Summary
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, um effizient leiten und Kultur pluripotenten Stammzelllinien aus Maus-Embryonen im Blastozystenstadium.
Abstract
Maus embryonalen Stammzellen (mESC) Ableitung ist der Prozess, durch welche, den pluripotenten Zelllinien aus preimplantation Embryos ansässig sind. Diese Zeilen erhalten die Möglichkeit, entweder selbst zu erneuern oder unter bestimmten Bedingungen zu unterscheiden. Aufgrund dieser Eigenschaften mESC sind ein nützliches Werkzeug in der regenerativen Medizin, Krankheit Modellierung und Gewebe Ingenieurstudium. Dieser Artikel beschreibt ein einfaches Protokoll mESC Linien mit hoher Ableitung Wirkungsgraden (60-80 %) erhalten durch Kultivierung Blastozysten von freizügigen Mausstämme Feeder-Zellen in definierten Mediums mit Leukämie hemmenden Faktor ergänzt. Das Protokoll kann auch angewendet werden um effizient mESC Linien nicht freizügig Mausstämme, abgeleitet durch die einfache Zugabe von einem Cocktail aus zwei kleine Molekül-Inhibitoren auf die Ableitung Medium (2i Medium). Einzelheiten über die Vorbereitung und die Kultur der Feeder-Zellen, Sammlung und Maus-Embryonen und Ableitung und Kultur mESC Linien stehen zur Verfügung. Dieses Protokoll erfordert keine speziellen Ausrüstung und kann in jedem Labor mit grundlegenden Säugerzelle Kultur Expertise durchgeführt werden.
Introduction
Embryonale Stammzellen (ESC) sind pluripotente Zellen aus Präimplantations Embryonen, die behalten die Fähigkeit, selbst zu erneuern oder unter bestimmten Bedingungen1zu unterscheiden. Basierend auf diesen Eigenschaften, ESC sind ein nützliches Werkzeug für die regenerative Medizin, Krankheit Modellierung und Tissue engineering Studium2geworden.
ESC wurden zum ersten Mal von Präimplantationsdiagnostik Mäuseembryonen, mit ESC (mESC) Mauslinien mit geringen Erfolg3,4Ursprung abgeleitet. Jahrelang blieb der Herleitung Wirkungsgrad niedrig wegen der Schwierigkeit der Aufrechterhaltung der Pluripotenz in Vitro. Außerdem das Vorhandensein von Feeder Zellen5, die Ableitung effizienter zu gestalten, Kolonie Anlage fördern und verbessern karyotypic Stabilität6, einige Modifikationen von den Protokoll führen zu einer Verbesserung der Pluripotenz Wartung. Die wichtigsten waren die Zugabe von Leukämie hemmenden Faktor (LIF), mESC Kulturmedium7,8, die Verwendung von Embryonen aus dem 129S2 permissive Hintergrund9 und die Kultur der mESC mit Medium ergänzt mit definierten Serum, frei von möglichen Differenzierung Faktoren10. Vor kurzem hat zwingende Beweise gezeigt, dass Zusatz von einem Cocktail aus zwei kleinen Molekül-Modulatoren der Signalwege, die mESC Kulturmedium (bekannt als 2i) am besten, Pluripotenz beizubehalten. Die 2i cocktail besteht aus einer Kombination von MEK-Inhibitor PD0325901, die die Differenzierung Signale reduziert durch die Hemmung des Mitogen-activated Protein Kinase (MAPK) Weges, und der GSK3β-Inhibitor CHIR99021, die Zelle Überleben bei geringer Dichte verbessert durch die Aktivierung der Wnt-Signalweg-11.
In diesem Artikel beschreiben wir ein einfaches Protokoll um effizient mESC Linien von Maus Blastozysten abzuleiten. Wir folgen Standardverfahren, Kultivierung der Embryonen von freizügigen Belastungen für Feeder-Zellen in Ableitung Medium mit LIF und ein Serum-Ersatz-12ergänzt. Nach diesem Protokoll mESC Linien kann mit Wirkungsgraden Äquivalent zu denen, die in 2i Medium abgeleitet werden. Trotzdem können 2i hinzugefügt werden, um mögliche Probleme mit Pluripotenz Wartung oder beim Arbeiten mit nicht-freizügigen Belastungen zu vermeiden.
