Fourier-baserade diffraktion analys av Live Caenorhabditis elegans

Summary

Detta manuskript beskriver hur att skilja olika nematoder använder långt-fältet diffraktion signaturer. Vi jämför förflyttningen av 139 vildtyp och 108 ”Roller” C. elegans av genomsnitt frekvenser som är kopplat till den tidsmässiga Fraunhofer diffraktion signaturen på en enda plats med hjälp av en kontinuerlig våg laser.

Abstract

Detta manuskript beskriver hur att klassificera nematoder använder temporal långt-fältet diffraktion signaturer. En enda C. elegans är upphängd i en vatten kolumn inuti en optisk kyvetten. 632 nm kontinuerlig våg HeNe laser dirigeras via den kyvetten med hjälp av främre ytan speglar. Ett betydande avstånd på minst 20-30 cm reste efter ljuset passerar genom kyvetten säkerställer ett användbart långt-fältet (Fraunhofer) diffraktionsmönster. Diffraktion mönster förändringarna i realtid som Nematoden simmar inom laserstrålen. Fotodioden placeras off-center i mönstret diffraktion. Spänning signalen från fotodioden observeras i realtid och registreras med en digital oscilloskop. Denna process upprepas för 139 vildtyp och 108 ”roller” C. elegans. Vildtyp maskar uppvisar en snabb svängning mönster i lösning. ”Roller” maskar har en mutation i en nyckelkomponent i nagelbanden som stör smidig förflyttning. Tidsintervall som inte är fria för mättnad och inaktivitet ignoreras. Det är praktiskt att dela upp varje genomsnittet av dess maximum att jämföra relativ intensitet. Signalen för varje mask är Fourier omvandlas så att frekvensmönstret för varje mask framträder. Signalen för varje typ av mask är i genomsnitt. I genomsnitt Fourier spektra för vilda typ och ”rullen” C. elegans är påtagligt annorlunda och avslöja att dynamisk mask formerna av de två olika mask-stammarna kan särskiljas med hjälp av Fourier-analys. Fourier spektra av varje mask stam matcha en ungefärlig modell med två olika binära mask former som motsvarar motoriskt stunder. Kuvertet av den i genomsnitt frekvensfördelningen för faktiska och modellerade maskar bekräftar modellen matchar data. Denna metod kan fungera som en baslinje för Fourier-analys för många mikroskopiska arter, eftersom varje mikroorganism måste dess unika Fourier-spektrum.

Introduction

Denna metod mäter med experimentella och modellerade frekvensdiagram för en förflyttning av C. elegans med två stammar med mycket olika motoriskt mönster. Resultaten visar att frekvensspektrum beror på tidsmässiga förändringar som Nematoden simmar i en vattenpelare så att tydliga mikroskopiska bilder inte behövs för analys. Denna metod möjliggör kvantitativa analys i realtid och ger kompletterande information till bilder/video erhålls med traditionella Mikroskop. Fraunhofer diffraktion, även kallad långt-fältet diffraktion, grunden för att få levande diffraktion data^1,2. Ljusintensiteten på någon enda punkt i mönstret diffraktion är resultatet av överlagras ljus från varje punkt i dispositionen av nematoder³. Som ett resultat, bär ljusintensiteten samlat in över tiden information om förflyttningen av Nematoden. Analysera den tidsberoende diffraktion signalen kan identifiera den karakteristiska motion motsvarande muterade eftersom analysera alla frekvenserna som är inblandade i locomotion kompletterar de traditionella videoanalys. I det här fallet bekräftas de karakteristiska skillnaderna mellan locomotion ”rullen” och vilda typ C. elegans genom att jämföra frekvens spektra av de två olika stammarna av Nematoden.

Några tidigare egenskaper har bekräftats med hjälp av frekvensanalys av diffraktion signaler såsom simning frekvenser^2,4. Viktigare, kan denna metod användas som en kompletterande metod för att traditionella mikroskopi för att följa förflyttning i realtid på en datorskärm som data samlas in. Frekvensspektret av maskar med distinkta motoriskt mönster kan kvantifieras genom att betrakta Fourier omvandlas signal av diffraktion signalen.

