Summary
Enterohemorrhagic 생물 발광 표시 된 박테리아를 사용 하 여 대장균 (EHEC) 식민지에 대 한 마우스 모델의 자세한 프로토콜 제공 됩니다. 비-침략 적 vivo에서 이미징 시스템 라이브 동물에 의해 이러한 발광 박테리아의 탐지 EHEC 식민의 우리의 현재 이해를 미리 수 있습니다.
Abstract
Enterohemorrhagic E. 대장균 (EHEC) O157:H7는 foodborne 병원 체는 causesdiarrhea, 출혈 성 대 장 염 (HS), 그리고 hemolytic 신부전 증후군 (HUS), 인간의 창 자 장관에 식민지. EHEC 식민 vivo에서 의 상세한 메커니즘 연구를 모니터링 하 고 계량 EHEC 식민 동물 모델에 필수적 이다. 여기 모니터링 하 고 계량 EHEC 식민지 생활 호스트에서 EHEC에 발광 표현 플라스 미드를 변형 하 여 마우스 EHEC 식민 모델을 설명 합니다. 동물 생물 발광 표시 EHEC로 주사는 비-침략 적 vivo에서 이미징 시스템으로 탐지 하 여 쥐에서 강렬한 발광 신호를 보여줍니다. 후 1, 2 일 게시 감염, 발광 신호 수 여전히 감지할 수 감염 된 동물에서 EHEC 호스트에 적어도 2 일 동안 식민지 건의 하. 우리는 또한 이러한 발광 EHEC ex vivo 이미지에서 맹에 콜론, 특히 마우스 소장을 찾아 보여줍니다. 이 마우스 EHEC 식민 모델 EHEC 식민 메커니즘의 현재 정보를 도구 될 수 있습니다.
Introduction
EHEC O157:H7 설사1, HS2에서3, 오염 된 물 이나 음식을 통해도 급성 신부전4 원인 병원 체 이다. EHEC 병원 성 enterobacterium 이며 인간1의 위장을 colonizes. EHEC 먼저 호스트 창 자 상피 준수 때 그들은 유형 III 분 비 시스템 (T3SS) 분자 주사기는 연결을 유도 하 고 적용을 이후에 병 변 (A/E) effacing 역할을 통해 호스트 세포에 주입 식민 요인 접착 (식민)5. 이 유전자는 A/E 병 변 형성에 관여 enterocyte 항목 (리) pathogenicity 섬5의 소재 시로 인코딩됩니다.
생물 발광은 빛 생산 화학 반응, 어떤 luciferase catalyzes 보이는 빛6를 생성 하는 기판 소. 이 효소 과정은 종종 산소 또는 아데노신 3 인산 염 (ATP)6의 존재를 필요로 한다. 생물 발광 영상 (BLI) 연구원 시각화 및 호스트 병원 체 상호 작용의 양자화에에서 있습니다 라이브 동물7. 씨 수 있습니다 그들은 이주와 다른 조직7; 침략 발광 박테리아에 따라 살아있는 동물에서 세균 감염 사이클 특성을 이 감염의 동적 진행을 보여준다. 또한, 동물에서 세균 부하는 관련이 발광 신호8; 따라서, 그것은 간단 하 고 직접적인 방법으로 실험 동물의 병 적인 상태를 추정 하는 편리한 표시기입니다.
여기에 사용 되는 플라스 미드 포함 luciferase 오 페론, luxCDABE, 박테리아 자체 luciferase 기판7,9인코딩하는 Photorhabdus luminescens 에서. 이 luciferase 표현 플라스 미드 박테리아로 변형 하 여 살아있는 동물에서 이러한 발광 박테리아를 관찰 하 여 식민과 감염 프로세스를 모니터링할 수 있습니다. 전반적으로, 씨 및 생물 발광 표시 된 박테리아 세균 숫자 및 위치, 항생제/치료 치료와 감염/식민지6, 에 세균성 유전자 발현 세균 생존 능력을 감시 하는 연구자 수 7. 수많은 병원 성 박테리아는 감염에서 감염 주기 및/또는 유전자 표현 검토 하 luxCDABE 오 페론 표현 보고 되었습니다. Uropathogenic 대장균10, EHEC8,11,,1213, enteropathogenic를 포함 하 여 이러한 박테리아 대장균 (EPEC)8, Citrobacter rodentium14,15, 살 모 넬 라 typhimurium16, Listeria monocytogenes17, Yersinia enterocolitica18,19, 비 브리 오 cholerae20, 문서화 되었습니다.
