Summary
Dit artikel beschrijft een protocol om efficiënt ontlenen en cultuur pluripotente stamcellijnen uit muis embryo's in het blastocyst stadium.
Abstract
Muis embryonale stamcellen (mESC) afleiding is het proces door welke pluripotente cellijnen van voor inplanting embryo's zijn gevestigd. Deze lijnen behouden de mogelijkheid om zelf vernieuwen of onderscheid onder bepaalde voorwaarden. Als gevolg van deze eigenschappen, mESC vormen een nuttig instrument in regeneratieve geneeskunde, ziekte modellering en weefsel engineering studies. Dit artikel beschrijft een eenvoudig protocol om te verkrijgen mESC lijnen met hoge afleiding efficiëntie (60-80%) door kweken blastocysten van permissieve muis stammen op feeder cellen in beschreven medium aangevuld met leukemie remmende factor. Het protocol kan ook worden toegepast om efficiënt mESC lijnen ontlenen in niet-tolerante muis stammen, door de eenvoudige toevoeging van een cocktail van twee kleine-molecuul remmers aan het medium van de afleiding (2i medium). Gedetailleerde procedures over de opstelling en de cultuur van feeder cellen, verzameling en cultuur van muis embryo's, en afleiding en de cultuur van mESC lijnen zijn bestemd. Dit protocol vereist geen speciale apparatuur en kan worden uitgevoerd in een laboratorium met eenvoudige zoogdieren cel cultuur expertise.
Introduction
Embryonale stamcellen (ESC) zijn pluripotente cellen, afgeleid van inplanting embryo's, die de mogelijkheid om zelf vernieuwen of onderscheid onder specifieke voorwaarden1te behouden. Op basis van deze eigenschappen, ESC geworden een nuttig hulpmiddel voor regeneratieve geneeskunde, ziekte modellering en weefsel engineering studies2.
ESC waren ontleend voor inplanting muis embryo's, van oorsprong muis ESC (mESC) lijnen met lage succes3,4voor de eerste keer. Jarenlang bleef de efficiëntie van de afleiding laag vanwege de moeilijkheid van het handhaven van pluripotent in vitro. Naast de aanwezigheid van feeder cellen5, die de efficiëntie van de afleiding, kolonie gehechtheid bevorderen, en vergroten van de stabiliteit van de karyotypic6, verschillende wijzigingen van het protocol tot een verbetering in pluripotent onderhoud. De belangrijkste moesten de toevoeging van leukemie Inhibitory Factor (LIF) mESC kweekmedium7,8, het gebruik van embryo's uit de 129S2 tolerante achtergrond9 en de cultuur van mESC met medium aangevuld met gedefinieerd serum, potentiële factoren van de differentiatie10gratis. Recenter, dwingend bewijs blijkt dat toevoeging van een cocktail van twee kleine-molecuul modulatoren van signaalroutes aan het mESC kweekmedium (bekend als 2i) is het beste om pluripotent. De cocktail 2i bestaat uit een combinatie van de MEK-remmer PD0325901, waardoor de differentiatie signalen door remming van het traject van mitogeen-geactiveerd proteïne kinase (MAPK), en de GSK3β-remmer CHIR99021, die overleving van de cel bij lage dichtheid verbetert door het activeren van de Wnt traject11.
In dit artikel beschrijven we een eenvoudig protocol om efficiënt ontlenen muis blastocysten mESC lijnen. We volgen standaardprocedures, kweken van embryo's uit tolerante stammen op feeder cellen in afleiding medium aangevuld met LIF en een serum vervanging12. Na dit protocol, mESC lijnen kan worden afgeleid met efficiëntie gelijkwaardig zijn aan die verkregen in 2i medium. Desondanks kunnen 2i worden toegevoegd om te voorkomen dat eventuele problemen met pluripotent onderhoud of bij het werken met niet-tolerante stammen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
het gebruik van de dieren die zijn beschreven in de onderstaande secties is goedgekeurd door de ethische Commissie op dierlijke en menselijke onderzoek van de Universitat Autònoma de Barcelona en de bestuurlijke gebied d ' Agricultura, Ramaderia, Pesca ik Alimentació van de Generalitat de Catalunya (protocol #8741).
1. feeder cel inactivering en opslag
Opmerking: menselijke voorhuid fibroblasten (HFF-1) werden eerder bevroren in 1 mL van bevriezing oplossing bestaande uit 90% foetale boviene Serum (FBS) en 10% dimethyl sulfoxide () DMSO) en in vloeibare stikstof tot gebruik opgeslagen.