Den tvärvetenskapliga karaktären av Fourier-baserade diffraktion i detta arbete innefattar områdena biologi och fysik. Diffraktion av under provtagning har länge använts för att undersöka kristallen strukturerar i biologi⁵ och andra områden. I detta experiment skapar översampling^6,7 dock det lång-fältet diffraktion mönstret så att organismen är centrerad i laserstrålen. Översampling används vanligtvis för lins-mindre imaging⁸ i samband med en fas hämtning algoritm som rekonstruerar en bild av det ursprungliga objektet. Fas hämtning är svårt att uppnå när scatterers är närvarande som är fallet med en nematod. Temporal diffraktion signaturen är tillräckligt för att utvärdera viktiga frekvenser av förslaget mask. Denna metod är mindre beräkningsmässigt beskatta och ger en optisk sätt att kvantifiera locomotion. Denna teknik kan lätt anpassas för analys av mutationer eller miljöförhållanden som förändrar beteende.

Protocol

1. C. elegans tillväxt och underhåll

1. Förbered nematoder kultur rätter.
   1. Fylla i petriskålar med en agar-lösning och låt dem stelna, då utsäde med en E. coli kultur OP50 stam ^{9 , 10}.
2. Förbereda vuxen nematoder på varje platta börjar invånare genom att flytta flera vuxna maskar till färska agar-fyllda petriskålar med en E. coli-lapp. Upprätthålla de nematoder kulturerna vid 20 ° C i en inkubator.
   Obs: Nematoder stammar kan erhållas från stadens Caenorhabditis elegans genomet. För denna studie, den vilda typen, N2, stam och OH7547 (otls199 [cat-2::GFP + rgel-1 (F25B3.3):: dsRed + rol-6(su1006)]) stam, som uppvisar en rulle fenotyp, utnyttjades.
3. Sprida maskar för framtida kulturer.
   1. Ta bort Petri maträtt som innehåller C. elegans och en oanvänd livsmiljö petriskål från tempererade inkubatorn. Placera dem på scenen av dissekera Mikroskop.
   2. Ljus bunsenbrännare och sterilisera den platina nematoder plocka genom att placera metallen i lågan tills det lyser rött. Att plocka svalna till rumstemperatur. Installera inte plocka eller låt den plocka komma i kontakt med föroreningar.
   3. Försiktigt på spetsen av uppgången till kanten av cirkla av bakterier. Detta ämne är klibbig och kommer att göra plocka enskilda vuxna nematoder lättare.
   4. Överföra upp till 4 dräktig nematoder till en nematod tillväxt Medium (NGM) agar-fyllda Petri tallrik och inkubera vid 20 ° C. Maskarna lägger ägg som kommer att mogna i fyra dagar.
   5. Tillbaka de återstående nematoder till inkubatorn efter att ha flyttat fyra vuxna nematoder.

2. Optiska Setup ( figur 1)

1. Secure helium-neon laser nära tillbaka vänstra hörn optiska arbetsbänken och Anslut den till en strömkälla.
   Obs: Laser ' s beam måste uppfylla kraven för översampling. I C. elegans är ca 1 mm lång, laserstrålen bör därför ha en diameter som är större än 2 mm medan incident på Nematoden, men inte större än 5 mm så att diffraktionsmönster inte är svårt att hitta.
2. Placera en neutral densitet filter mellan helium-neon laser och provet så att laserstrålen färdas genom filtret innan den når provet.
3. Använda två främre yta aluminium styrning speglar, bygga en periscope genom att säkra första spegeln sedan neutral densitet filter. Säkra andra spegeln ca 10 cm nedanför första spegeln för att ge utrymme att styra laserstrålen och infoga kyvetten mellan speglarna. Justera laserstrålen och kyvetten så att laserstrålen färdas vertikalt genom kyvetten.
   Obs: Avståndet från diffracting organismen till fotodioden måste vara mycket större än organismen själv att uppnå långt-fältet diffraktion. I detta experiment, avståndet från kyvetten till fotodioden är 20 cm.
4. Säkra fotodioden mittemot andra spegeln sensor inför spegeln.
   Obs: Den kyvetten som innehåller Nematoden placeras mellan de två speglarna med kemi klämmor. Se avsnitt 4 och 5.
5. Placera en vattenfylld kyvetten på stativet. Justera höjden på stativet. Justera höjder och vinklar av spegel 1 och spegel 2 så att laserstrålen färdas genom den kyvetten vänder sig nära men inte direkt på fotodioden.
6. Använd ett vattenpass så att formuläret står en planat yta för kyvetten. Justera speglarna ytterligare vid behov.
7. Anslut fotodioden till den digitala oscilloskop USB-kabel medföljer det digitala oscilloskopet. Anslut det digitala oscilloskopet till den dator som används för att spela in och spara data.