몇 가지 실험 모델 EHEC 식민 생체 외에서 그리고 vivo에서21,,2223의 연구를 촉진 하기 위해 개발 되었습니다. 그러나, 공부 하기는 EHEC 식민 vivo에서, 적당 한 동물 모델의 부족 및 따라서 내용의 결과 소수 있다. EHEC 식민 메커니즘에는 vivo에서의 연구를 촉진 하기 위하여 관찰 하 고 계량 비-침략 적 방법에서 살아있는 동물에서 EHEC 식민 동물 모델을 구축 하는 귀중 한입니다.
이 원고는 EHEC 식민 생활 호스트에 시간이 지남에 따라 모니터 발광 표현 시스템을 사용 하는 마우스-EHEC 식민 모델을 설명 합니다. 마우스는 intragastrically 생물 발광 표시 EHEC로 접종 하 고 발광 신호는 비-침략 적 vivo에서 이미징 시스템13와 쥐에서 발견 되. 마우스 감염 생물 발광 표시 EHEC 2 일 게시 감염 후 2 일 게시 감염 호스트 창에 그 박테리아 식민지는 제안 후 그들의 내장에서 중요 한 발광 신호를 보여주었다. 이미지 데이터 비보 전 이 식민은 맹 쥐의 콜론에서 구체적으로 보여주었다. 이 마우스 EHEC 모델을 사용 하 여 발광 EHEC 식민 검출 될 수 있다 살아있는 호스트에는 vivo에서 이미징 시스템에서 더 이해를 증진 수 있습니다 장의 박테리아 식민지의 상세한 메커니즘을 연구 하 여 EHEC 유도 생리와 병리학 변화입니다.
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Protocol
주의: EHEC O157:H7는 biosafety 수준 2 (BSL-2) 병원 체 질병 통제 및 예방 (CDC) biosafety 지시 (https://www.cdc.gov/)를 위한 센터에 따르면. 따라서, 모든 실험 절차 관련 된 EHEC BSL-2 시설에서 수행 되어야 합니다. 실험을 수행 하는 동안 실험실 코트와 장갑 착용. 인증된 biosafety 내각 (BSC)에서 작동 합니다. 70% 에탄올과 실험 절차 전후 실험 벤치를 소독. 모든 악기 또는 장비 연락처 (또는 잠재적으로 연락처) EHEC 70% 에탄올 이나 표 백제로 소독 되어야 한다. 신중 하 게 오염 된 (또는 잠재적으로 오염 된) 폐기물은 밀봉 하 고 압력가 이어야 한다. 필요한 경우 마스크, 눈 보호, 이중 장갑 또는 죄수 복을 착용. 6 주 된 C57BL/6 여성 마우스 구입 하 고 실험실 동물 센터의 국립 쳉 쿵 대학 (NCKU)에서 유지 했다. 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 NCKU (승인 번호 104-039)에 의해 승인 되었다.
1. Bioluciferase 표시 된 EHEC 박테리아 생성
- 믹스 50 ng deoxyribonucleic 산 (DNA), 1 μ 각 10 μ M의 앞으로 반전 뇌관, 2 μ 2.5 m m deoxynucleotides (dNTPs), 2 μ 버퍼, 0.2 μ DNA 중 합 효소, 및 살 균 이중 증 류 물 (ddH2O) 증폭 20 μ의 최종 볼륨을 x 10에 반대로 대 카세트, nptII 유전자24 DNA 템플렛 pBSL18024, 국가 유관 프로젝트 (NBRP)에서 구입 하는 것입니다. PCR 조건 표 1 에 나열 되 고 뇌관 순서는 표 2에서 사용할 수 있습니다.
- PCR 제품 상업적 복제 벡터 키트 다음을 위하여 프로토콜 ( 재료의 표참조).
- NsiI 와 SmaI 에 의해 클로닝 벡터에서 nptII 유전자 단편을 삭제할 및 pAKlux29 대 내성 플라스 미드를 만드는 NsiI ScaI 에 의해 소화 되어, pBBR1MCS4로 복제 pWF27813.
- LuxCDABE 오 페론 luciferase 플라스 미드9, pAKlux2, SpeI-HF 와 ScaI 및 복제에 의해 표현에서 삭제할 SpeI HF 와 SmaI 소화 대를 생성 하는 pWF278 저항 및 luciferase 플라스 미드, pWF27913를 표현.
참고: 플라스 미드 추출 및 삭제 조각 purifications, 상업 플라스 미드 추출 및 젤 추출 키트를 각각 사용 합니다. 효소 소화에 대 한 100 ng DNA, 1 μ 10 x 버퍼, 각 선택 된 제한 효소, 그리고 살 균 ddH2O 10 μ의 총 볼륨의 1 μ를 혼합 하 고 2.5-3 h 37 ° C에서 품 어. - 2500 V 4 ms와 electroporation에 의해 대장균 O157:H7 EDL933 유능한 세포에 pWF279 플라스 미드를 변환.
