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Engineering

सजीव Caenorhabditis एलिगेंस का रूपान्तर-आधारित विवर्तन विश्लेषण

Published: September 13, 2017 doi: 10.3791/56154
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1, 1
1Physics and Astronomy Department, Vassar College, 2Division of Science, Mathematics and Computing, Bard College at Simon's Rock, 3Biology Department, Vassar College

Summary

इस पांडुलिपि का वर्णन कैसे अलग सूत्रकृमि दूर क्षेत्र विवर्तन हस्ताक्षर का उपयोग कर भेद । हम १३९ जंगली प्रकार के गतिवान की तुलना और १०८ "रोलर" सी. एलिगेंस एक निरंतर तरंग लेजर का उपयोग कर एक ही स्थान पर लौकिक Fraunhofer विवर्तन हस्ताक्षर के साथ जुड़े आवृत्तियों औसत से ।

Abstract

इस पांडुलिपि का वर्णन कैसे लौकिक दूर क्षेत्र विवर्तन हस्ताक्षर का उपयोग सूत्रकृमि वर्गीकृत करने के लिए । एक एकल C. एलिगेंस एक ऑप्टिकल cuvette के अंदर एक पानी के स्तंभ में निलंबित कर दिया है । एक ६३२ एनएम निरंतर तरंग HeNe लेजर cuvette सामने सतह दर्पण का उपयोग कर के माध्यम से निर्देशित है । cuvette के माध्यम से प्रकाश से गुजरता है के बाद कम 20-30 सेमी कूच की एक महत्वपूर्ण दूरी एक उपयोगी सुदूर क्षेत्र (Fraunhofer) विवर्तन पैटर्न सुनिश्चित करता है । विवर्तन पैटर्न वास्तविक समय में परिवर्तन के रूप में निमेटोड लेजर बीम के भीतर तैरती है । photodiode ऑफ सेंटर विवर्तन पैटर्न में रखा गया है । photodiode से वोल्टेज संकेत वास्तविक समय में मनाया जाता है और एक डिजिटल आस्टसीलस्कप का उपयोग कर दर्ज की गई । इस प्रक्रिया १३९ जंगली प्रकार और १०८ "रोलर" सी. एलिगेंसके लिए दोहराया है । जंगली प्रकार के कीड़े समाधान में एक तेजी से दोलन पैटर्न का प्रदर्शन । "रोलर" कीड़े छल्ली के एक प्रमुख घटक है कि चिकनी गतिवान के साथ हस्तक्षेप में एक उत्परिवर्तन है । समय अंतराल है कि संतृप्ति और निष्क्रियता से मुक्त नहीं कर रहे है छोड़ दिया जाता है । यह अपनी अधिकतम द्वारा प्रत्येक औसत विभाजित करने के लिए सापेक्ष तीव्रता की तुलना व्यावहारिक है । प्रत्येक कृमि के लिए संकेत रूपान्तर इतना तब्दील हो जाता है कि प्रत्येक कृमि के लिए बारंबारता स्वरूप उभर आता है. कृमि के प्रत्येक प्रकार के लिए संकेत औसत है । जंगली प्रकार के लिए औसत रूपान्तर स्पेक्ट्रा और "रोलर" C. एलिगेंस साफ़ अलग है और पता चलता है कि दो अलग कृमि उपभेदों के गतिशील कीड़ा आकार रूपान्तर विश्लेषण का उपयोग कर प्रतिष्ठित किया जा सकता है । प्रत्येक कृमि तनाव का रूपान्तर स्पेक्ट्रा locomotory क्षणों के लिए संगत दो भिन्न बाइनरी वर्म आकृतियों का उपयोग करते हुए अनुमानित मॉडल से मेल खाता है । वास्तविक और मॉडलिंग की कीड़ों के लिए औसत आवृत्ति वितरण के लिफाफे की पुष्टि करता है मॉडल डेटा से मेल खाता है । इस विधि कई सूक्ष्म प्रजातियों के लिए रूपान्तर विश्लेषण के लिए एक आधार रेखा के रूप में सेवा कर सकते हैं, के रूप में हर सूक्ष्मजीवों अपने अद्वितीय रूपान्तर स्पेक्ट्रम होगा ।

