Ableitung von Stammzelllinien aus Präimplantations Mausembryonen

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, um effizient leiten und Kultur pluripotenten Stammzelllinien aus Maus-Embryonen im Blastozystenstadium.

Zusammenfassung

Maus embryonalen Stammzellen (mESC) Ableitung ist der Prozess, durch welche, den pluripotenten Zelllinien aus preimplantation Embryos ansässig sind. Diese Zeilen erhalten die Möglichkeit, entweder selbst zu erneuern oder unter bestimmten Bedingungen zu unterscheiden. Aufgrund dieser Eigenschaften mESC sind ein nützliches Werkzeug in der regenerativen Medizin, Krankheit Modellierung und Gewebe Ingenieurstudium. Dieser Artikel beschreibt ein einfaches Protokoll mESC Linien mit hoher Ableitung Wirkungsgraden (60-80 %) erhalten durch Kultivierung Blastozysten von freizügigen Mausstämme Feeder-Zellen in definierten Mediums mit Leukämie hemmenden Faktor ergänzt. Das Protokoll kann auch angewendet werden um effizient mESC Linien nicht freizügig Mausstämme, abgeleitet durch die einfache Zugabe von einem Cocktail aus zwei kleine Molekül-Inhibitoren auf die Ableitung Medium (2i Medium). Einzelheiten über die Vorbereitung und die Kultur der Feeder-Zellen, Sammlung und Maus-Embryonen und Ableitung und Kultur mESC Linien stehen zur Verfügung. Dieses Protokoll erfordert keine speziellen Ausrüstung und kann in jedem Labor mit grundlegenden Säugerzelle Kultur Expertise durchgeführt werden.

Einleitung

Embryonale Stammzellen (ESC) sind pluripotente Zellen aus Präimplantations Embryonen, die behalten die Fähigkeit, selbst zu erneuern oder unter bestimmten Bedingungen¹zu unterscheiden. Basierend auf diesen Eigenschaften, ESC sind ein nützliches Werkzeug für die regenerative Medizin, Krankheit Modellierung und Tissue engineering Studium²geworden.

ESC wurden zum ersten Mal von Präimplantationsdiagnostik Mäuseembryonen, mit ESC (mESC) Mauslinien mit geringen Erfolg^3,4Ursprung abgeleitet. Jahrelang blieb der Herleitung Wirkungsgrad niedrig....

Protokoll

die Verwendung von Tieren, die in den folgenden Abschnitten beschriebenen genehmigt wurde, durch die Ethikkommission für Tier- und Human Research von der Universitat Autònoma de Barcelona und Handelsverträge d ' Agricultura, Ramaderia, Pesca ich Alimentació von der Generalitat de Catalunya (Protokoll #8741).

1. Feeder Zelle Inaktivierung und Lagerung

Hinweis: menschliche Vorhaut Fibroblasten (HFF-1) in 1 mL eiskalte Lösung bestehend aus 90 % fetalen Bovine Serum (FBS) und 10 % Dimethyl Sulfoxid (vorher eingefroren wurden DMSO) und in flüssigem Stickstoff bis zum Gebrauch gespeichert.

1. Auftauen ein....

Ergebnisse

Nach diesem Protokoll sollte mehr als 95 % der Auswuchs Bildung nach der ersten Woche der Kultur (Abbildung 1A) erreicht werden. MESC Linien nach sechs Passagen sind Variable unter experimentellen Wiederholungen mit eine durchschnittliche Erfolgsquote von 60-80 %. Die Zugabe von 2i deutlich verbessert nicht die Ergebnisse bei der Arbeit mit freizügigen Mausstämme, z. B. mit einem 129S2 Hintergrund, aber es ist notwendig, bei der Arbeit mit nicht-freizügigen S.......

Diskussion

Obwohl mESC Linie Ableitung ein bekannter Verfahren routinemäßig in vielen Laboratorien eingesetzt wird, ist der Wirkungsgrad nicht immer so hoch wie erwartet aufgrund der multiplen Faktoren, die Aufrechterhaltung der Pluripotenz stören können. In diesem Artikel zeigen wir Schritt für Schritt, wie man mESC Linien mit hohen Wirkungsgraden über ein einfaches und zuverlässiges Protokoll zu etablieren. Diese Effizienz sind ähnlich denen in der Literatur beschrieben.