- 1 시간 동안 37 ° C에서 1 mL Luria Bertani (파운드) 매체에 변형 된 박테리아 세포를 품 어.
- 16-18 h 37 ° C에서 대의 50 µ g/mL으로 보충 한 파운드 천 배지에 박테리아 접시
- vivo에서 이미징 기계 다음 날 여 접시의 발광 신호를 확인 하십시오. 접시에서 단일 식민지를 선택 하 고 3 mL 파운드 16-18 h 37 ° C에서 50 µ g/mL 대 보충에 문화.
- Diluting 하 여 세균성 주식 매체를 준비 살 균 ddH2O 30% 글리세롤 솔루션 100% 글리세롤.
- 대 방지 고정 나사 모자 cryovial에 세균성 주식으로-80 ° c.에서 박테리아 문화 및 30% 글리세롤 용액의 1:1 비율로 luciferase 플라스 미드를 은닉 하는 대장균 O157:H7 EDL933 박테리아 글리세롤의 최종 농도 15%입니다.
2. 발광 EHEC 박테리아 준비 구두 접종에 대 한
참고: EHEC 준비 및 마우스 구강에 대 한 실험 절차의 타임 라인 순서도 그림 1 실험 준비에 도움을 제공.
- 은닉 luciferase 플라스 미드-80 ° C 주식에서 50 µ g/mL 대와 파운드 한 천 배지 위에 행진 대장균 O157:H7 EDL933 박테리아. 16-18 h 37 ° c.에 대 한 박테리아를 성장
- 16-18 h 220 rpm에서 37 ° C 배양 기에서 50 µ g/mL 대와 3 mL 파운드 매체에 문화와 하룻밤 플레이트에서 단일 식민지를 선택 하십시오.
- Subculture 박테리아 (1: 100 희석) 대 (50 µ g/mL)으로 200 rpm에서 37 ° C 배양 기에서 2.5-3 h에 대 한 파운드 국물 포함. (예를 들어, 추가 2 mL 하룻밤 배양 보충 대 (50 µ g/mL)와 200 mL 파운드 매체에 박테리아).
- 2.5-3 h에 대 한 박테리아를 품 어 및 600에서 광학 밀도 값 측정 값까지 nm (OD600) 0.9 ~ 1 사이입니다. 세균성 세포 수는 약 108 콜로 니 형성 단위 (CFU)의 밀도 / mL.
- 8000 x g 30 분, 4 ° c.에서 다시 교양된 박테리아 원심
- 박테리아의 펠 릿을 교 반 하지 않고는 상쾌한을 삭제 하 고 부드러운 동요에 의해 100 mL 0.9% 메 마른 정상적인 염 분으로 펠 릿을 세척.
- 한 번 2.5-2.6 단계를 반복 합니다.
- 세척 후 원심 8000 x g 30 분, 4 ° C에서 세균성 문화 하 고는 상쾌한 부드럽게 삭제.
- 응축은 펠 릿에 100 0.9% 살 균 일반 식 염 수와 함께. 예를 들어, 200 mL 박테리아 centrifuged는 펠 릿을 중단 2 mL 정상적인 염 분을 추가 합니다.
- 10 직렬 희석25통해 집중된 박테리아를 도금 하 여 박테리아 CFU (그것은 약 109 CFU/100 μ 응축 후에 있어야 정상적인 염 분)을 확인 합니다.
3. 마우스 EHEC의 구강
- 24 h에 대 한 스 물 (5 g/L)와 6 주 된 여성 C57BL/6 쥐를 취급 합니다.
- 24 시간 후 gavage 전에 또 다른 24 h에 대 한 일반 식 수로 전환. 24 h에 대 한 일반 물으로 치료 후 쥐 EHEC의 구강에 대 한 준비가.입니다.
- 플런저에 다시 당겨 100 μ EHEC 박테리아로 주사기를 채우십시오. 아무 공기 방울이 주사기에는 확인 하십시오. 손가락으로 주사기를 스냅 하 여 거품을 제거 합니다.
- 동물을 부드럽게 들어올리고 주의 케이지 위에 그것을 배치 합니다.
- 꼬리, 신중 하 게 마우스 잡고 고 동물 케이지의 상단을 그립 하 고 멀리 이동 하려고.
- 부드럽게 마우스의 머리를 이동 하지 않도록 엄지와 함께 동물의 앞면과 뒷면 목의 느슨한 피부를 파악 하 여 마우스를 제 지 하십시오.
