Summary
这篇文章描述了一个协议，以有效地获得和囊胚阶段文化从小鼠胚胎多能干细胞系。
Abstract
小鼠胚胎干细胞 （卓） 推导是哪个多能干细胞系建立了从胚胎植入前胚胎的过程。这些行保留自我更新或区分在特定条件下的能力。由于这些特性，卓在再生医学、 疾病建模和组织工程研究中是一个有用的工具。这篇文章描述了一个简单的协议，以获得高推导效率 （60-80%) 的卓行通过培养从宽容小鼠品系对白血病抑制因子定义培养基中的饲养细胞的囊胚。议定书 》 还可有效地将卓行从非许可的小鼠品系，通过简单的加法到推导介质 （2i 中等） 的两种小分子抑制剂的鸡尾酒。提供了制备及文化的饲养层细胞，收集和小鼠胚胎和推导的文化和文化的卓行的详细的过程。该协议不需要专门的设备，可以在任何与基本的哺乳动物细胞培养的专门知识的实验室进行。
Introduction
胚胎干细胞 (ESC) 是多能干细胞来自胚胎植入前胚胎，保留自我更新或特定条件1下区分的能力。基于这些属性，按 esc 键已成为再生医学、 疾病建模和组织工程研究2有用工具。
按 ESC 取自于胚胎植入前胚胎，源自鼠标 ESC （卓） 线与低成功3，4第一次。多年来，推导效率仍然很低难以维持体外多向分化潜能。此外的进纸器细胞5，提高工作效率推导，存在促进殖民地附件和提高染色体稳定性6，全能维修改进协议导致的几种修改。最重要是加法白血病抑制因子 (LIF) 到卓培养基7，8，使用 129S2 宽松背景9从胚胎和卓与培养基的文化定义血清，免费的潜在分化因素10。最近，令人信服的证据表明，另外的两个小分子调节的信号传导通路在卓培养基 （称为 2i） 鸡尾酒是最好的保持多向分化潜能。2i 鸡尾酒由 MEK 抑制剂 PD0325901，减少分化信号抑制有丝分裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 通路与都可诱发 gsk3 抑制剂 CHIR99021，增强了细胞存活在低密度的结合通过激活 Wnt 途径11。
在本文中，我们描述了一个简单的协议，有效地将卓行从小鼠囊胚。我们按照标准程序，培养从宽容菌株对 LIF 和血清更换12推导培养基中的饲养细胞的胚胎。按照此协议，卓行可以得到效率相当于那些获得 2i 介质中。尽管这样，可以添加 2i，以避免可能出现的问题，具有多向分化潜能维修或使用非许可株时。
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Protocol
使用以下各节所述的动物已被批准，由动物和人类研究的大学 Autònoma de 巴塞罗那伦理委员会和部 d ' 农业，Ramaderia，以上我Alimentació 的加泰罗尼亚 （协议 #8741）。
1.馈线细胞失活和存储
注： 包皮成纤维细胞 (h f F-1) 以前被冰冻住的冷冻液组成的 90%胎牛血清 (FBS) 和 10%二甲基亚砜 （1 毫升的二甲基亚砜），直到使用存储在液态氮。
- 解冻 h f F-1 （1 毫升） 低温瓶浸泡在 37 ° C 水浴瓶。
- 将低温瓶解冻的内容添加到预热杜尔贝科 ' s 改良鹰 ' s 介质 (DMEM) 辅以 10%胎牛血清，使 1:10 稀释。
- 种子在 T75 瓶 （10 毫升） 稀释的细胞和培养他们在 37 ° C，5%CO 2。
- 第二天，改变介质以消除二甲基亚砜遗留物。删除介质和添加 10 毫升的预热 DMEM 辅以 10 %fbs。
- 文化 HFFs 和改变介质每 48 小时直到文化达到汇合的阶段。这可能需要大约 7 到 10 天。
- 制备灭活溶液，稀释丝裂霉素 C 在 DMEM 辅以 10%胎牛血清在终浓度为 10 微克/毫升。孵育细胞在 37 ° C，5%CO 2 3 h 的灭活解决方案。