- Ontdooien van een cryogene Injectieflacon van HFF-1 (1 mL) door de ampul in een waterbad 37 ° C onder te dompelen.
- De ontdooide inhoud van de cryogene flacon toevoegen aan voorverwarmde Dulbecco ' s gewijzigd Eagle ' s Medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS te maken van een 1:10 verdunning.
- De verdunde cellen (10 mL) in een maatkolf van T75 zaad en cultuur hen bij 37 ° C en 5% CO 2.
- De volgende dag, wijzigen de middellange tot het elimineren van de overblijfselen van DMSO. Verwijder het medium en voeg toe 10 mL voorverwarmde DMEM aangevuld met 10% FBS.
- De HFFs cultuur en wijzigen van het medium elke 48 uur totdat de cultuur de confluente fase bereikt. Dit kan ongeveer 7 tot 10 dagen duren.
- Bereid de inactivatie-oplossing, mitomycine C in DMEM aangevuld met 10% verdunnen FBS op een eindconcentratie van 10 µg/mL. Incubeer de cellen met de inactivering oplossing gedurende 3 uur bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Verwijderen van de inactivatie-oplossing en spoel de cellen driemaal met 2 mL van Hanks evenwichtig zout oplossing (HBSS) te elimineren mitomycine C restanten.
- Als u wilt loskoppelen van de geïnactiveerd cellen, voeg 1 mL voorverwarmde trypsine-EDTA-oplossing toe en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Observeren de cellen onder een omgekeerde Microscoop om ervoor te zorgen dat ze zijn vrijstaand (10 x doelstelling met 0.3 numerieke diafragma of NB). Als zij niet zijn, incubeer hen voor een paar meer minuten bij 37 ° C en 5% CO 2. Controleer de cellen opnieuw onder de omgekeerde Microscoop.
- De oplossing met een pipet van Pasteur Pipetteer om zich te distantiëren van de cel bosjes.
- De enzymatische oplossing te neutraliseren door toevoeging van DMEM aangevuld met 10% FBS en resuspendeer 4 mL.
- Nemen een aliquoot gedeelte van de celsuspensie en maak een verdunning van 1:100 in HBSS. Om te bepalen van het aantal cellen, 10 µL van de verdunning te laden in een Neubauer ' s kamer. Gelegen in één van de grote pleinen van de kamer onder een omgekeerde Microscoop (20 x doelstelling met een 0,45 nb) cellen tellen.
- Herhalen het tellen in een totaal van vier grote pleinen. Bereken het totale aantal cellen (N) als N = gemiddeld aantal cellen getelde x totale volume x verdunning x 10 4.
- Centrifugeren van de rest van het monster gedurende 5 min. op 200 x g. negeren het supernatant en resuspendeer de pellet met het bevriezen van de oplossing bij een concentratie van 10 6 cellen per mL.
- De schorsing in cryogene flacons met 10 6 cellen (1 mL) elk aliquot. Plaats de cryogene flesjes in een bevriezing container en bevriezen bij -80 ° C.
- De volgende dag, slaan de cryogene flesjes in vloeibare stikstof.
2. De cultuur van de cel van de feeder
- een tot vier dagen vóór het begin van het proces van afleiding, dooi een cryogene flacon met 1 x 10 6 geïnactiveerd HFF-1 cellen in een waterbad bij 37 ° C.
- Maken een verdunning van 1:6 voor de ontdooide HFF-1 in vooraf opgewarmd DMEM aangevuld met 10% FBS en houd de temperatuur bij 37 ° C.
- Vul elk putje van de plaat van een 4-well met 500 µL voorverwarmde 0,2% gelatine van varkens huid en houden de plaat bij 37 ° C gedurende 10 minuten
- Verwijder de 500 µL van gelatine uit de putten en voeg 500 µL van de HFFs-verdunning. Zachtjes rock de plaat om te zorgen voor een gelijkmatige verdeling van de HFFs op de bodem van de putten. Vermijd rondgaande bewegingen, anders zal de cellen zich concentreren in het midden van de put.
- Broeden van de plaat ten minste 24 uur bij 37 ° C en 5% CO 2 te verkrijgen van een monolayer van geïnactiveerd HFFs in elk putje.
- De volgende dag, de cellen onder een omgekeerde Microscoop (10 X doelstelling met 0.3 nb) observeren en controleren of ze zijn aangesloten en homogeen verspreid. Het wijzigen van het medium te elimineren van de overblijfselen van DMSO. Verwijder het medium en voeg toe 500 µL voorverwarmde DMEM aangevuld met 10% FBS.