Introduction

इस विधि की तुलना प्रयोगात्मक और मॉडलिंग की आवृत्ति स्पेक्ट्रा गतिवान के C. एलिगेंस बहुत अलग locomotory पैटर्न के साथ दो उपभेदों का उपयोग कर । परिणाम बताते है कि आवृत्ति स्पेक्ट्रम लौकिक परिवर्तन पर निर्भर करता है के रूप में निमेटोड एक पानी के कॉलम में तैरती है ताकि स्पष्ट सूक्ष्म छवियों के विश्लेषण के लिए आवश्यक नहीं हैं । इस विधि मात्रात्मक वास्तविक समय विश्लेषण के लिए अनुमति देता है और छवियों के लिए पूरक जानकारी प्रदान करता है/ Fraunhofer विवर्तन, भी सुदूर क्षेत्र विवर्तन कहा जाता है, जीना विवर्तन डेटा1,2प्राप्त करने के लिए आधार प्रदान करता है । विवर्तन पैटर्न में किसी भी एक बिंदु पर प्रकाश की तीव्रता निमेटोड3की रूपरेखा में हर बिंदु से superimposing प्रकाश का परिणाम है । नतीजतन, समय के साथ एकत्र प्रकाश तीव्रता निमेटोड के गतिवान के बारे में जानकारी वहन करती है । समय पर निर्भर विवर्तन संकेत विश्लेषण सभी गतिवान में शामिल आवृत्तियों का विश्लेषण के बाद से इसी उत्परिवर्ती की विशेषता गति की पहचान कर सकते है पारंपरिक वीडियो विश्लेषण पूरक । इस मामले में, "रोलर" और जंगली प्रकार के गतिवान के बीच विशेषता अंतर C. एलिगेंस निमेटोड के दो अलग उपभेदों की आवृत्ति स्पेक्ट्रा तुलना करके पुष्टि कर रहे हैं ।

कुछ पिछले विशेषताओं ऐसे तैराकी आवृत्तियों2,4के रूप में विवर्तन संकेतों की आवृत्ति विश्लेषण का उपयोग कर पुष्टि की गई है । इससे भी महत्वपूर्ण बात, इस विधि पारंपरिक माइक्रोस्कोपी के लिए एक पूरक विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है एक कंप्यूटर स्क्रीन पर वास्तविक समय में गतिवान निरीक्षण के रूप में डेटा एकत्र किया जा रहा है । अलग locomotory पैटर्न के साथ कीड़े की आवृत्ति स्पेक्ट्रम विवर्तन संकेत के रूपान्तर रूपांतरित संकेत पर विचार करके मात्रा जा सकता है ।

इस कार्य में रूपान्तर आधारित विवर्तन का multidisciplinary प्रकृति जीव विज्ञान एवं भौतिकी का क्षेत्र शामिल है । नमूना के तहत द्वारा विवर्तन लंबे समय से जीव विज्ञान में क्रिस्टल संरचनाओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है5 और अंय क्षेत्रों । इस प्रयोग में, तथापि,6नमूना,7 दूर क्षेत्र विवर्तन पैटर्न बनाता है ताकि जीव लेजर बीम में केंद्रित है । नमूना आमतौर पर लेंस कम इमेजिंग8 के लिए एक चरण पुनर्प्राप्ति एल्गोरिथ्म जो मूल ऑब्जेक्ट की एक छवि reconstructs के साथ संयोजन के रूप में उपयोग किया जाता है । चरण है़ जब कैटरर्स मौजूद हों तब हासिल करना मुश्किल है जैसा कि एक निमेटोड के साथ मामला है. लौकिक विवर्तन हस्ताक्षर कीड़ा गति की कुंजी आवृत्तियों का मूल्यांकन करने के लिए पर्याप्त है । इस विधि कम अभिकलनी चुंगी है और गतिवान यों को एक ऑप्टिकल तरीका प्रदान करता है । इस तकनीक को आसानी से उत्परिवर्तनों या पर्यावरण की स्थिति है कि व्यवहार में परिवर्तन के विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Protocol

< p class = "jove_title" > 1. C. एलिगेंस ग्रोथ और मेंटेनेंस

  1. निमेटोड कल्चरल डिश तैयार करते हैं ।
    1. एक आगर समाधान के साथ पेट्री व्यंजन भरें और उन्हें जमना के लिए छोड़ दें, तो एक ई. कोलाई संस्कृति के साथ बीज OP50 तनाव < सुप वर्ग = "xref" > 9 , < सुप वर्ग = "xref" > १० .
  2. प्रत्येक प्लेट पर वयस्क सूत्रकृमि की एक प्रारंभिक जनसंख्या ताजा आगर-एक पेट्री ई. कोलाई पैच के साथ व्यंजन भर के लिए कई वयस्क कीड़े ले जाने से तैयार । निमेटोड संस्कृतियों को बनाए रखना 20 & #176; सी में एक मशीन ।
    नोट: निमेटोड उपभेदों Caenorhabditis एलिगेंस जीनोम केंद्र से प्राप्त किया जा सकता है । इस अध्ययन के लिए, जंगली प्रकार, N2, तनाव और OH7547 (otls199 [बिल्ली-2:: GFP + rgel-1 (f25b 3.3)::d sred + rol-6 (su1006)]) तनाव, जो एक रोलर phenotype प्रदर्शित करता है, का उपयोग किया गया ।
  3. भविष्य की संस्कृतियों के लिए कीड़े का प्रचार ।
    1. सी. एलिगेंस और तापमान नियंत्रित मशीन से एक अप्रयुक्त निवास पेट्री पकवान युक्त पेट्री पकवान निकालें । उंहें एक विदारक माइक्रोस्कोप के मंच पर रखें ।
    2. प्रकाश Bunsen बर्नर और जब तक यह लाल चमकता है लौ में धातु रखकर प्लैटिनम निमेटोड उठाओ निष्फल । लेने के कमरे के तापमान को शांत करने की अनुमति दें । सेट नीचे उठाओ या नहीं लेने के लिए दूषित पदार्थों के साथ संपर्क में आते हैं ।
    3. धीरे बैक्टीरिया के सर्कल के किनारे करने के लिए लेने की नोक को छूने । इस पदार्थ चिपचिपा है और व्यक्तिगत वयस्क सूत्रकृमि आसान उठा कर देगा ।
    4. अंतरण तक 4 gravid सूत्रकृमि को एक निमेटोड वृद्धि मध्यम (NGM) आगार-भर पेट्री थाली और गर्मी में 20 & #176; ग. कीड़े अंडे कि चार दिनों में परिपक्व होगा करना होगा ।
    5. चार वयस्क सूत्रकृमि.
      6. ले जाने के बाद मशीन के लिए शेष सूत्रकृमि वापस
< p class = "jove_title" > 2. ऑप्टिकल सेटअप (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा १ )

  1. ऑप्टिकल कार्यक्षेत्र के पीछे-बाएं कोने के पास हीलियम-नियॉन लेजर सुरक्षित और एक शक्ति के स्रोत से कनेक्ट ।
    नोट: लेजर & #39; s बीम को अधिक से अधिक नमूने के लिए आवश्यकताओं को पूरा करना होगा । C. एलिगेंस लगभग 1 मिमी लंबे होते हैं, इसलिए लेजर बीम एक व्यास से अधिक 2 मिमी होना चाहिए, जबकि निमेटोड पर घटना है, लेकिन 5 मिमी से बड़ा नहीं है कि विवर्तन पैटर्न का पता लगाने के लिए मुश्किल नहीं है.
  2. जगह हीलियम-नियॉन लेजर और नमूना है कि लेजर बीम नमूना तक पहुंचने से पहले फिल्टर के माध्यम से यात्रा के बीच एक तटस्थ घनत्व फिल्टर ।
  3. दो सामने सतह एल्यूमीनियम स्टीयरिंग दर्पण का उपयोग कर, तटस्थ घनत्व फिल्टर के बाद पहला दर्पण हासिल करके एक पेरिस्कोप का निर्माण । दूसरे दर्पण के बारे में 10 सेमी पहले दर्पण नीचे सुरक्षित करने के लिए लेजर बीम चलाने और दर्पण के बीच cuvette डालने के कमरे दे । लेजर बीम और cuvette इतना है कि लेजर बीम cuvette के माध्यम से खड़ी यात्रा संरेखित करें ।
    नोट: diffracting जीव से photodiode के लिए दूरी बहुत जीव खुद को दूर क्षेत्र विवर्तन प्राप्त करने से बड़ा होना चाहिए । इस प्रयोग में cuvette से photodiode तक की दूरी 20 सें. मी.
  4. photodiode सीधे अपने दर्पण का सामना करना पड़ संवेदक के साथ दूसरे दर्पण से भर में सुरक्षित ।
    नोट: निमेटोड युक्त cuvette दो रसायन clamps का उपयोग दर्पण के बीच रखा जाएगा । अनुभाग 4 और 5 देखें.
  5. जगह पर एक पानी भरा cuvette खड़ा हो जाए. स्टैंड की ऊंचाई समायोजित करें । ऊंचाई और दर्पण 1 और 2 दर्पण के कोण को समायोजित करें ताकि लेजर बीम photodiode.
    6. पर नहीं बल्कि सीधे निकट के उद्देश्य से cuvette के माध्यम से यात्रा
  6. cuvette के लिए एक स्तरित सतह के रूप में खड़ा सुनिश्चित करने के लिए एक स्तर का उपयोग करें । यदि आवश्यक हो तो दर्पण को समायोजित करें ।
  7. डिजिटल आस्टसीलस्कप के साथ उपलब्ध कराई गई USB केबल का उपयोग करके photodiode को डिजीटल आस्टसीलस्कप से कनेक्ट करें । डिजिटल आस्टसीलस्कप को उस कंप्यूटर से कनेक्ट करें जिसका उपयोग डेटा को रिकॉर्ड करने और सहेजने के लिए किया जाएगा ।
< p class = "jove_title" > 3. आस्टसीलस्कप सेटअप

  1. कंप्यूटर पर आस्टसीलस्कप के लिए सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते हुए, पर्याप्त रूप से कीड़ा के पिटाई चक्र को हल करने के लिए न्यूनतम 8 हर्ट्ज के लिए नमूना दर निर्धारित.
    नोट: नमूना दर दो बार की तुलना में अधिक होना चाहिए कि की उंमीद पिटाई आवृत्तियों प्रजातियों में से इतना है कि Nyquist प्रमेय < सुप वर्ग = "xref" > ११ समाधानकारक आहे.
< p class = "jove_title" > 4. डेटा संग्रह के लिए वर्म और Cuvette की तैयारी करना