- 删除灭活解决方案和冲洗三次用 2 毫升的汉克斯平衡盐溶液 (HBSS) 消除丝裂霉素 C 残余细胞。
- 要分离的灭活的单元格，添加 1 毫升的预热胰蛋白酶-EDTA 溶液和孵育 5 分钟在 37 ° C，5%CO 2。
- 观察下倒置显微镜观察，以确保它们是分离的细胞 （10 x 目标与 0.3 的数值孔径或 NA）。如果他们不是，则把他们孵育几分钟在 37 ° C，5%CO 2。检查再下倒置显微镜观察细胞。
- 以游离细胞块与巴斯德吸管吸管解决方案。
- 消除酶解液加入 4 毫升的 DMEM 辅以 10%胎牛血清和重悬。
- 细胞悬液分装，在 HBSS 让 1: 100 稀释。要确定细胞数目，加载的稀释 10 微升到 Neubauer ' s 分庭。位于倒置显微镜 （20 x 目标与 0.45 NA） 下室的大广场之一的单元格进行计数。
- 重复计数总数的四个大正方形。计算总数的细胞 (N) 为 N = 单元格的平均数目计数总体积稀释 x 10 4 x.
- 离心上清液的样本 200 x g.丢弃在 5 分钟的休息和重悬与冻结溶液浓度为每毫升 10 6 细胞颗粒。
- 悬浮在低温与 10 6 个细胞 （1 毫升） 每瓶分装。低温瓶置于冻结的容器和冻结在-80 ° C.
- 第二天，在液氮中存储低温瓶。
2。进纸器细胞培养
- 1 至 4 天前开始的推导过程，解冻低温每小瓶含 1 x 10 6 灭活 h f F 1 细胞在水浴在 37 ° C.
- 使在解冻的 h f F 1 1:6 稀释预热 DMEM 辅以 10%胎牛血清和保持温度在 37 ° C.
- 填充的预热 0.2%明胶从猪皮 500 微升 4 井板每个井和保持在 37 ° C 10 分钟板
- 从水井中删除明胶 500 微升和添加的 HFFs 稀释 500 µ L。轻轻摇动板以确保 HFFs 井底部均匀分布。避免循环动作，否则细胞将集中在井中心。
- 孵育至少 24 h 在 37 ° C，5%CO 2 获得在每口井的灭活 HFFs 单层板。 第二天，
- （10 X 目标与 0.3 NA） 倒置显微镜下观察细胞和检查，他们附加分布均匀。更改来消除二甲基亚砜遗留的媒介。去除培养基，并添加 500 µ L 的预热 DMEM 辅以 10 %fbs。
3。胚胎收藏与文化
- 四天前胚胎集合管理 5 IU 的怀孕母马 ' 到 6-12 周老雌性小鼠腹腔注射血清促性腺激素 s.
注意： 我们使用女性从 129S2 或 B6CFAF1 株，虽然可以使用从其他小鼠品系的女性。然而，当与女性从非许可菌株 （如 CBA），工作介质中应补充 2i 4.2 步所述。 - 后 48 h，通过腹腔注射，管理 5 IU 人绒毛膜促性腺激素和交配的女性与男性，至少 8 周龄，在 1:1 的比例。女性分开男性第二天。
- 胚胎集合前, 一天准备 35 毫米细胞培养用几个 40 µ L 滴 4 毫克/毫升牛血清白蛋白 (BSA) KSOMaag 培养基的皮氏培养皿和填充板是用矿物油，完全涵盖滴。孵化在 37 ° C，5%CO 2 平衡介质盘。
- 准备胚胎操作移液器，热最细部分的长尖的玻璃巴斯德吸管使用喷灯。一旦软，撤出的火焰，并拉开两个端点。打破它到所需长度。顶端内径应该是 100-150 微米。
- 对雌性小鼠颈椎脱位 45-48 小时 后 coitum (p.c.) 通过实施安乐死。
- 解剖小鼠暴露腹腔内通过削减皮肤与曲线光滑锋利的剪刀和腹膜与直锋利的剪刀。抓住一个子宫钳夹、 切断输卵管用直锋利的剪刀，并将其置于复缓冲 CZB 介质 (HCZB) 13 37 ° C.重复上述过程，删除其他输卵管。 钟表匠钳收集 2-细胞胚胎在地方举办的
- 同花顺 1 毫升注射器与输卵管装有 HCZB.