3. Embryo's worden verzameld en cultuur
- vier dagen voor embryo's worden verzameld, beheren 5 IU van zwangere merrie ' s serum gonadotrofinen door intraperitoneale injectie met 6-12 weken oude vrouwelijke muizen.
Opmerking: We hebben gebruikt vrouwtjes uit de 129S2 of de B6CFAF1 stammen, hoewel vrouwen van andere stammen van de muis kunnen worden gebruikt. Niettemin, wanneer werken met vrouwen van niet-tolerante stammen (bijvoorbeeld CBA) medium moet worden aangevuld met 2i zoals vermeld in stap 4.2. - Na 48 h, 5 IU van humaan choriongonadotrofine beheren door intraperitoneale injectie en mate van de vrouwtjes met mannen, ten minste 8 weken oud zijn, op een 1:1 verhouding. Scheiden de vrouwtjes van de mannetjes's anderendaags.
- De dag vóór de embryo's worden verzameld, bereiden een 35-mm celcultuur petrischaal met enkele 40 µL druppels KSOMaag medium aangevuld met 4 mg/mL bovien serumalbumine (BSA) en vul de plaat met minerale olie aan de druppels volledig te dekken. Incubeer de schotel op 37 ° C en 5% CO 2 aan het medium equilibreer.
- Te bereiden embryo manipulatie pipetten, verwarm het dunnere deel van een lang-tipped glas Pasteur Pipetteer met behulp van een bunsenbrander. Zodra zacht, het opzeggen van de vlam en de twee uiteinden uit elkaar trekken. Breken op de gewenste lengte. De inwendige diameter aan het uiteinde moet 100-150 µm.
- De vrouwelijke muizen door cervicale dislocatie 45-48 h post coitum (in pct.) euthanaseren.
- Ontleden de muizen om de buikholte door het snijden van de huid met een gebogen goede scherpe schaar en het buikvlies met rechte scherpe schaar bloot te stellen. Pak een baarmoeder met een tang, afgesneden van het oviduct met behulp van rechte scherpe schaar, en plaats deze in Hepes-buffer CZB medium (HCZB) 13 bij 37 ° C. Herhaal het proces voor het verwijderen van de andere oviduct.
- Flush de oviducts met een spuit van 1 mL met HCZB geladen op zijn plaats gehouden door horlogemaker pincet voor het verzamelen van de embryo 2-cel.
Opmerking: Om te bereiden de afboekingsmethode naald nemen een 30 G hypodermische naald, knippen het einde, en tot een botte uiteinde op een schurende steen. - Met behulp van de mond Pipetteer apparatuur, halen de embryo's, was ze in HCZB en cultuur hen in de schotel cultuur eerder bereid embryo bij 37 ° C en 5% CO 2 tot het blastocyst-stadium. Maximaal 50 embryo's kunnen worden gekweekt in elke 40 µL daling. Controleren van embryo-ontwikkeling elke 24 uur onder een stereomicroscoop.
Opmerking: U kunt ook embryo's kunnen worden verzameld in het blastocyst stadium te verkorten in vitro embryocultuur. In dit geval, de vrouwtjes euthanaseren ten dage 3,5-4,5 pct., ontleden van de baarmoeder. en spoel het met HCZB.
4. Afleiding van de cel van de stam
- voorbereiding van de afleiding-platen
- op de dag van het embryo zaaien, bereiden het medium afleiding door aanvulling DMEM medium met 100 µM 2-β-mercaptoethanol, 1 x niet-essentiële aminozuren , 20% van serum vervanging, en 10 3 U/mL LIF.
- Indien gewenst ook toevoegen 1 µM van de MEK-remmer PD0325901 en 3 µM van de GSK3 remmer CHIR99021 te verkrijgen van een medium 2i.
- Nemen de 4-well plaat met de enkelgelaagde van geïnactiveerd HFFs (stap 2.6) van de Incubator. Verwijder het medium en 800 µL voorverwarmde afleiding medium toevoegen aan elk putje. De plaat terug te keren naar de incubator.
- Zona zitten verwijdering en embryo zaaien
- bereiden een 35 mm-celkweek petrischaal met drie 30 µL druppels van zure Tyrode ' s oplossing 14 en drie 30 µL druppels van afleiding medium. Dekking van de druppels met minerale olie en houd de schotel bij 37 ° C.