3. Oscilloskop Setup

1. att använda programvaran för oscilloskopet på datorn, ange samplingsfrekvensen till minst 8 Hz till lösa thrashing cykeln av masken tillräckligt.
   Obs: Samplingsfrekvens bör vara mer än dubbelt av de förvänta thrashing frekvenserna av arten så att Nyquist sats ¹¹ är uppfyllda.

4. Förbereda mask och kyvetten för insamling av Data

1. överföra fyra vuxna nematoder till en färsk NGM ¹⁰ agar-fyllda Petri plattan med hjälp av en tunn, tillplattad platina tråd plocka (se avsnitt 1.3).
2. Ta bort en disponibel plast kyvetten ur förpackningen, vara noga med att bara röra kyvetten på dess räfflade sidor.
3. Använd en mikropipett att Pipettera destillerat vatten till kyvetten tills kyvetten är cirka 80% fylld med destillerat vatten.
   Obs: Det är viktigt att endast använda destillerat vatten eller joniserat buffertar som M9 ¹⁰ eller fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid hantering av nematoder, som kranvatten innehåller mikroorganism-dödande föreningar.
4. Placera petriskål som innehåller den C. elegans som ska användas under en dissekera omfattning.
5. Använder platina plocka, ta bort en mogen C. elegans från petriskål och dränka plocka in i kyvetten, flytta pick i cirklar om nödvändigt att rubba Nematoden.
6. Att förhindra bubblor bildas i kyvetten, Fyll kyvetten med vatten tills det buktar något över kyvetten ' s topp. Fyll i kyvetten ' s cap helt med vatten sedan snabbt lägga locket på i kyvetten.
7. Använda en optisk rengöringsduk ta bort vattendroppar som kan ha spillt över och optisk rengöring papper för att rengöra några små återstående droppar.

5. Realtid Data-förvärv av diffraktion mönster intensitet förändringar

1. slå på helium-neon laser och justera inställningen frekvens/färgen så att den producerar en röd balk. Slå på sensorn.
   Varning: Använd en låg energi stråle på 632 nm, som C. elegans undvika högfrekventa (blå) ljus ¹².
2. Leta upp masken i kyvetten. Holding i kyvetten på dess räfflade sidor, försiktigt luta kyvetten tills nematod är ungefärligt i centrera av delen av kyvetten.
   Obs: Skaka eller luta kyvetten våldsamt orsakar masken att krocka med väggarna i kyvetten. Detta kan skada Nematoden.
   1. Plats i kyvetten på stativet i det optiska systemet, centrering masken inom laser ' s strålen reflekteras från spegeln 1 spegel 2. Se till att eliminera ströljus.
3. Center masken i laserstrålen.
   1. Placera fotodioden i diffraktionsmönster så att placeringen av en fotodiod och den centrala högst diffraktionsmönster inte sammanfaller.
   2. Justera det neutral densitet filtret för att förhindra mättnad av fotodioden. Roterande neutral densitet filter hjulet reglerar ljusintensiteten.
      1. Rotera det neutral densitet filter så att spänningen ut från fotodioden ökar.
         Obs: Spänningsutgång observeras att använda programvaran för den digitala fotodioden. Fotodioden är mättad om spänningen inte ändras. I så fall rotera neutral densitet filter tills spänningen minskar utan plattas i en minsta behandlingen. Se till att spänning signalen inte platta på peak avläsningarna, som anger mättnad av fotodioden. Minska ljusintensiteten genom roterande neutral densitet filter hjulet om mättnad observeras.
   3. När den rörliga diffraktionsmönster är synliga, samla data med en fotodiod genom att klicka på startknappen på programvara Kontrollera oscilloskopet medan övervakning masken ' s rörelse. Fortsätt ta mätningar tills masken rör sig laserstrålen och diffracning mönster försvinner, vilket brukar ta ca 20 s.
      1. Stop data samla processen genom att klicka på stoppknappen på programvaran för oscilloskopet. Spara varje rättegång ' s data i CSV- eller TXT-format.
4. Upprepa steg 5.2-5.3 tills minst 50 uppsättningar data har samlats in för varje fenotyp. Åtta till tio djur per studie.
5. Om kyvetten är repig kassera det och mask, och upprepa steg 4. Om masken är skadat i överföringen, kassera den och skölj i kyvetten med destillerat vatten innan Upprepa steg 4 använder den samma kyvetten.
6. Upprepa steg 5 och använder OH7547 " Roller " stam, vara noga med att etikettera data för att ange mask stammen.