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Protocol
die Verwendung von Tieren, die in den folgenden Abschnitten beschriebenen genehmigt wurde, durch die Ethikkommission für Tier- und Human Research von der Universitat Autònoma de Barcelona und Handelsverträge d ' Agricultura, Ramaderia, Pesca ich Alimentació von der Generalitat de Catalunya (Protokoll #8741).
1. Feeder Zelle Inaktivierung und Lagerung
Hinweis: menschliche Vorhaut Fibroblasten (HFF-1) in 1 mL eiskalte Lösung bestehend aus 90 % fetalen Bovine Serum (FBS) und 10 % Dimethyl Sulfoxid (vorher eingefroren wurden DMSO) und in flüssigem Stickstoff bis zum Gebrauch gespeichert.
- Auftauen eine kryogene Phiole der HFF-1 (1 mL) durch das Fläschchen in einem 37 ° C Wasserbad eintauchen.
- Vorgewärmt Dulbecco den aufgetauten Inhalt der kryogenen Durchstechflasche hinzufügen ' s Modified Eagle ' s Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % FBS zu einem 01:10 Verdünnung.
- Saatgut die verdünnten Zellen (10 mL) in einem T75 Kolben und Kultur sie bei 37 ° C und 5 % CO 2.
- Am nächsten Tag ändern das Medium, die DMSO-Reste zu beseitigen. Entfernen Sie das Medium und 10 mL vorgewärmten DMEM mit 10 % ergänzt FBS.
- Kultur der HFFs und das Medium alle 48 h verändern, bis die Kultur der konfluierende Stadium erreicht. Dies dauert etwa 7 bis 10 Tage.
- , Bereiten Sie die Inaktivierung Lösung verdünnen Mitomycin C in DMEM mit 10 % ergänzt FBS auf eine Endkonzentration von 10 µg/mL. Inkubation der Zellen mit der Inaktivierung Lösung für 3 h bei 37 ° C und 5 % CO 2.
- Die Inaktivierung Lösung entfernen und spülen Sie die Zellen dreimal mit 2 mL von Hanks ausgewogen Salz Lösung (HBSS), Mitomycin C Reste zu beseitigen.
- Um die inaktivierten Zellen zu entfernen, fügen Sie 1 mL vorgewärmten Trypsin-EDTA-Lösung und inkubieren Sie für 5 min bei 37 ° C und 5 % CO 2.
- Beobachten die Zellen unter einem inversen Mikroskop um sicherzustellen, dass sie getrennt (10 X Objektiv mit 0,3 numerische Apertur oder NA). Wenn sie nicht sind, brüten sie für ein paar Minuten bei 37 ° C und 5 % CO 2. Überprüfen Sie die Zellen wieder unter die inversen Mikroskop.
- Die Lösung mit einer Pasteurpipette pipette, um die Zelle Klumpen zu distanzieren.
- Neutralisieren die enzymatische Lösung durch Zugabe von 4 mL DMEM mit 10 % FBS und Aufschwemmen ergänzt.
- Ein Aliquot der Zellsuspension und machen eine 1: 100 Verdünnung in HBSS. Um die Anzahl der Zellen zu bestimmen, laden 10 µL der Verdünnung in einer Neubauer ' s-Kammer. Zählen der Zellen in einer der großen Plätze der Kammer unter einem inversen Mikroskop (20 X Objektiv mit einem 0,45 NA).
- Wiederholung die Zählung in insgesamt vier große Quadrate. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen (N) n = durchschnittliche Anzahl von Zellen gezählt x Gesamtvolumen x Verdünnung X 10 4.
- Zentrifugieren dem Rest der Probe für 5 min bei 200 X g. verwerfen den Überstand und Aufschwemmen der Pellets mit dem Einfrieren Lösung mit einer Konzentration von 10 6 Zellen pro mL.