- Nemen de embryo cultuur schotel uit de incubator. Één voor één, de blastocysten van de cultuur-druppels overbrengen naar een zure Tyrode ' s voor een daling van de oplossing met behulp van een precisiepipet embryo manipulatie. Indien mogelijk, selecteert u alleen de uitgebreide blastocysten voor voorsprong naar de procédé afleiding.
- Volgen de spijsvertering van de zona zitten onder de stereomicroscoop. Zodra de zona zitten verdwijnt, overbrengen in de blastocyst een afleiding middellange druppel om te wassen de zure Tyrode ' s oplossing.
- Nemen de plaat 4-well afleiding uit de incubator en seed een zona-vrije blastocyst op de feeder cellen in elk putje.
- De 4-well afleiding plaat terug te keren naar de couveuse en cultuur bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Monitoring stamcel groei en medium wijzigen
- volgen de culturen elke 24 uur onder een omgekeerde Microscoop (20 X doelstelling met 0,45 nb). Het is belangrijk op te merken of er zijn tekenen van stamcel differentiatie, zoals gezwollen refractieve cellen rondom de uitgroei of zelfs duwen de feeder cellen opzij.
- Om de andere dag, wijzigt het medium van de cultuur. Neem de plaat 4-well uit de incubator, het medium verwijderen uit elk putje en toevoegen van 800 µL voorverwarmde afleiding medium aangevuld met LIF en 2i, als gebruikt. De cultuur handhaven totdat uitwassen worden waargenomen (6-8 dagen).
5. Cultuur van de cel van de stam en onderhoud
- voorbereiden Kolle-achtige handgrepen en stamcel manipulatie pipetten. Volg stap 3.4 ter voorbereiding van de stamcel manipulatie pipetten met een inwendige diameter op het puntje van 250-300 µm. gebruik het andere deel van de getrokken Pipet van Pasteur te bereiden handgreepsteun Kolle-achtige. Warmte en vorm het tot het verkrijgen van een haak.
- Nemen de plaat 4-well cultuur uit de incubator en zoek de uitgroei onder een stereomicroscoop. Gebruik de hendel weg te duwen de gedifferentieerde cellen en de feeders die de uitgroei omringen.
Opmerking: Om te voorkomen dat een eventuele differentiatie van de uitgroei, het is belangrijk om alle gedifferentieerde cellen van de rand van de uitgroei. - Gecombineerd de uitgroei met een stamcel manipulatie pipet en plaats deze in een nieuwe schotel een daling van 50 µL trypsine-EDTA.
- Gebruik van een scalpel te snijden de uitgroei in verschillende delen om het gedesag, zowel mechanisch als enzymatisch.
- Breng meteen, de uitgroei fragmenten in een verse daling van afleiding medium te neutraliseren trypsine actie.
- De uitgroei fragmenten overbrengen in een nieuwe 4-well-plaat met een enkelgelaagde van feeders. Overdracht van maximaal 10 fragmenten per putje en cultuur ze met afleiding medium bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Onderhouden de stamcel-achtige culturen voor ten minste zes weken alvorens de regel van de mESC opgericht. Het medium wijzigen elke andere dag en subcultuur hen wekelijks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Naar aanleiding van dit protocol, meer dan 95% van de uitgroei vorming moet gebeuren na de eerste week van de cultuur (figuur 1A). Vestiging van mESC lijnen na zes passages is variabel van experimentele replicaat-organismen, met een gemiddelde succes van 60-80%. De toevoeging van 2i aanzienlijk verbetert niet de resultaten bij het werken met tolerante muis stammen, zoals die met een 129S2 achtergrond, maar het is noodzakelijk bij het werken met niet-tolerante stammen.
Muis ESC kolonies dient een regelmatige morfologie met een platte vorm en gedefinieerd randen wanneer gekweekt zonder behandeling (figuur 1B-C) of gekweekt met 2i (Figuur 1 d). Kolonies voorstellende perifere differentiatie tekenen moeten worden verwijderd (figuur 1E-F). Als de efficiëntie van de afleiding verkregen lager dan de verwachte waarden zijn, bepalen de groei van mESC kolonies en subcultuur hen meer vaak Voorkom begroeiing, aangezien dit leiden celdood tot kan en bevorderlijk is voor differentiatie (figuur 1G-H).