  1. चार वयस्क सूत्रकृमि एक ताजा NGM < सुप वर्ग = "xref" > १० आगार-पेट्री प्लेट भरा एक पतली, चपटा प्लैटिनम तार लेने का उपयोग (१.३ अनुभाग देखें) ।
  2. अपने पैकेज से एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक cuvette को दूर करने के लिए केवल अपनी मेड़ पक्षों पर cuvette को छूने के लिए सावधान किया जा रहा है ।
  3. एक micropipette का उपयोग करने के लिए cuvette में आसुत जल पिपेट जब तक cuvette लगभग ८० आसुत जल से भरा% है ।
    नोट: यह केवल आसुत जल या जैसे M9 < सुप वर्ग का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है = "xref" > 10 या फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पंजाब) जब सूत्रकृमि हैंडलिंग, के रूप में नल का पानी सूक्ष्मजीवों-हत्या यौगिकों शामिल हैं ।
  4. जगह सी. एलिगेंस युक्त पेट्री डिश को एक विदारक गुंजाइश के तहत इस्तेमाल किया जाए.
  5. प्लेटिनम लेने का उपयोग कर, पेट्री पकवान से एक परिपक्व सी एलिगेंस हटाने और cuvette में उठाओ जलमग्न, हलकों में लेने के लिए यदि आवश्यक हो तो निमेटोड को उखाड़ फेंक ।
  6. cuvette में बनाने बुलबुले को रोकने के लिए, पानी के साथ cuvette भर जब तक यह थोड़ा उभार पर cuvette & #39; एस शीर्ष । cuvette & #39 भरें; एस टोपी पूरी तरह से पानी के साथ तो जल्दी से cuvette पर टोपी डाल दिया.
  7. एक ऑप्टिकल सफाई कपड़े का उपयोग करने के लिए पानी की बूंदों कि खत्म हो सकता है और ऑप्टिकल सफाई कागज किसी भी छोटे शेष बूंदों को साफ हटाने के लिए ।
< p class = "jove_title" > 5. वास्तविक समय डेटा-विवर्तन पैटर्न तीव्रता परिवर्तन के अधिग्रहण

  1. हीलियम-नियॉन लेजर पर बारी और यह एक लाल बीम का उत्पादन इतना है कि आवृत्ति/रंग सेटिंग समायोजित करें । सेंसर चालू करें.
    सावधानी: ६३२ एनएम पर एक कम ऊर्जा बीम का प्रयोग करें, सी के रूप में एलिगेंस उच्च आवृत्ति से बचने (नीला) प्रकाश < सुप वर्ग = "xref" > १२ .
  2. cuvette में कीड़ा पता लगाएँ । अपनी मेड़ पक्षों पर cuvette होल्डिंग, धीरे निमेटोड जब तक cuvette झुकाव cuvette के हिस्से के केंद्र में लगभग है ।
    नोट: झटकों या cuvette हिंसक झुकाव cuvette की दीवारों के साथ टकराने के लिए कीड़ा का कारण बनता है । इससे निमेटोड को नुकसान पहुंच सकता है ।
    1. ऑप्टिकल सिस्टम में स्टैंड पर cuvette जगह, लेजर & #39 के भीतर कीड़ा केंद्र; s बीम दर्पण 1 से प्रतिबिंबित 2 । आवारा रोशनी को खत्म करना सुनिश्चित करें ।
  3. सेंटर लेजर बीम में कीड़ा ।
    1. photodiode को विवर्तन पैटर्न में रखें ताकि photodiode के स्थान और मध्य अधिकतम विवर्तन पैटर्न का मेल न हो.
    2. photodiode के संतृप्ति को रोकने के लिए तटस्थ घनत्व फिल्टर समायोजित करें । तटस्थ घनत्व फिल्टर पहिया घूर्णन प्रकाश तीव्रता को नियंत्रित करता है ।
      1. photodiode बढ़ जाती है से वोल्टेज उत्पादन इतना है कि तटस्थ घनत्व फिल्टर घुमाएँ.
        नोट: वोल्टेज उत्पादन डिजिटल photodiode के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मनाया जाता है । photodiode अगर वोल्टेज नहीं बदलता है संतृप्त है । उस मामले में, जब तक वोल्टेज एक न्यूनतम पढ़ने में समतल बिना कम कर देता है तटस्थ घनत्व फिल्टर घुमाएँ. सुनिश्चित करें कि वोल्टेज संकेत पीक रीडिंग में समतल नहीं है, photodiode के संतृप्ति का संकेत है । अगर संतृप्ति मनाया जाता है तटस्थ घनत्व फिल्टर पहिया घूर्णन द्वारा प्रकाश की तीव्रता को कम करें ।
    3. एक बार चलायमान विवर्तन प्रतिमान दृश्यमान होने पर, photodiode को नियंत्रित करने वाले सॉफ़्टवेयर पर प्रारंभ बटन क्लिक करके, वर्म & #39; s पर निगरानी रखते हुए डेटा एकत्रित करें । कीड़ा लेजर बीम और diffrac से बाहर ले जाता है जब तक माप ले जारी रखेंtion पैटर्न गायब हो जाता है, जो आमतौर पर लगभग 20 एस लेता है ।
      1. आस्टसीलस्कप के लिए सॉफ़्टवेयर पर रोकें बटन क्लिक करके डेटा एकत्रित करने की प्रक्रिया बंद करें । प्रत्येक परीक्षण सहेजें & #39; s डेटा. csv या. txt स्वरूप में.
  4. चरण ५.२-५.३ दोहराएं जब तक कि कम से ५० डेटा सेट प्रत्येक phenotype के लिए संग्रहीत किया गया है । प्रति ट्रायल आठ से दस पशुओं का प्रयोग करें ।
  5. cuvette यह और कीड़ा के निपटान खरोंच है, और चरण 4 दोहराएँ. यदि कीड़ा हस्तांतरण में नुकसान पहुंचा है, यह के निपटान और आसुत पानी के साथ cuvette कुल्ला से पहले दोहरा चरण 4 एक ही cuvette का उपयोग कर ।
  6. दोहराएँ चरण 5 का उपयोग करते हुए OH7547 & #34; रोलर & #34; तनाव, कीड़ा तनाव इंगित करने के लिए डेटा लेबल करने के लिए सावधान किया जा रहा.
< p class = "jove_title" > 6. डेटा का रूपान्तर स्पेक्ट्रम