注： 准备冲洗针取 30 G 皮下注射针头，结束时，切到钝尖上磨料的石头地面。 - 使用嘴移液器装置，拿出胚胎，洗他们的 HCZB 并培养他们在事先准备好的胚胎培养皿在 37 ° C，5%CO 2 至囊胚阶段。50 胚胎可以有多达体外每一 40 µ L 滴。胚胎发育在体视显微镜下每隔 24 小时监视。
注意： 另外，胚胎可以收集在胚泡期缩短 离体 胚培养。在这种情况下，对实施安乐死的女性在一天 3.5-4.5 邮编、 解剖子宫。和用 HCZB 冲洗。
4。干细胞衍生
- 的推导板制备
- 日的胚胎播种，准备推导介质通过补充 DMEM 培养基与 100 µ M 2 β 巯基乙醇，1 x 非必需氨基酸20%的血清替换和 10 3 U/mL LIF。
- 如果需要，还添加 1 µ M 的 MEK 抑制剂 PD0325901 和 3 µ M 的 GSK3 抑制剂 CHIR99021 以获得 2i 媒介。
- 带的灭活 HFFs （步骤 2.6） 从单层 4 井板孵化器。删除介质并将 800 µ L 的预热的推导介质添加到每个井。孵化器返回板。
- 卵透明带去除和胚胎播种
- 准备 35 毫米细胞培养用酸性浸入三 30 微升滴培养皿 ' s 解决方案 14 和推导介质三 30 微升滴。盖与矿物油滴和保持这道菜在 37 ° C.
- 从孵化器采取胚胎培养皿。一个接一个地从文化滴转移囊胚到酸性浸入 ' s 溶液降使用胚胎操作移液管。如果可能的话，选择只扩张囊胚开始的推导过程。 在体视显微镜下的
- 显示器卵透明带消化。尽快卵透明带消失，转，囊胚推导中滴以洗出酸性浸入 ' s 解决方案。
- 以每口井 4 井推导板孵化器和种子一无卵囊胚上料机从细胞。
- 返回的孵化器和文化在 37 ° C，5%CO 2 4 井推导板。
- 监测干细胞生长和介质改变
- 监测文化 （20 X 目标与 0.45 NA） 倒置显微镜下每隔 24 小时。很重要的是要注意是否有迹象表明干细胞分化，如周边产物或甚至推开送纸器细胞的肿胀屈光细胞。
- 每隔一天，改变文化的媒介。4 井板从孵化器，从每个井，去除培养基，并添加 800 µ L 的预热的推导 LIF 和 2i，培养基，如果使用。保持文化，直到植物突起观察 （6-8 天）。
5。干细胞培养和维护
- 准备 · 科列 · 像控点和干细胞操纵式吸液管。遵循步骤 3.4 准备干细胞操纵吸液管内径顶端的 250-300 µ m.使用被拉扯的巴斯德吸管的另一部分准备 · 科列 · 像句柄。热和形状直到获得一个钩子。
- 采取 4 井文化板在孵化器中的，定位在体视显微镜下的产物。使用该句柄推开分化的细胞和环绕副产物馈线。
注意： 避免最终分化的产物，是重要的是从边缘的副产物中移除所有分化的细胞。 - 产物与干细胞操纵吸管吸出并将其放在 50 µ L 胰蛋白酶-EDTA 滴一道新菜。
- 用手术刀，分列其机械和酶切产物中几个部分。
- 马上，将产物片段转移到新鲜滴推导介质来抵消胰蛋白酶行动。
- 将产物片段转移到新 4 孔板与单层馈线。转让每井达 10 碎片和培养他们在 37 ° C，5%CO 2 推导介质。
- 至少六个星期前考虑设立的卓线保持干细胞样文化。更改介质其他亚文化和每天他们一周一次。
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Representative Results
继本议定书中，超过 95%的产物形成应该达到后第一周的文化 (图 1A)。卓系后六通道的建立是变量实验复制，与平均成功的 60-80%之间。2i 的加法不能显著改善结果时使用许可小鼠品系，例如那些与 129S2 的背景，但它是必要的当工作与非许可的菌株。
鼠标按 ESC 殖民地应该与扁平的形状呈现形态规则和定义边缘时培养不治疗 (图 1B-C) 或与 2i 培养 (图 1)。殖民地周边分化症状应丢弃 (图 1E-F)。如果得到的推导效率低于预期值，控制生长的卓殖民地和继代培养他们常常是为了避免过度生长，因为这会导致细胞死亡，并促进分化 (图 1-H)。
图 1： 卓殖民地文化中代表的形象。(A) 产物源自胚泡后第一周的文化 (B、 C) 几个卓殖民地在通道 10 呈现鲜明的边缘和一个扁平的形状。(D) 殖民地从卓行治疗 2i。（E、 F）半分化卓殖民地呈现外围分化迹象 （突出显示与虚线椭圆） 的例子。（G、 H）杂草丛生的卓殖民地表现不好的形态和分化迹象的例子。规模酒吧 =请点击这里查看此图的大版本。 100 µ m。
要验证的假定卓行后六个星期的文化获得细胞，应该评估的多向分化潜能和分化标记存在。卓行应积极为 Oct4、 Sox2 等多向分化潜能标记 (图 2 A-B)。此外后自发分化细胞培养 10 天无饲养层细胞在 DMEM 辅以 10%, 胎牛血清，卓行预计将是积极的外胚层标记 β-微管蛋白类 III (Tuj1) (图 2)，中胚层标记 α-平滑肌肉的肌动蛋白 (αSMA) (图 2D) 和内胚层标记甲胎蛋白 (AFP) (图 2E)。只有行积极评估五个标记应视为真正卓行，因此用于推导效率的计算。通常，这对应于生成使用本议定书的几乎所有卓行。