- Gavage 바늘을 삽입 하 고 마우스의 머리는 고정 하 고 수직을 확인 하는 수직 위치에 마우스를 잡아.
- 입의 지붕에 따라 마우스 입에 gavage 바늘을 삽입 하 고 식도 및 위를 향해 아래로 이동.
- 삽입 된 바늘 절반 또는 2/3 길이 마우스에 때 주사 약 109 CFU 셀을 포함 하는 100 μ EHEC 박테리아.
4입니다. 시각화
- 구강, 후 1, 2 일에 발광 신호를 감지 합니다.
- 동물의 발광 신호를 검사 하기 전에 2.5% isoflurane 1.5 L/min 산소의 약 실에 그들을 둬서 그들을 anesthetize.
- 모든 마우스 의식 및 중지 이동 될 때까지 2-5 분을 기다립니다. 동물 생물 발광의 비보에 탐지에 대 한 준비가 되었습니다.
- 검색 및 이미지 동물의 발광 신호는 vivo에서 이미징 시스템. 소프트웨어 작업에 대 한 "데이터 수집" 섹션 5를 참조 하십시오. 이미징 프로세스 동안 모든 동물 2.5% isoflurane 1.5 L/min 산소의 지속적인된 공급을 받고 있다.
- 파일을 클릭 > 라이브, 그리고 수동으로 마우스에 집중.
- 노출 시간 및 레이저 강도 선택 합니다.
- 클릭 취득 > 캡처.
- 쥐 자 궁 경부 전위에 의해 안락사는 ex vivo 영상, 감염 된 쥐의 전체 내장 제거 및. Vivo에서 이미징 시스템 내장 9 cm 배양 접시와 이미지에 배치 합니다. 설정 되는 vivo에서 이미징 보기의 필드 A/b.로 설정 되어 제외 하 고 동일 자세한 내용은 "데이터 수집" 섹션 5를 참조 하십시오.
참고: 자 궁 경부 전위에 대 한 방법: 동물 케이지 그립을 한 손으로 꼬리를 파악 하 여 케이지 위에 마우스를 억제. 두개골의 기지에서 마커 펜 또는 엄지 및 목의 뒤에 대 한 다른 한편의 첫 번째 손가락을 놓습니다. 빨리 머리를 억제 하는 동안 손 또는 개체와 함께 앞으로 밀어 하 고 꼬리를 잡고 손으로 뒤로 당겨.
밀접 하 게 호흡 검거, 및 아무 심장 박동 확인 확인.
5. 데이터 수집
참고: 데이터 수집에 사용 되는 소프트웨어는 재료의 테이블에에서 나열 됩니다.
- 이미지 수집을 위한 소프트웨어 (그림 2)의 수집 컨트롤 패널을 엽니다.
- 선택 "발광" "사진,"와 "오버레이 합니다."
- "자동"으로 노출 시간 설정 "매체"로 Binning 설정
- Ƒ/중지 1로 발광 하 고 8에 대 한 설정 사진. Ƒ/중지 컨트롤 CCD 검출기는 빛의 양을 받았다.
- 보기의 이미지를 얻으려고 관심 분야에 따라 필드를 설정 합니다. 옵션 "D"는 5 6 주 된 쥐를 적합 하 고 한 번에 모든 이미지 수 있습니다. "C"는 한 필드에서 3 6 주 된 쥐 이미지 수 있습니다.
- 마우스/샘플 영상에 대 한 준비가 되 면, 일단 이미지 수집을 위한 "취득"을 클릭 합니다.
- 이미지 데이터 획득을 엽니다.
- 도구 팔레트 패널 (그림 3)을 엽니다.
- ROI 도구를 선택 합니다. 이미지 (그림 4) 발광 영역 범위 원을 (가장 왼쪽 중 하나)이 좋습니다.
- "측정 ROIs" (연필 아이콘) 측정 표면 발광 강도 (그림 3)를 클릭 합니다. 패널의 ROI 측정 및 정량화 값 표시 (그림 5).
- 사용 하 여 구성 측정 ROI 측정 패널의 왼쪽에 선택 값/필요한 정보 (그림 6), 그렇지 않으면 "수출"이 데이터 테이블 내보내고.csv 파일 (그림 5)으로 저장을 클릭 합니다.
- .Csv 파일에서 발광 강도 정량화로 열 "총 속 (p/s)"의 값을 사용 합니다.