  1. किसी डेटा विश्लेषण प्रोग्राम में प्राप्त किए गए डेटा को आयात करना असतत रूपान्तर का निष्पादन करने में सक्षम < सुप वर्ग = "xref" > 3 .
  2. प्रदर्शन रूपान्तर प्रत्येक डेटा सेट पर तेजी से रूपान्तर रूपांतरण (FFT) विकल्प का उपयोग कर परिवर्तित करें सॉफ़्टवेयर ।
  3. औसत आवृत्तियों N2 जंगली प्रकार के कीड़े के लिए प्रत्येक आयाम के लिए FFT परिणामों से.
  4. दोहराएँ चरण ६.३ से FFTs का उपयोग कर OH7547 & #34; रोलर & #34; वर्म्स.
< p class = "jove_title" > 7. रूपान्तर स्पेक्ट्रम की मॉडलिंग

  1. कार्यक्रम निमेटोड गतिवान का एक बाइनरी मॉडल (देखें कार्यक्रम पूरक सामग्री में शामिल).
    नोट: यह मॉडल पहली बार कीड़ा गति के प्रमुख विशेषताओं को प्रदर्शित करता है, जो एक मोटा सन्निकटन है. मॉडल परिणाम वास्तविक कीड़े के साथ तुलना कर रहे है के रूप में परिष्कृत किया जा सकता है । वर्म आकृतियाँ माइक्रोस्कोप छवियों का उपयोग करके सन्निकटन हैं < सुप क्लास = "xref" > १३ .
    1. बाइनरी मॉडल के अनुक्रमिक फ्रेम्स को कम से दो वर्मी चक्रों के माध्यम से बना रहा है (< मज़बूत वर्ग = "xfig" > फिगर 2a ). पूरक सामग्री में वीडियो देखें; C वर्म वीडियो (CWorm. avi) और W वर्म वीडियो (WWorm. avi).
  2. अनुक्रमिक विवर्तन पैटर्न का उत्पादन । पूरक सामग्री में वीडियो देखें । सी वर्म विवर्तन वीडियो (CWormDiff. avi) और W वर्म वीडियो (WWormDiff. avi) ।
    1. रूपान्तर वर्मी छवि के प्रत्येक बाइनरी फ़्रेम को रूपांतरित करता है । बड़ा कीड़ा चारों ओर फ्रेम के गद्दी, बेहतर विवर्तन छवि का संकल्प होगा ।
      नोट: प्रत्येक रूपान्तर रूपांतरित फ्रेम का निरपेक्ष मूल्य इसी विवर्तन पैटर्न (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा b ) के आनुपातिक है ।
    2. विवर्तन पैटर्न के विपरीत विवर्तन पैटर्न की तीव्रता एक लघुगणकीय पैमाने पर मानचित्रण द्वारा ट्यून ।
      नोट: कैमरों और आंखों के लिए एक गैर रेखीय पैमाने पर कार्य करते हैं । एक लघुगणक पैमाने अनुकरण कर सकते हैं कैसे एक विवर्तन पैटर्न आम तौर पर मानव आंख द्वारा माना जाता है.
  3. निकालने modeled विवर्तन संकेत ।
    1. विवर्तन प्रतिमान में photodiode के स्थान के संगत एक ऑफ़-सेंटर स्थान चुनें ।
    2. पड़ोसी मैट्रिक्स photodiode के स्थान के आसपास के तत्वों को जोड़ने के लिए photodiode के आकार अनुकरण । photodiode का आकार आमतौर पर modeled विवर्तन प्रतिमान का ०.१% है ।
    3. रिकॉर्ड और विवर्तन संकेतों की भयावहता के अनुक्रम की साजिश । जाँच करें कि संकेत शारीरिक रूप से उचित है ( यानी , आवधिक पिटाई के मामले में, photodiode से संकेत के रूप में अच्छी तरह से आवधिक किया जाना चाहिए).
  4. रूपान्तर ७.३ में प्राप्त विवर्तन संकेत रूपांतरण और प्रयोगात्मक डेटा के साथ परिणामों की तुलना.
  5. विभिन्न कीड़ा उपभेदों के लिए दोहराने और तुलना.