- Aliquot Suspension in kryogenen Fläschchen mit 10 6 Zellen (1 mL) jeder. Die kryogenen Fläschchen in einem eiskalten Behälter legen und Einfrieren bei-80 ° c
- Am nächsten Tag speichern die kryogenen Fläschchen in Flüssigstickstoff.
2. Feeder-Zellkultur
- bis zu vier Tage vor der Ableitung, Tauwetter eine kryogene Fläschchen mit 1 x 10 6 inaktiviert HFF-1-Zellen in einem Wasserbad bei 37 ° c
- Stellen eine Verdünnung von 1:6 des aufgetauten HFF-1 in DMEM ergänzt mit 10 % FBS und halten die Temperatur bei 37 vorgewärmt ° c
- Jeder Brunnen ein 4-Well-Platte mit 500 µL vorgewärmten 0,2 % Gelatine aus Schweinehaut füllen und halten Sie die Platte bei 37 ° C für 10 min.
- 500 µL von Gelatine aus den Brunnen zu entfernen und fügen Sie 500 µL HFFs-Verdünnung. Schütteln Sie die Platte, um eine gleichmäßige Verteilung des HFFs auf der Unterseite der Brunnen zu gewährleisten. Vermeiden Sie Kreisbewegungen, sonst werden die Zellen in der Mitte des Brunnens konzentrieren.
- Inkubieren die Platte mindestens 24 h bei 37 ° C und 5 % CO 2 eine Monolage von inaktivierten HFFs in jede Vertiefung erhalten.
- Am nächsten Tag die Zellen unter einem inversen Mikroskop (10 X-Objektiv mit 0,3 NA) beobachten und überprüfen, dass sie befestigt und homogen verteilt. Ändern Sie das Medium, um die DMSO-Reste zu beseitigen. Entfernen Sie das Medium und fügen 500 µL vorgewärmten DMEM mit 10 % ergänzt FBS.
3. Embryo-Sammlung und Kultur
- vier Tage vor dem Embryo Sammlung verwalten 5 IU trächtige Stute ' s Serum Gonadotropin durch intraperitoneale Injektion, 6-12 Wochen alten weiblichen Mäusen.
Hinweis: Wir haben Weibchen aus dem 129S2 oder B6CFAF1 Stämme verwendet, obwohl Weibchen aus anderen Mausstämme verwendet werden können. Dennoch, wenn arbeiten mit Weibchen aus non-permissive Stämme (z. B. CBA), Medium sollte ergänzt werden mit 2i wie unter Schritt 4.2. - Nach 48 h, 5 IE humanes Choriongonadotropin durch intraperitoneale Injektion verabreichen und paaren sich die Weibchen mit Männchen, mindestens 8 Wochen alt, im Verhältnis 1:1. Die Weibchen von den Männchen am nächsten Tag trennen.
- Am Vortag Embryo Sammlung, vorbereiten eine 35-mm-Zellkultur Petrischale mit mehreren 40 µL Tropfen des KSOMaag Mediums ergänzt mit 4 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA) und füllen die Platte mit Mineralöl, die Tropfen in vollem Umfang abdecken. Inkubieren Sie die Schüssel bei 37 ° C und 5 % CO 2 auf das Medium equilibrate.
- Embryo Manipulation Pipetten, Vorbereitung erhitzen den dünneren Teil eines langen Spitzen Glases Pasteurpipette mit dem Bunsenbrenner. Sobald weich, die Flamme entziehen Sie und ziehen Sie die beiden Enden auseinander. Brechen sie auf die gewünschte Länge. Der innere Durchmesser an der Spitze sollte 100-150 µm.
- Einschläfern der weiblichen Mäusen durch zervikale Dislokation 45-48 h Post Coitum (p.c.).