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Representative Results
우리는 생물 발광 표시 EHEC 관리 (~ 109 세균성 세포) 구강에 의해 6 주 오래 된 여성 C57BL/6 마우스. 1 시간 이내 쥐 EHEC의 구두 접종 후 동물 vivo에서 이미징 시스템 그림 7과 같이 발광 신호 위해 시험 되었다. 결과 생물 발광 표시 EHEC와 gavage 쥐에서 강한 발광 신호를 보여주었다. 우리는 2 일 게시물 감염에 신호를 검사합니다. 그림 8A같이 쥐 2 일 EHEC는 2 일에 의해 호스트에 식민지 제안 감염 게시 후에 강렬한 발광 신호를 보여 야생-타입 EHEC EDL933 생물 발광 표시와 주사. 우리는 또한 intragastrically 생물 발광 표시 된 EDL933ΔrfaD (ΔrfaD) 쥐 (그림 8A) 감염. 이 돌연변이, lipopolysaccharide (LPS)에 망명을 우리의 이전 연구에서 호스트에 식민지를 줄이기 위해 표시 되었습니다. 그림 8A같이 발광 신호 ΔrfaD에서 발견은-없거나 적은 박테리아 나왔다 감염 된 쥐 세포는 쥐에 있는 식민지. 형광 성 신호의 정량화 그림 8B에서 표시 됩니다. 다음으로, 이러한 생물 발광 표시 된 박테리아의 위치 결정 했다. 감염 된 쥐 고통 없이 희생 했다 그리고 그들의 전체 내장 제거. 쥐 2 일 게시물 감염의 창 자 9 cm 배양 접시에 배치 했다 고 비보 전 (그림 9A) 몇 군데. 생물 발광 표시 된 EDL933에 감염 된 쥐의 장 조직을 밝혀 맹과 콜론, 이러한 발광 EHEC 식민지 맹에 감염 된 쥐의 콜론에 2 일에 대 한 제안에 발광 신호에 크게 증가 적어도. 쥐 감염 생물 발광 표시 ΔrfaD (그림 9A), 공개 된 vivo에서 이미지 (그림 8A와 일치 하는 그들의 창 자 조직에 발광 신호를 감소 하는 반면, ). 형광 신호의 정량화는 그림 9B에 표시 됩니다.
그림 1 : 타임 라인 실험 준비 순서도의.
타이밍의 개요 발광 EHEC 박테리아를 준비 하 고 스와 쥐를 pretreat 필요가 있었다. (A) EHEC 준비입니다. (B) 마우스 준비. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : Vivo에서 이미징 시스템 수집 제어판.
이미징 샘플, 전에 IVIS 수집 컨트롤 패널을 엽니다. 선택 "발광" "사진,"와 "오버레이 합니다." "자동"으로 노출 시간 설정 "매체"로 Binning 설정 Ƒ/중지 1로 발광 하 고 8에 대 한 설정 사진. Ƒ/중지 컨트롤 CCD 검출기는 빛의 양을 받았다. 샘플 영상에 대 한 준비가 되 면 "취득" 이미지를 클릭 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 도구 팔레트 패널.
이미지 획득, 후 발광 강도 측정을 위한 도구 팔레트 패널을 사용 합니다. 도구 팔레트 패널을 열고 이미지 데이터. 이미지에 발광 신호 범위를 ROI 도구 중 하나를 선택 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 정량화에 대 한 샘플에서 발광 신호.
이미지 ROI 도구에 의해 둘러 쌓여에 발광 신호 영역입니다. 여기에 표시 된 모든 발광 신호 빨간색 동그라미에서 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : ROI 측정.
발광 신호를 돌고, 도구 팔레트 패널에 "측정 ROIs" 클릭 후 값 같이 표시 됩니다. 열 총 속 (p/s)의 값은 발광 강도 정량화에 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 다른 부 량 정보 추가.
구성 측정 ROI 측정 패널의 왼쪽에, 클릭 하 여 다른 원하는 정량화 값/정보를 선택할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : 쥐 발광 EHEC로 주사 후의 대표 이미지.
마우스의 대표 이미지는 1 시간 이내 구강에 의해 발광 EHEC와 주사. 색 눈금 빛남을 (/sr p/s/c m2)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8 : 쥐의 이미지는 2 일 후 생물 발광 표시 EHEC로 주사.
(A) 마우스의 대표 이미지 EHEC EDL933 및 EDL933 발광 야생-타입으로 주사: 2 일 게시 감염 후 구강으로ΔrfaD . EHEC 감염 쥐의 생물 발광 강도 (B) 정량화. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 대표 이미지 표시 됩니다. 모든 실험 실시 했다 하지 독립적으로 세 번 2-3 동물 들과 함께 각 시간 및 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. P-값은 t-검정에 의해 통계 분석의 결과를 나타냅니다. 색 눈금 빛남을 (/sr p/s/c m2)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9 : 생물 발광 표시 EHEC 감염 된 쥐의 장 조직의 이미지.