Figuur 1 : Representatief beelden van mESC kolonies in cultuur. (A) uitgroei afgeleid van een blastocyst na de eerste week van cultuur (B, C) verschillende mESC kolonies bij passage 10 voorstellende gedefinieerde randen en een platte vorm. (D) kolonies van mESC lijnen met 2i behandeld. (E, F) Voorbeelden van semi-gedifferentieerde mESC kolonies perifere differentiatie tekenen (gemarkeerd met een onderbroken ellipsen) presenteren. (G, H) Voorbeelden van overwoekerd mESC kolonies presenteren een slecht morfologie en differentiatie tekenen. Schaal bars = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Om te controleren of de stemness van de lijnen van de vermeende mESC verkregen na zes weken van de cultuur, moet de aanwezigheid van markeringen pluripotent en differentiatie worden beoordeeld. De mESC lijnen moet positief voor pluripotent markeringen zoals Oct4 en Sox2 (Figuur 2 A-B). Bovendien na de inductie van spontane differentiatie door de cellen te kweken voor 10 dagen zonder feeder cellen in DMEM aangevuld met 10% FBS, mESC lijnen worden verwacht als positief voor de ectoderm marker β-tubuline klasse III (Tuj1) (figuur 2C), het mesoderm marker α-Smooth Muscle actine (αSMA) (figuur 2D) en de endoderm markering Alpha-Fetoprotein (AFP) (figuur 2E). Alleen de lijnen positief voor de vijf markeringen die beoordeeld moeten worden beschouwd als ware mESC lijnen en dus gebruikt voor de berekening van de efficiëntie van de afleiding. Meestal komt dit overeen met vrijwel alle mESC regels gegenereerd met behulp van dit protocol.
Figuur 2 : Representatief immunofluorescentie tegen markeringen pluripotent en differentiatie. mESC kolonies uitdrukken (A) Oct4 (groen) (B) en Sox2 (rood). Gedifferentieerde mESC kolonies uitdrukken (C) Tuj1 (groen), (D) αSMA (groen) en (E) AFP (groen). In alle afbeeldingen is het nucleaire materiaal counterstained met Hoeschst (blauw). Schaal bars = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MESC lijn afleiding is een bekende procedure routinematig gebruikt in veel laboratoria, is de doeltreffendheid ervan niet altijd zo hoog zoals verwacht als gevolg van meerdere factoren die pluripotent onderhoud kan verstoren. In dit artikel tonen we stap voor stap hoe om mESC lijnen met hoge rendementen met behulp van een eenvoudige en betrouwbare protocol. Deze efficiëntie zijn vergelijkbaar met die in de literatuur gemeld.
Om ervoor te zorgen maximale efficiëntie, is het belangrijk om te controleren de cellen dagelijks of om de andere dag, sinds de tijd aangegeven punten zijn alleen illustratief. Het is essentieel om te voorkomen dat de overmatige groei van kolonies, aangezien dit celdood en differentiatie bevordert. Het is ook belangrijk om zo veel mogelijk de blootstelling van de koloniën aan trypsine-EDTA tijdens hun subcultuur, omdat dit ook de levensvatbaarheid van de cellen kan aantasten.
Een andere cruciale factor is de bron van de feeder cellen en hun cultuur. Verschillende studies hebben aangetoond dat HFF, muis embryonale fibroblasten (MEF) en muis STO fibroblasten even kunnen ter ondersteuning van ESC afleiding en cultuur15. HFF zijn echter tot twee keer duurzamer dan MEF en STO in cultuur16, waardoor meer tijd voor de mESC om te groeien. Dus, het gebruik van HFF vermijdt extra mESC subculturen.
Als de efficiëntie van de afleiding verkregen lager dan de resultaten gemeld zijn, is het belangrijk om zorgvuldig controleren van alle onderdelen van het medium van afleiding, vooral serum vervanging. Verschillende batches instellen van serum vervanging kunnen leiden tot aanzienlijke verschillen in de afleiding efficiëntie17,18. Daarom moet elke nieuwe partij voor het gebruik ervan worden getest.