Representative Results

चित्रा 1 में दिखाया ऑप्टिकल प्रयोगात्मक सेटअप एक फोकल विमान से बंधा जा रहा बिना सूक्ष्मजीवों के अध्ययन के लिए अनुमति देता है । photodiode से पिटाई संकेत डेटा एकत्र किया जाता है के रूप में कंप्यूटर स्क्रीन पर वास्तविक समय में देखा जा सकता है । असामांय पैटर्न विस्तार में एक वीडियो का विश्लेषण करने के लिए बिना तुरंत दिखाई जाएगी ।

मॉडलिंग अनुक्रमिक कीड़ा आंदोलन और इसी विवर्तन पैटर्न के उदाहरण चित्रा 2में दिखाए जाते हैं । मॉडलिंग विवर्तन पैटर्न गुणात्मक प्रयोगात्मक पैटर्न1 समान है और एक प्रारंभिक संकेत है कि सिमुलेशन सफलतापूर्वक निमेटोड मॉडल हैं ।

C. एलिगेंस के दो प्रकार के एक नमूना लौकिक विवर्तन हस्ताक्षर यहां चित्रा 3में दिखाया गया है । यह गुणात्मक देखा जा सकता है कि प्रत्येक निमेटोड अलग दरों और आयाम पर पिटाई । कुछ मतभेद वक्र फिटिंग के माध्यम से मात्रा जा सकता है के रूप में एक पिछले प्रकाशन में किया गया था1। असतत रूपान्तर रूपांतरण, तथापि, और अधिक विवरण एंबेडेड आवृत्तियों के बारे में पता चलता है:

Equation 1, (१)

जहां fk डिजिटल रूपान्तर रूपांतर (FT) और fn है समय के साथ निर्भर कच्चे विवर्तन संकेत असतत समय चर n और असतत आवृत्ति चर के साथ है n की कुल संख्या है डेटा बिंदुओं । औसत डिजिटल रूपान्तर रूपांतरण निमेटोड अपने विवर्तन आवृत्ति स्पेक्ट्रम (चित्रा 4) के आयाम द्वारा पहचाना जा करने के लिए अनुमति देता है । जंगली प्रकार स्पेक्ट्रम रोलर गति स्पेक्ट्रम की तुलना में कम आवृत्तियों का प्रभुत्व है ।

एक मॉडल है कि रोलर सी एलिगेंस नोटों जंगली प्रकार बनाम एक wavelike (डब्ल्यू या एस आकार) गति (आंकड़ा 2a) में पिटाई करते हैं, जबकि रोलर एक पक्ष है कि मोटे तौर पर एक दोलन सी आकार जैसा दिखता है एहसान आदत है ( चित्रा 5) । यह अलग स्पेक्ट्रा के लिए कुछ विवरण प्रदान करता है । रोलर ज्यादातर एक तरफ एक सी फार्म का होगा, जबकि डब्ल्यू दोलन के रूप में दो का विरोध सी गति के बारे में सोचा जा सकता है । इस कारण से, डब्ल्यू गति और अधिक जटिल सी गति से अधिक माध्यमिक कम आवृत्तियों खुलासा है । इस परिणाम गणना मॉडल में पुष्टि की है । डब्ल्यू आकार सी आकार (चित्रा 6) की तुलना में एक बहुत अधिक आवृत्ति घनत्व है । यह चित्रा 4 में FFT में पुष्टि की है, जहां रोलर आवृत्तियों अधिक संकुल रहे हैं, जबकि पूरी तरह से असतत नहीं है । रोलर के आंकड़े टेढ़ा कर रहे है के बाद से रोलर जंगली प्रकार गतिवान अस्थाई रूप से वापस कर सकते हैं ।

रोलर प्रकार सी. एलिगेंस की चिकनी बिजली स्पेक्ट्रा ~ १.५ हर्ट्ज पर एक व्यापक चोटी से पता चलता है, जबकि तैराकी जंगली प्रकार सी एलिगेंस (१.० हर्ट्ज और १.७५ हर्ट्ज पर चोटियों सहित) एक multimodal स्पेक्ट्रम प्रदर्शित करता है. photodiode (पीडी) एक परिमित कई मैट्रिक्स तत्वों पर फैल आकार है । व्यक्तिगत मैट्रिक्स तत्वों या विवर्तन पैटर्न पर अंक तीव्रता में बदलती के बाद से रचनात्मक और विनाशकारी हस्तक्षेप बदलता है; फिर भी, आवृत्तियों जिस पर तीव्रता बदलती सभी मैट्रिक्स तत्वों के लिए एक ही हैं, के रूप में चित्रा 7में देखा जा सकता है । समय को देखते हुए व्युत्पंन Eq .1, यह देखा जा सकता है कि आवृत्ति उतार चढ़ाव चरण मैट्रिक्स पर निर्भर नहीं है, लेकिन केवल मूल वस्तु के उतार चढ़ाव पर:

Equation 2, (२)

के रूप में पीडी कई मैट्रिक्स तत्वों पर फैलता है, पीक स्थान एक सुसंगत आवृत्ति प्रोफ़ाइल के लिए औसत । कुछ भिंनता की उंमीद की जा सकती है और कीड़ा के उंमुखीकरण के बारे में सुराग दे सकते हैं । आवृत्ति वितरण वर्म परिवर्तन की चाल के रूप में बदल जाएगा । मौजूदा मॉडल एक सरल मॉडल है कि केवल चोटी के स्थानों के मूल्यांकन के बजाय रिश्तेदार पीक हाइट्स के लिए अनुमति देता है । अलग locomotory पैटर्न अलग पीक स्थानों के लिए औसत होगा ।

Figure 1
चित्र 1. प्रायोगिक सेटअप । कम शक्ति लेजर बीम तटस्थ घनत्व फिल्टर के माध्यम से यात्रा, दर्पण एम 1 द्वारा नीचे दर्पण M2 पर कीड़ा युक्त cuvette के माध्यम से परिलक्षित होता है, और photodiode की ओर यात्रा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. अनुक्रमिक वर्म आकृतियां और संगत विवर्तन प्रतिमान । (क) कुछ का चयन अनुक्रमिक बाइनरी छवियों के मॉडलिंग डब्ल्यू आकार सूत्रकृमि और (ख) इसी अनुक्रमिक विवर्तन पैटर्न । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. प्रायोगिक नमूना विवर्तन हस्ताक्षर । विवर्तन हस्ताक्षर के लिए एकत्र (एक) OH7547 "रोलर" और (ख) N2 वाइल्ड टाइप सी. एलिगेंस photodiode पैटर्न में एक एकल विवर्तन का उपयोग कर। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. रोलर और जंगली प्रकार Fraunhofer विवर्तन श्रृंखला के प्रायोगिक औसत पावर स्पेक्ट्रा । स्पेक्ट्रा photodiode के साथ रिकॉर्ड किए गए समय श्रृंखला के औसत रूपान्तर रूपांतर में उपस्थित आवृत्तियों को दिखाते हैं । मानक विचलन ०.०७५ हर्ट्ज के एक गाऊसी फिल्टर, 3 मानक कुटिलता पर काट दिया, चिकनी के लिए प्रयोग किया जाता है । व्यापक वर्णक्रमीय पीक पर ध्यान दें ~ १.५ हर्ट्ज चिकनी रोलर स्पेक्ट्रम में, multimodal चिकनी जंगली प्रकार स्पेक्ट्रम के साथ तुलना में (पर चोटियों सहित ~ १.० और 1. ७५ हर्ट्ज). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5. विवर्तन गठन चित्रण. विवर्तन पैटर्न एक infinitesimally छोटी सीधी रेखा (बाएं) के रूप में प्रत्येक पंक्ति खंड के बारे में सोच द्वारा मॉडलिंग की जा सकती है । Superimposing इन पंक्तियों (दाएं) दूर क्षेत्र विवर्तन एक सी आकार निमेटोड द्वारा उत्पंन पैटर्न के निर्माण को दर्शाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6. रोलर और जंगली प्रकार Fraunhofer विवर्तन श्रृंखला के अनुकरणीय बिजली स्पेक्ट्रा । (क) सी आकार और (ख) डब्ल्यू आकार के कीड़े मैट्रिक्स तत्वों २०० (ऊर्ध्वाधर) और १७५ (क्षैतिज) पर केंद्रित photodiode के साथ । डब्ल्यू आकार अधिक जटिल गतिवान के कारण आवृत्तियों की एक उच्च घनत्व से पता चलता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7. विभिन्न Photodiode स्थानों पर रोलर और जंगली प्रकार Fraunhofer विवर्तन श्रृंखला के अनुकरणीय बिजली स्पेक्ट्रा. (a) W आकृति वर्म और (b) photodiode के विभिन्न स्थानों का अनुकरण करने वाले विभिन्न स्थानों पर एकल मैट्रिक्स तत्वों के लिए सी आकार कृमि. पीक हाइट्स विभिंन स्थानों के लिए बदलती हैं; हालांकि, पीक स्थान विशिष्ट आकृतियों के लिए समान रहते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

निष्क्रियता के साथ डेटा के हिस्सों सहित कृत्रिम कम आवृत्तियों परिणामों में औसत हो जाएगा के बाद से परिणाम तिरछा होगा । photodiode संतृप्त फ्लैट चोटियों से पहचाना जा सकता है या "कच्चे डेटा में कटौती" चोटियों । पीक तीव्रता के द्वारा निर्धारित प्रत्येक कच्चे डेटा विभाजित करने से लेजर गहनता में उतार चढ़ाव के लिए लेखांकन के साथ मदद मिलेगी ।

पीक आवृत्तियों समग्र पिटाई आवृत्ति का एक संकेतक हैं; हालांकि, जटिल गति विवर्तन पैटर्न में हरा आवृत्तियों पर हस्तक्षेप का कारण बनता है और ध्यान से जांच की जानी चाहिए.

