei Arten von C. Elegans studierte hier ist in Abbildung 3dargestellt. Qualitativ ist ersichtlich, dass jede Nematoden bei unterschiedlichen Geschwindigkeiten und Amplituden schlägt. Einige der Unterschiede kann durch Kurvenanpassung wie in einer früheren Publikation1quantifiziert werden. Die diskrete Fourier-Transformation zeigt jedoch mehr Details über eingebettete Frequenzen:
, (1)
wo Fk ist die digitale Fourier-Transformation (FT) und f-n ist das zeitabhängige roh Beugung-Signal mit der diskreten Zeit ist Variable n und der diskrete Frequenz Variablen k. N die Gesamtzahl der Datenpunkte. Die durchschnittliche digitale Fourier-Transformation ermöglicht die Nematoden von Amplitude von der Beugung-Frequenz-Spektrum (Abbildung 4) identifiziert werden. Das Wildtyp-Spektrum wird von niedrigeren Frequenzen als die Walze Bewegung Spektrum dominiert.
Ein Modell, das nähert sich dem Wildtyp versus die Walze C. Elegans Noten tendenziell dem Wildtyp thrash im eine Wellenbewegung (W und S-Form) (Abbildung 2a), während die Walze tendenziell einseitig zu begünstigen, die etwa eine oszillierende C-Form ( ähnelt Abbildung 5). Dies bietet eine Erklärung für die unterschiedlichen Spektren. Die Walze wird meist eine C auf der einen Seite bilden, während die W-Schwingung als zwei gegenläufige Bewegungen C gedacht werden kann. Aus diesem Grund ist die W-Bewegung komplexer enthüllt weitere sekundäre tiefen Frequenzen als die C-Bewegung. Dieses Ergebnis wird in das Rechenmodell bestätigt. Die W-Form hat eine viel höhere Frequenz Dichte als die C-Form (Abbildung 6). Dies wird in das FFT in Abbildung 4 wo die Walze Frequenzen mehr gruppiert sind zwar nicht völlig diskret. Die Statistiken der Walze sind verzerrt, da die Walze Wildtyp Fortbewegung vorübergehend wiederherstellen kann.
Die geglättete Leistungsspektren der Rollentyp C. Elegans zeigt eine breite Spitze bei ~1.5 Hz, während dem Schwimmen Wildtyp C. Elegans eine multimodale Spektrum (einschließlich Peaks bei ~1.0 Hz und 1,75 Hz) aufweist. Die Fotodiode (PD) hat eine endliche Größe auf mehrere Matrixelemente verteilt. Einzelnen Matrixelemente oder Punkte auf das Beugungsmuster variieren in ihrer Intensität, da konstruktive und destruktive Interferenz variiert; Dennoch sind die Frequenzen, bei denen die Intensitäten variieren, das gleiche für alle Matrix-Elemente, wie in Abbildung 7ersichtlich. In Anbetracht der Zeitableitung GL. 1 ist ersichtlich, dass die Frequenzschwankungen nicht auf die Phase-Matrix, sondern nur auf das ursprüngliche Objekt Schwankungen abhängt:
, (2).
Wie die PD über mehrere Matrixelemente ausbreitet, im Durchschnitt die Peak-Standorte zu einem einheitlichen Frequenz-Profil. Einige Abweichungen zu erwarten und kann geben Aufschluss über die Orientierung des Wurms. Die Häufigkeitsverteilung wird als der Gang der Wurm Änderungen ändern. Das aktuelle Modell ist ein einfaches Modell, das nur für die Bewertung der Peak Standorten eher als relative Gipfel Höhen ermöglicht. Unterschiedliche lokomotorischen Muster werden auf verschiedene Gipfel Standorte im Durchschnitt.