6. Fourier Spectrum av Data

1. Importera data förvärvas till ett program för analys av data som kan utföra åtskilda Fourier omformar ³.
2. Utför Fouriertransformer på varje datamängd som använder alternativet fast Fourier transform (FFT) av programvaran.
3. Genomsnittliga frekvenserna från FFT resultaten för varje amplitud för N2 wild typ maskar.
4. Upprepa steg 6.3 använda FFTs från OH7547 " roller " maskar.

7. Modellering av Fourier spektrum

1. Program en binära modellen av Nematoden locomotion (se program som ingår i de kompletterande material).
   Obs: Denna modell är en grov uppskattning, som vid första visar masken motion framträdande egenskaper. Modellen kan förfinas som resultaten jämförs med riktiga maskar. Worm former är approximationer använda mikroskopet bilder ¹³.
   1. Skapa sekventiell ramar av binära modellen rör sig genom minst två mask cykler ( figur 2a). Se videor i de kompletterande material; C mask video (CWorm.avi) och W mask video (WWorm.avi).
2. Producera sekventiell diffraktionsmönster. Se videor i de kompletterande material. C mask diffraktion video (CWormDiff.avi) och W mask video (WWormDiff.avi).
   1. Fouriertransform varje mask bildens binära ram. Ju större utfyllnaden av ramen runt masken, desto bättre upplösning av diffraktion bilden blir.
      Obs: Det absoluta värdet av varje Fourier omvandlas ram är proportionell mot den motsvarande diffraktionsmönster ( figur 2b).
   2. Tune kontrasten av diffraktionsmönster genom att mappa diffraktionsmönster stödnivåerna till en logaritmisk skala.
      Obs: Kameror och ögonen tenderar att fungera på en icke-linjär skala. En logaritmisk skala kan simulera hur en diffraktionsmönster vanligtvis uppfattas av det mänskliga ögat.
3. Extrahera modellerade diffraktion signalen.
   1. Plocka en off-center läge som motsvarar till platsen för fotodioden i diffraktionsmönster.
   2. Lägga till närliggande matrix element kring platsen för fotodioden att simulera storleken på fotodioden. Storleken på fotodioden är normalt 0,1% av den modellerade diffraktionsmönster.
   3. Post och tomt sekvensen av omfattningen av diffraktion signaler. Kontrollera att signalen är fysiskt rimliga (dvs. när det gäller periodiska stryk, signalen från fotodioden bör periodiska samt).
4. Fourier omvandla signalen diffraktion som erhållits i 7,3 och jämföra resultat med experimentella data.
5. Upprepa för olika mask stammar och jämför.

Representative Results

Den optiska experiment som visas i figur 1 möjliggör studier av mikroorganismer utan att vara bunden till ett fokalplan. Thrashing signalen från fotodioden kan observeras i realtid på datorskärmen som data samlas in. Ovanliga mönster kommer att bli synlig omedelbart utan att analysera en video i detalj.