(A) 2 일 후에 접종을 생물 발광 표시 된 EHEC, 쥐 했다 안락사와 전체 장 조직 제거 및 전 비보를 몇 군데. 대표 이미지 표시 됩니다. 장 조직 EHEC 감염 마우스에서의 생물 발광 강도 (B) 정량화. 모든 실험 실시 했다 하지 독립적으로 세 번 2-3 동물 들과 함께 각 시간 및 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. P-값은 t-검정에 의해 통계 분석의 결과를 나타냅니다. 색 눈금 빛남을 (/sr p/s/c m2)를 나타냅니다. 눈금 막대 나타냅니다 1 cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 단계 | 온도 | 시간 | 사이클 수 |
| 초기 변성 | 95 ° C | 10 분 | 1 |
| 변성 | 95 ° C | 30 초 | 35 |
| 어 닐 링 | 58.4 ° C | 30 초 | |
| 확장 | 72 ° C | 1.5 분 | |
| 마지막 확장 | 72 ° C | 10 분 | 1 |
| 보류 | 4 ° C | ∞ | 1 |
표 1: 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 조건
| 뇌관 이름 | 시퀀스 |
| nptII F | 5' CCTATGCATAATAATTCCGCTAGCTTCACG3' |
| nptII R | 5' GCTCCACCGATAATATTCCTGAGTCATACT3' |
표 2: 증폭 하는 데 사용 하는 뇌관 순서 nptII
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Discussion
그것은 알려졌다 EHEC luciferase 플라스 미드와 변환 호스트 또는 유전자 식 vivo에서8,,1112에 그것의 지역화를 검사 활용 되었습니다. 여기 시연 murine 모델 또한 murine 호스트8에서 EHEC 식민지 시기와 지역화를 검색 하기 위해 보고 되었다. 그럼에도 불구 하 고, 우리는 intragastrically 마우스 EHEC 접종을 관리 하는 방법과 구강에 대 한 발광 박테리아를 신중 하 게 준비 하는 방법의 세부 프로토콜을 제공 합니다. 특히,는 마우스 구강 EHEC (단계 3.7)의에 대 한 마우스 헤드의 위치 때 중요 gavage 바늘 삽입 됩니다. 위치 수직 하지 않으면 그것은 바늘을 통과 하기 어려울 것입니다 그리고 그것은 아마도 마우스를 다칠 수 있습니다. 3.8 단계에서 gavage 바늘 마우스의 입 안에 있을 때 혀 누워 것입니다 입 밖으로 약간. 식도에 gavage 바늘을 전달할 때 저항을 발생 하는 경우 바늘을 앞으로 이동 중지 하 고 즉시 그것을 철회. 바늘 식도 입력은 되도록 바늘 위치를 변경 합니다. 바늘 저항 발생, 박테리아는 위 대신 폐에 주입을 초래할 때 기도 입력 수 있습니다.
녹색 형광 단백질 (GFP)를 바이오 센서로 응용 생물학 실험에서 일반적 이다. 그러나,를 사용 하 여 GFP 기자로 서 헤모글로빈, 단백질 및 물 흡수도 200-650 nm 사이26, 겹치면는 높은 때문에 vivo에서 영상으로 라이브 동물에서 병원 체 감염/식민을 권장 하지 않습니다 관찰 GFP (여기 480 nm, 방출 510 nm)27 따라서, GFP를 사용 하 여 이미징 vivo에서 기자로 서 신호 수 중단 될 헤모글로빈, 단백질, 및 물 동물26에. 근 적외선 (NIR) 형광 적합 vivo에서 이미징의 흡 광도 창 주위는 때문에 650-900 nm28, 헤모글로빈의 낮은 흡수 계수의 지역에 있는 (< 650 nm)와 물 (> 900 nm)26 ,28 . 또한, 조직의 빛을 흡수 때 autofluorescence를 유도 하는 기회가 있다. 때 여기 및 방출의 파장 범위 GFP 창에서 NIR29보다 훨씬 더 autofluorescence를 유도 합니다. NIR의 사용은 신호 대 배경 비 autofluorescence 배경29를 제거 하 여 GFP의 비교를 개선할 수 있습니다. 생물 발광은 가시광선을 생성 하 여 자기 에너지를 필요 하지 않습니다. 그것은 그것의 효소 luciferase에 의해 기판 소를 진작 하 고 빛을 생성에 대 한 반응에 따라 다릅니다. 생물 발광 샘플에 직접 빛을 필요로 하지 않습니다, 샘플에서 배경 신호 이므로 매우 낮은. 기자는 더 일반적인 vivo에서 화상 진 찰에 대 한 쉽고 따라서 생물 발광의 사용. 반면, 형광 빛 여기를 신호 빛을 유도 하는 것이 필요 합니다. 때 조직의 빛을 흡수, 형광 빛 방출 될 것 이다 하 고 그들의 신호-잡음은 높은 생물 발광의 비교 있도록 autofluorescence를 유발 가능성이 있다.