Abbildung 1: Versuchsaufbau. Die low-Power Laser Beam Reisen durch die Graufilter spiegelt sich durch Spiegel M1 nach unten durch die Küvette mit der Wurm auf Spiegel M2 und fährt in Richtung der Photodiode. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Sequentielle Wurm Formen und entsprechenden Beugungsmuster. (ein) wählen Sie einige sequenzielle binäre Abbilder von modellierten W Form Nematoden und die (b) entsprechende sequentielle Beugungsmuster. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Experimentelle Probe Beugung Signaturen. Beugung Unterschriften für (eine) OH7547 "Roller" und (b) N2 Wildtyp C. Elegans mit einer einzigen Fotodiode in das Beugungsmuster. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Experimentelle gemittelt Leistungsspektren von Rollen- und Wildtyp Fraunhofer Beugung Serie. Die Spektren-Show präsentieren die Frequenzen in gemittelte Fourier-Transformation der Zeitreihe mit Photodiode aufgenommen. Eine Gaußsche Filter Standardabweichung dient zum Glätten von 0,075 Hz, bei 3 Standardabweichungen abgeschnitten. Beachten Sie die breite spektrale Peak bei ~1.5 Hz im geglätteten Walze Spektrum, im Vergleich mit dem multimodalen geglättete Wildtyp-Spektrum (einschließlich der Lastspitzen bei ~1.0 und 1.75 Hz). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5. Beugung Bildung Illustration. Beugungsmuster können durch denken jedes Liniensegment als einer verschwindend kleinen geraden Linie (links) modelliert werden. Überlagerung von diesen Linien (rechts) zeigt den Bau der Fernfeld Beugungsmuster erzeugt von einem C-förmigen Nematoden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6. Leistungsspektren von Rollen- und Wildtyp Fraunhofer Beugung Serie simuliert. (ein) C Form und (b) W Form Würmer mit der Fotodiode zentriert auf die Matrixelemente 200 (vertikal) und 175 (Horizontal). Die W-Form zeigt eine höhere Dichte der Frequenzen durch die komplexere Fortbewegung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7. Leistungsspektren von Rollen- und Wildtyp Fraunhofer Beugung Serie an verschiedenen Photodiode Standorten simuliert. (ein) W Form Wurm und Wurms (b), C-Form für einzelne Matrixelemente an verschiedenen Standorten, die Simulation von verschiedenen Orten der Fotodiode. Peak-Höhen variieren für verschiedene Standorte; Peak Orte bleiben jedoch für bestimmte Formen gleich. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Darunter erstreckt sich von Daten mit Inaktivität wird die Ergebnisse verzerren, da künstliche niedrigere Frequenzen in die Ergebnisse gemittelt werden. Die Photodiode Sättigung erkennt man an flachen Spitzen oder "abgeschnitten" Gipfeln in den Rohdaten. Teilung jeder Rohdatensatz durch Peak Intensitäten helfen bei Bilanzierung von Schwankungen in der Laserintensität.
Die Peak-Frequenzen sind ein Indikator für die allgemeine Prügel Frequenz; Allerdings komplizierte Bewegung verursacht Störungen bei beat Frequenzen in das Beugungsmuster und müssen sorgfältig geprüft werden.
Diese Methode kann verwendet werden, um die Fortbewegung der anderen Nematoden zu untersuchen. Die Umwelt kann auf ein anderes Medium geändert werden. Wellenlängen können auch geändert werden. Arbeiten im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums ist die einfachste und sicherste.
Eine verfeinerte Modell simuliert die Beugung Spektren realistischer in die Zukunft. Ein Zukunftsmodell gehören einen Wurm, der Orientierungen, ändern die Frequenz Standorte aber relative Gipfel Höhen nicht beeinträchtigen würde. Ein realistischeres Modell würde eine probabilistische Verteilung der Prügel Frequenzen ermöglichen die die Gipfeln wie in den experimentellen Daten erweitern würde. Eine Ausbreitung in Frequenzen würden Variationen in Tracht Prügel Frequenzen ausmachen.
Die aktuelle Wurm-Form ist grob, vor allem in den Kopf und Schweif Region, die mehr als im aktuellen Modell verjüngt werden sollte. Es kann interessant sein, eine detaillierte Analyse der Zeitreihen des Signals zu führen, da es Hinweise auf die Komplexität der Fortbewegung in verschiedenen Mutanten geben könnte.