图 2： 对多向分化潜能和分化标记代表免疫荧光。卓殖民地表示 (A) Oct4 （绿色） (B) 和 Sox2 （红色）。区分卓殖民地表达 (C) Tuj1 （绿色）、 (D) αSMA （绿色） 和 (E) 法新社 （绿色）。所有图像中的核材料被褪色 Hoeschst （蓝色）。规模酒吧 =请点击这里查看此图的大版本。 100 µ m。
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Discussion
虽然卓推导出来的线是广为人知的程序经常使用在许多实验室，其效率并不总是可以打扰全能维护的多因素预期那么高。在本文中我们表明，一步一步走，如何与高效率使用简单和可靠的协议建立卓行。这些效率相近的文献报道。
为了确保最高的效率，是重要的是控制细胞每日或每隔一天，从时间点表示只是说明性。至关重要的是，要避免过度的殖民地，因为这会促进细胞死亡和分化。它也是重要的是在他们的亚文化，殖民地暴露胰蛋白酶-EDTA 尽可能多减少，因为这样还可以减少细胞活力。
另一个关键因素是饲养层细胞的来源和他们的文化。几项研究表明 h f F、 小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 和鼠标 STO 成纤维细胞是同样能够支持 ESC 推导和文化15。然而，h f F 均达到两倍耐用比 MEF 和 STO 在文化16，允许卓成长更多的时间。因此，h f F 的使用避免了额外的卓亚文化。
如果得到的推导效率较低比报告的结果，是重要的是仔细检查的推导中，尤其是血清更换的所有组件。不同批次的血清替代可能会导致在推导效率17，18的显著差异。因此，必须在使用之前测试每个新的批处理。
它是重要的是要指出，作为一个来源为卓推导可以也显著影响推导效率的胚胎的遗传背景。事实上，被分为许可菌株 （如 129S2 和 C57BL6） 和非许可菌株 （如 CBA、 点头和 FVB） 根据自己的能力产生卓行下标准条件9，19的小鼠品系。在这里报道议定书 》 可以被成功应用于胚胎从两种类型的毒株，只要 2i 鸡尾酒包括推导中使用非许可株胚胎时。2i 介质是能够调节卓线保持多向分化潜能，不论遗传背景6的信号模式。主要的限制是，由于期间文化20，获得卓行体外 2i 抗药性分化的强信号模式。为了克服这一局限性，卓行应培养不 2i 为至少一个通道前诱导分化削弱信号的获得。
总体而言，这项工作可以通过简单地指向的主要困难及如何克服这些困难以及尽可能显示步骤缓解卓推导的实践。
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Disclosures
作者没有透露。
Acknowledgments
我们感谢 Jonatan 卢卡斯他与馈线细胞培养，Servei Estabulari de la UAB 为动物保健和 Domènec Martín 为录制视频的技术援助。这项工作得到了 Ministerio 德经济 y 与两性 AGL2014-52408-R 和自治区政府大楼和加泰罗尼亚 2014 SGR 524。MVC 是 PIF UAB 研究金的受益人。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL sryringe | BD | 309628 | |
| 2-β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350-010 | |
| 4-well plate | Thermo Scientific Nunc | 176740 | |
| Acidic Tyrode's solution | Home-made | See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M. | |
| BSA | Sigma | A3311 | |
| Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Molecular Probes - Invitrogen | A-21200 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies. |
| CHIR990212 | Axon Medchem | 1386 | Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
| CryoTube | Thermo Scientific Nunc | 3754518 | |
| DMSO | Sigma | 41640 | |
| DMEM | BioWest | L0107 | |
| FBS | BioWest | S1810 | Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC |
| Flushing needle | BD | 304000 | Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone |
| Gelatin from porcine skin | Fluka | 48724 | Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month. |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594 | Molecular Probes - Invitrogen | A-11037 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody. |
| HBSS | BioWest | L0611 | |
| Hepes-buffered CZB | Home-made | See composition in Chatot et al, 1989 | |
| Human chorionic gonadotropin | Divasa-Farmavic | Veterin-Corion 3000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
| Human foreskin fibroblasts | ATCC | ATCCSCRC-1041 | For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen. |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles. |
| KSOMaag Evolve | Zenith Biotech | ZEKS-050 | Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use. |
| Leukemia Inhibitory Factor | Merk Millipore | ESG1106 | |
| Mice | Charles River/Harlan | It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor. | |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | Embryo tested. Photosensitive. |
| Mitomycin C | Serva | 2980501 | Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer. |
| Mouse anti-tubulin β III (Tuj1) | Biolegend | MMS-435P | 1:500 dilution |
| Mouse monoclonal anti-αSMA | Sigma | A5228 | 1:200 dilution |
| Mouse monoclonal anti-AFP | R&D Systems | MAB1368 | 1:50 dilution |
| Mouse monoclonal anti Oct3/4 | Santa cruz | Sc-5279 | 1:50 dilution |
| Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-035 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | 1408 | Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
| Petri dish (35mm) | Thermo Scientific Nunc | 153066 | |
| Petri dish (60mm) | Thermo Scientific Nunc | 150288 | |
| Pregnant mare's serum gonadotropin | Foligon | Foligon-1000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
| Rabbit policlonal anti-Sox2 | Merck Millipore | AB5603 | 1:200 dilution |
| T75 falcon | Thermo Scientific | 130190 | |
| Trypsin-EDTA 10x | BioWest | X0930 | Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution |
References
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