Exempel på modellerade sekventiell mask rörelse och motsvarande diffraktion mönster visas i figur 2. De modellerade diffraktionsmönster kvalitativt liknar experimentell mönster¹ och är en första indikation att simuleringarna framgångsrikt modell Nematoden.

En prov temporal diffraktion undertecknandet av de två typerna av C. elegans studerat här visas i figur 3. Det kan ses kvalitativt att varje Nematoden thrashes vid olika priser och amplituder. Några av skillnaderna kan kvantifieras genom kurva montering som var gjort i en tidigare publikation¹. Diskreta fouriertransformen, avslöjar dock mer detaljer angående inbäddade frekvenser:

, (1)

där F_k är digitala fouriertransformen (FT) och f_n är tidsberoende raw diffraktion signalen med den diskret tid är variabeln n och den diskreta frekvens variabel k. N det totala antalet datapunkter. Den genomsnittliga digital fouriertransformen möjliggör Nematoden kan identifieras av amplituden av dess diffraktion frekvensspektrum (figur 4). Vildtyp spektrumet domineras av lägre frekvenser än rullen motion spektrumet.

En modell som approximerar den vilda typen kontra rullen C. elegans anteckningar den vilda typen tenderar att spöa i en vågliknande (figuren W eller S) motion (figur 2a) medan rullen tenderar att gilla en sida som ungefär liknar en oscillerande C-form ( Figur 5). Detta ger en förklaring för olika spektra. Rullen kommer mestadels bildar ett C på ena sidan medan W svängningen kan ses som två motsatta C motioner. Av denna anledning är W rörelse mer komplexa avslöjar mer sekundära låga frekvenser än C rörelse. Detta resultat bekräftas i beräkningsmodell. Formen W har en mycket högre frekvens än formen C (figur 6). Detta bekräftas i FFT i figur 4 där rullen frekvenserna mer klustrade medan inte helt diskreta. Statistiken för rullen är skev eftersom rullen kan återgå till vildtyp locomotion tillfälligt.

Utjämnad effekt spektra av roller typ C. elegans visar en bred topp på ~1.5 Hz, medan simning wild typ C. elegans uppvisar ett multimodalt spektrum (inklusive toppar på ~1.0 Hz och 1,75 Hz). Fotodioden (PD) har en ändlig storlek som sprids över flera matrix element. Enskilda matrix element eller punkter på diffraktionsmönster varierar i intensitet eftersom konstruktiva och destruktiva störningar varierar; de frekvenser som variera stödnivåerna är dock densamma för alla matrix element, som kan ses i figur 7. Med tanke på tiden derivatan ekv 1, det kan ses att frekvens fluktuationer inte beror på matrisen fas men endast på objektets ursprungliga svängningar:

, (2).

Som PD sprider sig över flera matrix element, genomsnittlig topp platserna till en konsekvent frekvens profil. Viss variation kan förväntas och kan ge ledtrådar om orientering på masken. Frekvens distribution ändras som gångarten mask förändringar. Den nuvarande modellen är en enkel modell som bara tillåter för utvärdering av topp platser i stället för relativa toppar. Olika motoriskt mönster kommer i genomsnitt till olika topp platser.