इस विधि से अन्य सूत्रकृमि के गतिवान की जांच की जा सकती है । पर्यावरण को दूसरे माध्यम से बदला जा सकता है । तरंग दैर्ध्य के रूप में अच्छी तरह से बदला जा सकता है । विद्युत चुम्बकीय स्पेक्ट्रम के दृश्यमान रेंज में काम करना सबसे आसान और सुरक्षित है.

एक अधिक परिष्कृत मॉडल विवर्तन स्पेक्ट्रा भविष्य में और अधिक वास्तविक अनुकरण होगा । भविष्य के मॉडल में एक कीड़ा शामिल हो सकता है जो ओरिएंटेशन को बदल सकता है, जो आवृत्ति स्थानों लेकिन सापेक्ष पीक ऊंचाइयों को प्रभावित नहीं करेगा । एक और अधिक यथार्थवादी मॉडल आवृत्तियों पिटाई, जो प्रयोगात्मक डेटा में के रूप में चोटियों को व्यापक होगा की एक संभाव्य वितरण के लिए अनुमति होगी । आवृत्तियों में एक प्रसार आवृत्तियों पिटाई में भिन्नता के लिए खाते में होगा.

वर्तमान कीड़ा आकार कच्चे तेल, विशेष रूप से सिर और पूंछ क्षेत्र है, जो वर्तमान मॉडल की तुलना में अधिक पतला होना चाहिए में है । यह संकेत के समय श्रृंखला का एक विस्तृत विश्लेषण आचरण दिलचस्प हो सकता है क्योंकि यह अलग म्यूटेंट में गतिवान की जटिलता के बारे में सुराग दे सकता है ।

यह निस्र्पक एकाधिक सूत्रकृमि एक साथ में इस तकनीक के विस्तार की व्यावहारिकता पर विचार करने लायक है । इस विधि पारंपरिक सूक्ष्मदर्शी का उपयोग कर मौजूदा तरीकों को एक पूरक विधि के रूप में समझा जाना चाहिए । इस विधि डेटा-अधिग्रहण के दौरान एक खुर्दबीन की जरूरत नहीं है ताकि कीड़ा फोकल विमान से बाहर स्थानांतरित कर सकते है में एक फायदा है । औसत आवृत्ति स्पेक्ट्रा कीड़ा गति में स्पष्ट मतभेद दिखाने के लिए और प्रचलित आवृत्ति चोटियों, जो कीड़ा गतिवान को बढ़ाता में एक उपंयास विधि है द्वारा मात्रा जा सकता है । विवर्तन हस्ताक्षर के डेटा विश्लेषण आगे विकास में है और उंमीद है कि कई म्यूटेंट और व्यक्तियों के एक स्वचालित पहचान प्रक्रिया को बढ़ावा मिलेगा ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम इस परियोजना के साथ अपने अभिकलनी योगदान के लिए जुआन Vasquez धंयवाद । हम Vassar कॉलेज के स्नातक अनुसंधान ग्रीष्मकालीन संस्थान (URSI), लुसी मेनार्ड सामन अनुसंधान कोष और NSF पुरस्कार नहीं १०५८३८५ के समर्थन के लिए आभारी हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tunable Helium-Neon laser Research Electro-Optics 30602 Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm.
2 Front Surface Aluminum Mirrors Thorlabs PF10-03-F01
Photodiode: SI Amplified Detector Thorlabs PDA 100A
Quartz Cuvette Starna Cells 21/G/5 Plastic cells may be used as well.
MatLab (Software) MathWorks R2016b (9.1.0.441655) Use the fft command to simulate diffraction
Excel Microsoft 14.7.1 Used for data analysis of Figure 4
Caenorhabditis elegans Roller University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC) Strain: OH7547
Genotype: otIs199.		 https://cbs.umn.edu/cgc/home
Caenorhabditis elegans Wild Type University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC) Strain:N2 Genotype: C. elegans wild isolate https://cbs.umn.edu/cgc/home

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References

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अभियांत्रिकी अंक १२७ C. एलिगेंस विवर्तन जटिल विश्लेषण निमेटोड गतिवान रूपान्तर रूपांतर रूपान्तर विश्लेषण Fraunhofer विवर्तन सुदूर क्षेत्र विवर्तन सूक्ष्मजीव
सजीव <em>Caenorhabditis एलिगेंस</em> का रूपान्तर-आधारित विवर्तन विश्लेषण
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Magnes, J., Hastings, H. M., Raley-Susman, K. M., Alivisatos, C., Warner, A., Hulsey-Vincent, M. Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (127), e56154, doi:10.3791/56154 (2017).

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