라는 Citrobacter rodentium, 쥐의 자연적인 막 병원 체 murine 호스트를 식민지 메커니즘 연구 활용 되었습니다 EHEC 자연스럽 게 덜 구강 감염2,22에 의해 쥐에 있는 식민지는, 고려는 박테리아22,30서로게이트입니다. EHEC의 C. rodentium 둘 다 식민지 장 점 막 하 고 호스트22,30병 변 A/E의 형성을 유발. 그들은 또한 한 T3SS 및 A/E 병 변22,30을 유도 하는 여러 가지 이펙터 단백질 인코딩하는 리 pathogenicity 섬 포함. 따라서, luciferase C. rodentium 식민 병 리를 감지 하는 vivo에서 이미징 시스템을 통해 식민지 메커니즘 연구에서 기자가 되었습니다 또한 플라스 미드 표현 사용 보고14, 15. 그럼에도 불구 하 고, C. rodentium 감염 생쥐의 T3SS의 기능과 병 변 A/E의 메커니즘을 조사 하는 유용한 모델은, C. rodentium 포함 하지 않는 시가 독 소 (Stx)30, 즉 지배 EHEC, 특히 serotype O157:H73신장 장애를 일으키는 독성 요소. Stx 표현 C. rodentium 스트레인 건설 되어 있지만 최근31, EHEC 감염에 더 현실적 이다, 그것은 포함 되지 않습니다 식민지 및 감염에 대 한 중요 한 다른 잠재적인 EHEC 독성 요인. 또한, C. rodentium EHEC32, EHEC 식민지 그리고/또한 감염 하는 동안 독성 C. rodentium 에서 사용할 수 있습니다 제안 그것의 유전자의 67%를 공유 한다.
PWF27913, 여기에서 사용 하는 플라스 미드 표현 luciferase pAKlux29 그 등뼈는 pBBR1MCS433에서 수정 되었습니다. PBBR1MCS4 시험 되 고 다양 한 박테리아33복제, 비록 그것은 되도록이 플라스 미드 복제 (ORI)의 세균 호스트에 대 한 적합 한 실험에 대 한이 luciferase 플라스 미드-기반 시스템을 사용 하기 전에 중요 한 고 따라서 확인이 luciferase 플라스 미드 표현 세균 호스트에 복제할 수 있습니다. 우리는 박테리아에서 플라스 미드의 안정성을 유지 하기 위해 항생제 스트레스를 사용 합니다. 박테리아는 항생제의 부재에서 동물을 입력, 적어도 2 일 동안 야생-타입 EHEC의 발광 신호 감지 되었습니다. 그러나 우리 때문에 우리가 이미 EHEC WT EHEC rfaD (즉 EHEC 그대로 LPS 합성에 필요한 유전자를 인코딩합니다) 사이 발광 강도에 상당한 차이 볼 수 없었다 감염 2 일 이상에 대 한 다음 않았다, 2 일에 돌연변이. 유지 하기 위해 안정적으로 항생제의 부재에서 박테리아에 플라스 미드, 플라스 미드 pCM1710,34 이 목적을 위해 사용할 수 있습니다. pCM17 2-플라스 미드 분할 시스템 및 항생제10,34의 부재에 박테리아에서 플라스 미드의 유지 보수를 위해 post-segregational 살인 메커니즘을 인코딩합니다. 플라스 미드 pCM17 포함 OmpC 발기인에 의해 구동 luxCDABE 오 페론 적어도 7 일8발광 신호에 의해 검출 될 수 있다. 항생제의 부재에서 연속 발광 식 박테리아를 다른 방법 세균성 염색체35에 luxABCDE 유전자를 삽입 하는 것입니다. 프랜시스 외 사용 transposon 생물 발광 안정적인 스트레인35를 구 균 의 염색체에 무작위로 삽입 luxABCDE 오 페론과 항생제 카세트 삽입.