Es lohnt sich, die Praktikabilität der Erweiterung dieser Technik in mehreren Nematoden gleichzeitig Charakterisierung. Diese Methode sollte als ergänzende Methode zur bestehenden Methoden mit traditionellen Mikroskope verstanden werden. Diese Methode hat einen Vorteil in ein Mikroskop nicht während der Datenerfassung erfordern, so dass der Wurm aus der Brennebene bewegen kann. Die gemittelten Frequenz-Spektren zeigen deutliche Unterschiede in der Wurm Bewegung und von den vorherrschenden Frequenz Gipfeln quantifiziert werden können ist eine neuartige Methode bei der Quantifizierung Wurm Fortbewegung. Datenanalyse der Beugung Signaturen ist bei der Weiterentwicklung und wird hoffentlich zu einer automatisierten Identifikationsprozess mehrere Mutanten und Einzelpersonen führen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Juan Vasquez für seine rechnerische Beiträge mit diesem Projekt. Wir sind dankbar für die Unterstützung der Vassar College Undergraduate Research Summer Institute (URSI), Lucy Maynard Lachs Research Fund und der NSF Award Nr. 1058385.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tunable Helium-Neon laser | Research Electro-Optics | 30602 | Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm. |
| 2 Front Surface Aluminum Mirrors | Thorlabs | PF10-03-F01 | |
| Photodiode: SI Amplified Detector | Thorlabs | PDA 100A | |
| Quartz Cuvette | Starna Cells | 21/G/5 | Plastic cells may be used as well. |
| MatLab (Software) | MathWorks | R2016b (9.1.0.441655) | Use the fft command to simulate diffraction |
| Excel | Microsoft | 14.7.1 | Used for data analysis of Figure 4 |
| Caenorhabditis elegans Roller | University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC) | Strain: OH7547 Genotype: otIs199. |
https://cbs.umn.edu/cgc/home |
| Caenorhabditis elegans Wild Type | University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC) | Strain:N2 Genotype: C. elegans wild isolate | https://cbs.umn.edu/cgc/home |
References
- Magnes, J., et al. Analysis of Freely Swimming C. elegans Using Laser Diffraction. Open J. Biophys. 2, 101-107 (2012).
- Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Eells, R. Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction. J. Vis. Exp. (68), (2012).
- James, J. F. A Student's Guide to Fourier Transforms with Applications in Physics and Engineering. , Cambridge University Press. Cambridge. (1995).
- Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans. J. Exp. Biol. 210, (2007).
- Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology. Arch. Biochem. Biophys. 602, 32-47 (2016).
- Thibault, P., Rankenburg, I. C. Optical diffraction microscopy in a teaching laboratory. Amer. J. Phys. 75 (9), 827-832 (2007).
- Miao, J., Ishikawa, T., Anderson, E. H., Hodgson, K. O. Phase retrieval of diffraction patterns from non crystalline samples using the oversampling method. Phys. Rev. B. 67, 174104 (2003).
- Zhang, Y. P., Zhang, J. Q., Xu, W. Method for eliminating zero-order diffraction in lensless Fourier transform digital holography. Optik - International Journal for Light and Electron Optics. 124 (21), 4873-4875 (2013).
- Brody, A. H., Chou, E., Gray, J. M., Pokrywka, N. J., Raley-Susman, K. M. Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration. NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).
- Stiernagle, T. The C. elegans Research Community. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Dasalukunte, D., Öwall, V., Rusek, F., Anderson, J. B. Faster than Nyquist Signaling. Algorithms to Silicon. , Springer International Publishing. Switzerland. (2014).
- Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6 (8), e198 (2008).
- Bilbao, A., Wajnryb, E., Vanapalli, S. A., Blawzdziewicz, J. Nematode Locomotion in Confined and Unconfined Fluids. Phys. Fluids. 25, 081902 (2013).