Het is belangrijk erop te wijzen dat de genetische achtergrond van de embryo's gebruikt als een bron voor mESC afleiding kan ook grote invloed op de efficiëntie van de afleiding. Inderdaad, muis stammen zijn ingedeeld in tolerante stammen (zoals 129S2 en C57BL6) en niet-tolerante stammen (zoals CBA, knik en FVB) volgens hun vermogen om opbrengst mESC lijnen onder standaardomstandigheden9,19. Het protocol hier gemeld kan worden toegepast op embryo's van beide soorten stammen, zolang de 2i cocktail is opgenomen in het medium van de afleiding bij het werken met embryo's bij niet-tolerante stammen. Het medium 2i vermag moduleren van de signalering patroon van mESC lijnen te handhaven pluripotent, ongeacht de genetische achtergrond6. De belangrijkste beperking is dat, als gevolg van de sterke signalering patroon opgedane cultuur20, mESC lijnen gekweekte in 2i resistent geworden voor differentiatie. Om deze beperking ondervangen moeten mESC lijnen zonder 2i voor ten minste één passage voordat de inductie van differentiatie te verzwakken de signalering verworven worden gekweekt.
Globaal, dit werk kan verlichten de praktijk van mESC afleiding door aan te tonen de stappen zo eenvoudig mogelijk en wijzend op de belangrijkste problemen en hoe om ze te overwinnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Jonatan Lucas voor zijn technische bijstand met feeder celcultuur, à Estabulari de la UAB voor verzorging van de dieren en Domènec Martín voor het vastleggen van de video. Dit werk werd ondersteund door Ministerio de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R en de Generalitat de Catalunya 2014 SGR-524. MVC is een begunstigde van een PIF-UAB fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL sryringe | BD | 309628 | |
| 2-β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350-010 | |
| 4-well plate | Thermo Scientific Nunc | 176740 | |
| Acidic Tyrode's solution | Home-made | See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M. | |
| BSA | Sigma | A3311 | |
| Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Molecular Probes - Invitrogen | A-21200 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies. |
| CHIR990212 | Axon Medchem | 1386 | Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
| CryoTube | Thermo Scientific Nunc | 3754518 | |
| DMSO | Sigma | 41640 | |
| DMEM | BioWest | L0107 | |
| FBS | BioWest | S1810 | Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC |
| Flushing needle | BD | 304000 | Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone |
| Gelatin from porcine skin | Fluka | 48724 | Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month. |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594 | Molecular Probes - Invitrogen | A-11037 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody. |
| HBSS | BioWest | L0611 | |
| Hepes-buffered CZB | Home-made | See composition in Chatot et al, 1989 | |
| Human chorionic gonadotropin | Divasa-Farmavic | Veterin-Corion 3000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
| Human foreskin fibroblasts | ATCC | ATCCSCRC-1041 | For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen. |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles. |
| KSOMaag Evolve | Zenith Biotech | ZEKS-050 | Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use. |
| Leukemia Inhibitory Factor | Merk Millipore | ESG1106 | |
| Mice | Charles River/Harlan | It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor. | |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | Embryo tested. Photosensitive. |
| Mitomycin C | Serva | 2980501 | Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer. |
| Mouse anti-tubulin β III (Tuj1) | Biolegend | MMS-435P | 1:500 dilution |
| Mouse monoclonal anti-αSMA | Sigma | A5228 | 1:200 dilution |
| Mouse monoclonal anti-AFP | R&D Systems | MAB1368 | 1:50 dilution |
| Mouse monoclonal anti Oct3/4 | Santa cruz | Sc-5279 | 1:50 dilution |
| Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-035 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | 1408 | Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
| Petri dish (35mm) | Thermo Scientific Nunc | 153066 | |
| Petri dish (60mm) | Thermo Scientific Nunc | 150288 | |
| Pregnant mare's serum gonadotropin | Foligon | Foligon-1000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
| Rabbit policlonal anti-Sox2 | Merck Millipore | AB5603 | 1:200 dilution |
| T75 falcon | Thermo Scientific | 130190 | |
| Trypsin-EDTA 10x | BioWest | X0930 | Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution |
References
- Biswas, A., Hutchins, R.
- Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. PNAS. 72 (4), 1441-1445 (1976).
- Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nat Prot. 9 (3), 559-574 (2014).
- Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336 (6200), 688-690 (1988).
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
- Brook, F. A., Gardner, R. L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proc Nat Acad Sci U S A. 94 (11), 5709-5712 (1997).
- Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer. Lab Invest. 82 (12), 1765-1767 (2002).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Wakayama, S., et al. Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies. Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).
- Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).
- Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Lab Press. New York. (2003).
- Lee, K. H. Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture. Pluripotent Stem Cells. , 85-115 (2013).
- Ma, Y., et al. Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res Ther. 3 (29), (2012).
- Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).
- Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells. Cytotechnology. 58 (3), 173-179 (2008).
- Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines. Int. J. Dev. Biol. 38 (2), 385-390 (1994).
- Gonzalez, J. M., et al. Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency. Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).