우리의 이전 연구13, 우리는 검사 하는 호스트에서 EHEC 식민지 고 EHEC 야생 유형 (WT) 및 돌연변이13식민지 능력의 차이 비교 하 여이 모델 시스템을 활용. 쥐 때 관리 되었다 발광 EHEC rfaD 돌연변이, 극적으로 점감 하는 발광 신호에 비해 그의 2 일 후 WT EHEC 감염 게시. 이 murine 모델 호스트에서 EHEC 식민의 돌연변이 효과 분석할 수 있는 증거를 제공 합니다. 또한, EHEC의 식민을 줄이기 위한 치료 치료 항생제의 사용 이기 때문에 금기5,36EHEC 감염을 고려 하 고, 잠재적인 솔루션입니다. 따라서, 그것은 가치가 테스트 여부이 모델 시스템 반대로 식민 마약/호스트에서 enterobacteria 식민지에 대 한 치료의 효능을 검사를 사용할 수 있습니다. 우리는이 모델 시스템을 사용 하 여 그것이 가능한 타이밍 및 단순히 EHEC, 뿐만 아니라 다른 enterobacteria 식민지 비보의 위치를 검사 하는 믿습니다. 이 동물 모델을 사용 하 여 마우스에서 EHEC 식민의 과정을 모니터링 할 수 있습니다 하 고 호스트에서 식민 부담 살아있는 동물에서 EHEC의 공간 및 시간 식민지를 결정 하기 위해 계량 수 있습니다. 시각화 및이 모델을 사용 하 여 enterobacteria 식민의 정량화 하 게 조사 하 고 enterobacterial 식민의 정밀한 메커니즘을 분석 하 고 따라서 식민지 연구의 부족에 대 한 보상을 하는 훌륭한 도구 및 현재 지식 향상.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 인정 하는 치 정 첸에서 학과의 의료 연구, 치 매 의료 센터 (타이난, 대만), 감염 및 국립 쳉 쿵 대학 실험실 동물 센터에서 지원에 마우스에 도움. 이 작품은 과학의 성직자에 의해 지원 하 고 기술 (대부분) CC를 (가장 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006-011, and106-2321-B-006-005)를 부여 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaker incubator | YIH DER | LM-570R | bacteria incubation |
| Orbital shaking incubator | FIRSTEK | S300 | bacteria incubation |
| pBSL180 | source of nptII gene | ||
| pAKlux2 | source of luxCDABE operon | ||
| T&A Cloning Kit | Yeastern Biotech | FYC001-20P | use for TA cloning |
| Nsi I | NEB | R0127S | use for plasmid cloning |
| Sca I | NEB | R0122S | use for plasmid cloning |
| Spe I-HF | NEB | R0133S | use for plasmid cloning |
| Sma I | NEB | R0141S | use for plasmid cloning |
| T4 ligase | NEB | M0202S | use for plasmid cloning |
| Ex Taq | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| 10X Ex Taq Buffer | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| dNTP Mixture | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| PCR machine | applied Biosystem | 2720 thermal cycler | for PCR amplification |
| Glycerol | SIGMA | G5516-1L | use for bacteria stocking solution |
| NaCl | Sigma | 31434-5KG-R | chemical for making LB medium, 10 g/L |
| Tryptone | CONDA pronadisa | Cat 1612.00 | chemical for making LB medium, 10 g/L |
| Yeast Extract powder | Affymetrix | 23547-1 KG | chemical for making LB medium, 5 g/L |
| Agar | CONDA pronadisa | Cat 1802.00 | chemical for making LB agar |
| kanamycin | Sigma | K4000-5G | antibiotics, use for seleciton |
| streptomycin | Sigma | S6501-100G | antibiotics, eliminate the microbiota in mice |
| EDL933 competent cell | Homemade | method is on supplemental document | |
| Electroporator | MicroPulser | for electroporation | |
| Electroporation Cuvettes | Gene Pulser/MicroPulser | 1652086 | for electroporation |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti, J-26S XP | use for centrifuging bacteria |
| Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | use for centrifuging bacteria |
| Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JLA10.5 | use for centrifuging bacteria |
| centrifuge bottles | Beckman Coulter | REF357003 | use for centrifuging bacteria |
| centrifuge bottles | Thermo Fisher scientific | 3141-0500 | use for centrifuging bacteria |
| eppendorf biophotometer plus | eppendorf | AG 22331 hamburg | for measuring the OD600 value of bacteria |
| C57BL/6 mice | Laboratory Animal Center of NCKU | ||
| lab coat, gloves | for personnel protection | ||
| isoflurane | Panion & BF Biotech Inc. | G-8669 | for mice anesthesia, pharmaceutical grade |
| 1ml syringe | use for oral gavage of mice | ||
| Reusable 22 G ball-tipped feeding needle | φ0.9 mm X L 50 mm | use for oral gavage of mice | |
| surgical scissors | use for mice experiment | ||
| Xenogen IVIS 200 imaging system | Perkin Elmer | IVIS spectrum | use for bioluminescent image capture |
| Living Image Software | Perkin Elmer | version 4.1 | use for quantifying the image data |
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