Um maximale Effizienz zu gewähr.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 mL Sryring	BD
2-β-mercaptoethanol	Life Technologies	31350-010
4-Well-Platte	Thermo Scientific Nunc	176740
Saure Tyrodenlösung	Hausgemacht		Siehe Rezept in Nagy et al., 2003. Für die kurzfristige Lagerung (bis zu 1 Monat) halten Sie es bei 4 °C. Alternativ können Sie es für die Langzeitlagerung bei -20 °C aufbewahren. Wenn die Wirksamkeit der Lösung abnimmt, sollte sie durch Zugabe eines kleinen Tropfens HCl 1M angesäuert werden.
BSA	Sigma	A3311
Hühner-Anti-Maus-IgG, Alexa Fluor 488	Molekulare Sonden - Invitrogen	A-21200	1:500 Verdünnung. Sekundärer Antikörper für Oct4, Tuj1, αSMA- und AFP-Maus-Antikörper.
CHIR990212	Axon Medchem	1386	Rekonstituieren Sie mit 2,15 ml DMSO pro mg Pulver, um eine 1 mM Stammlösung zu erhalten. Aliquotieren Sie das gewünschte Volumen und lagern Sie es bei -20 °C. Vermeiden Sie Gefrier- und Auftauzyklen.
CryoTube	Thermo Scientific Nunc	3754518
DMSO	Sigma	41640
DMEM	BioWest	L0107
FBS	BioWest	S1810	Vor Gebrauch durch Erhitzen für 30 Minuten bei 56°C inaktivieren. Aliquotieren und bei -20°C lagern; C
Spülnadel	BD	304000	Das Ende der Nadel abschneiden und auf einem Schleifstein bis zur stumpfen Spitze zerkleinern
Gelatine aus Schweinehaut	Fluka	48724	Bei 0,2 % in destilliertem Wasser verdünnen und autoklavieren. Jede Verdünnung kann einen Monat lang verwendet werden.
Ziege Anti-Kaninchen IgG, Alexa Fluor 594	Molekularsonden - Invitrogen	A-11037	1:500 Verdünnung. Sekundärer Antikörper für Sox2-Kaninchen-Antikörper.
HBSS	BioWest	L0611
Hepes-gepuffert CZB	Hausgemacht		Siehe Zusammensetzung in Chatot et al., 1989
Humanes Choriongonadotropin	Divasa-Farmavic	Veterin-Corion 3000 UI	Verdünnt in NaCl 0,9% bei 50 IE/ml. Aliquotieren Sie es in 1 ml und lagern Sie es bei -20μg; C für bis zu zwei Monate. Nach dem Auftauen nicht wieder einfrieren.
Humane Vorhautfibroblasten	ATCC	ATCCSCRC-1041	Für die Langzeitlagerung wird empfohlen, sie in flüssigem Stickstoff zu lagern.
KnockOut Serum Replacement	Life Technologien	10828-028	Lichtempfindlich. Es wird empfohlen, es in kleinen Volumina wie 10 ml zu aliquotieren und bei -20° ordm zu lagern; C (Überprüfen Sie das Ablaufdatum). Vermeiden Sie Frost- und Auftauzyklen.
KSOMaag Evolve	Zenith Biotech	ZEKS-050	Supplement mit 4 mg/ml BSA. Äquilibrieren bei 37° ordm; C und 5% CO2 pro Tag vor der Anwendung.
Leukämie-Hemmfaktor	Merk Millipore	ESG1106
Mäuse	Charles River/Harlan		Es wird empfohlen, Mäuse aus einem permissiven Stamm in Bezug auf die mESC-Ableitung (z. B. 129S2 oder C57BL) zu verwenden. Inzuchtstämme sind jedoch weniger effizient bei der Produktion von Embryonen. Daher wird empfohlen, einen Hybridstamm wie 129S2 x C57BL oder B6CBAF1 zu verwenden, um die Vorteile der Hybridkraft zu nutzen.
Mineralöl	Sigma	M8410	Embryo getestet. Lichtempfindlich.
Mitomycin C	Serva	2980501	Rekonstituieren Sie das Pulver mit MilliQ Wasser in einer Menge von 0,5 mg/ml. Bei 4 μm lagern; C vor Licht geschützt. Achtung, es ist schädlich und steht im Verdacht, Krebs zu verursachen.
Maus Anti-Tubulin Β III (Tuj1)	Biolegend	MMS-435P	1:500 Verdünnung
Maus monoklonal anti-αSMA	Sigma	A5228	1:200 Verdünnung
Maus monoklonal anti-AFP	R& D Systems	MAB1368	1:50 Verdünnung
Maus monoklonal anti Oct3/4	Santa Cruz	Sc-5279	1:50 Verdünnung
Nicht-essentielle Aminosäuren	Life Technologies	11140-035
PD0325901	Axon Medchem	1408	Rekonstituieren Sie mit 2,08 ml DMSO pro mg Pulver, um eine 1 mM Stammlösung zu erhalten. Aliquotieren Sie das gewünschte Volumen und lagern Sie es bei -20 °C. Vermeiden Sie Gefrier- und Auftauzyklen.
Petrischale (35 mm)	Thermo Scientific Nunc	153066
Petrischale (60 mm)	Thermo Scientific Nunc	150288
Serum für trächtige Stuten Gonadotropin	Foligon	Foligon-1000 UI	In NaCl 0,9 % bei 50 I.E./ml verdünnen. Aliquotieren Sie es in 1 ml und lagern Sie es bei -20 I.E.; C für bis zu zwei Monate. Nach dem Auftauen nicht wieder einfrieren.
Kaninchen poliklonales Anti-Sox2	Merck Millipore	AB5603	1:200 Verdünnung
T75 Falke	Thermo Scientific	130190
Trypsin-EDTA 10x	BioWest	X0930	1:10 in HBSS verdünnen, um eine 1x Lösung zu erhalten

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