Figur 1. Experiment. Låg effekt laser beam resor genom neutral densitet filter, reflekteras av spegel M1 ner genom den kyvetten innehållande masken på spegel M2 och resor mot fotodioden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Sekventiell mask former och motsvarande diffraktionsmönster. (en) vissa väljer sekventiell binära bilder av modellerade W form nematoder och (b) motsvarande sekventiella diffraktionsmönster. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Experimental prov diffraktion signaturer. Diffraktion underskrifter som samlats in för (en) OH7547 ”roller” och (b) N2 vildtyp C. elegans med en enda fotodiod i mönstret diffraktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Experimentell i genomsnitt Power spektra av rullen och vildtyp Fraunhofer diffraktion serien. Spectra showen frekvenserna presentera i genomsnitt fouriertransformen av tidsserierna inspelad med en fotodiod. En Gaussisk filter av standardavvikelse 0,075 Hz, trunkeras efter 3 standardavvikelser, används för utjämning. Notera den breda spektraltoppen på ~1.5 Hz i utjämnade rullen spektrum, jämfört med multimodala jämnas vildtyp spektrum (inklusive toppar på ~1.0 och 1.75 Hz). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5. Diffraktion bildandet Illustration. Diffraktionsmönster kan modelleras genom att tänka på varje linjesegment som en oändligt liten rak linje (vänster). Överlagras dessa linjer (höger) visar byggandet av långt-fältet diffraktionsmönster som genereras av en C-formad Nematoden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6. Simulerade Power spektra av rullen och vildtyp Fraunhofer diffraktion serien. (en) C form och (b) W form maskar med en fotodiod centrerad på matrix elementen 200 (vertikal) och 175 (horisontellt). Formen W visar en högre täthet av frekvenser på grund av de mer komplexa locomotion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7. Simulerade Power spektra av rullen och vildtyp Fraunhofer diffraktion serien på olika fotodioden platser. (en) W form mask och masken (b), C form för enkel matris element på olika platser som simulerar olika platser i fotodioden. Toppar varierar för olika platser; topp platser är dock fortfarande samma för specifika former. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Inklusive sträckor av data med inaktivitet kommer att förvränga resultaten eftersom konstgjorda lägre frekvenser kommer att vara i genomsnitt i resultaten. Mättar fotodioden kan kännas igen av platta toppar eller ”skära av” toppar i rådata. Dividera varje raw data-set med peak stödnivåer hjälper med redovisning av fluktuationer i laser intensitet.

De högsta frekvenserna är en indikator på övergripande stryk frekvens; men komplicerade rörelse orsakar störningar på beat frekvenser i mönstret diffraktion och måste undersökas noggrant.

Denna metod kan användas för att undersöka förflyttningen av andra nematoder. Miljön kan ändras till ett annat medium. Våglängder kan ändras också. Arbeta i det synliga området av det elektromagnetiska spektrumet är enklaste och säkraste.

En mer förfinad modell kommer att simulera diffraktion spektra mer realistiskt i framtiden. En framtida modell kan omfatta en mask som kan ändra inriktning, som inte skulle påverka frekvens platser men relativa toppar. En mer realistisk modell skulle möjliggöra en probabilistisk fördelning av thrashing frekvenser, som skulle bredda topparna som i experimentella data. Ett uppslag i frekvenserna skulle hänsyn till variationer i thrashing frekvenser.

Den aktuella mask-formen är rå, särskilt i regionen huvud och svans, som bör vara mer avsmalnande än i den nuvarande modellen. Det kan vara intressant att genomföra en detaljerad analys av tidsserier med signalen eftersom det kan ge ledtrådar om komplexiteten i förflyttningen i olika mutanter.

Det är värt att överväga praktiskhet i expandera denna teknik till karaktärisera flera nematoder samtidigt. Denna metod bör förstås som en kompletterande metod för att befintliga metoder använder traditionella Mikroskop. Denna metod har en fördel i att inte kräva ett mikroskop under data-förvärvet så att masken kan flytta ut fokalplanet. I genomsnitt frekvens spektra visar tydliga skillnader i masken rörelse och kan kvantifieras genom förhärskande frekvens topparna, som är en ny metod kvantifiera mask locomotion. Dataanalys av diffraktion signaturerna är i vidareutveckling och kommer förhoppningsvis att leda till en automatiserad identifiering flera mutanter och individer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tunable Helium-Neon laser	Research Electro-Optics	30602	Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm.
2 Front Surface Aluminum Mirrors	Thorlabs	PF10-03-F01
Photodiode: SI Amplified Detector	Thorlabs	PDA 100A
Quartz Cuvette	Starna Cells	21/G/5	Plastic cells may be used as well.
MatLab (Software)	MathWorks	R2016b (9.1.0.441655)	Use the fft command to simulate diffraction
Excel	Microsoft	14.7.1	Used for data analysis of Figure 4
Caenorhabditis elegans Roller	University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC)	Strain: OH7547 Genotype: otIs199.	https://cbs.umn.edu/cgc/home
Caenorhabditis elegans Wild Type	University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC)	Strain:N2 Genotype: C. elegans wild isolate	https://cbs.umn.edu/cgc/home