- Sezieren die Mäuse um die Bauchhöhle verfügbar machen, indem die Haut mit einer gebogenen glatt scharfen Schere und das Bauchfell mit gerade scharfen Schere schneiden. Eine Gebärmutter mit Zange greifen, die Eileiter mit gerade scharfen Schere abgeschnitten und legen Sie sie in Hepes gepufferten CZB Medium (HCZB) 13 bei 37 ° c wiederholen Sie den Vorgang, der andere Eileiter entfernen.
- Flush die Eileiter mit einer 1 mL Spritze mit HCZB geladen gehalten von Uhrmacher-Pinzette, die 2 Zellen Embryonen zu sammeln.
Hinweis: Um der Spülung Nadel nehmen eine 30 G Injektionsnadel vorzubereiten, schneiden Sie das Ende und zu einer stumpfen Spitze auf einem Schleifstein geschliffen. - Mit der Mund-Pipette-Apparat, die Embryonen abholen, waschen Sie sie in HCZB und Kultur sie in der Kulturschale vorbereitete Embryo bei 37 ° C und 5 % CO 2 bis zum Blastozystenstadium. Bis zu 50 Embryonen können in jedem Tropfen 40 µL kultiviert werden. Überwachen der Embryonalentwicklung alle 24 h unter einem Stereomikroskop.
Hinweis: Alternativ können Embryonen im Blastozystenstadium in Vitro Embryonenkultur verkürzen gesammelt werden. In diesem Fall einschläfern Sie den Weibchen am Tag 3,5-4,5 p.c., sezieren Sie die Gebärmutter zu. und spülen Sie es mit HCZB.
4. Stem Cell Ableitung
- Vorbereitung der Ableitung Platten
- am Tag der Embryo Aussaat, bereiten die Ableitung Medium durch Ergänzung DMEM Medium mit 100 µM 2-β-Mercaptoethanol, 1 x nicht-essentiellen Aminosäuren , 20 % der Serum-Ersatz und 10 3 U/mL LIF.
- Auf Wunsch auch hinzufügen 1 µM von der MEK-Inhibitor PD0325901 und 3 µM GSK3-Inhibitor CHIR99021 2i Medium zu erhalten.
- Nehmen die 4-Well-Platte mit der Monolage von inaktivierten HFFs (Schritt 2,6) von der Inkubator. Entfernen Sie das Medium und jedes gut fügen Sie 800 µL vorgewärmten Ableitung Medium hinzu. Die Platte in den Inkubator zurück.
- Zona Pellucida Entfernung und Embryo Aussaat
- Vorbereitung eine 35 mm-Zellkultur Petrischale mit drei 30 µL Tropfen der sauren Tyrode ' s Lösung 14 und drei 30 µL Tropfen Ableitung Medium. Decken die Tropfen mit Mineralöl und halten Sie die Schüssel bei 37 ° c
- Nehmen die Embryo-Kulturschale aus dem Inkubator. Eins nach dem anderen, übertragen die Blastozysten von Kultur-Tropfen auf einen sauren Tyrode ' s Lösung Tropfen mit einem Embryo Manipulation Pipette. Wenn möglich, wählen Sie nur die erweiterte Blastozysten um die Ableitung zu starten.
- Überwachen die Zona Pellucida Verdauung unter dem Stereomikroskop. Sobald die Zona Pellucida verschwindet, übertragen die Blastozyste zu einer Ableitung Mittel um die sauren Tyrode auszuwaschen ' s Lösung.
- Nehmen die Ableitung 4-Well Platte aus Inkubator und Samen einer Zona-freie Blastozyste auf die Zuführung Zellen in jedem Bohrloch.
- Rückkehr die Ableitung 4-Well-Platte zum Inkubator und Kultur bei 37 ° C und 5 % CO 2.
- Monitoring Stammzellen Wachstum und Medium ändern
- Kulturen alle 24 h unter einem inversen Mikroskop (20 X Objektiv mit 0,45 NA) zu überwachen. Es ist wichtig zu beachten, ob es Anzeichen von Stammzell-Differenzierung, z. B. geschwollenen refraktiven Zellen rund um den Auswuchs oder sogar schieben die Zuführung Zellen beiseite.
- Jeden zweiten Tag, das Medium der Kultur verändern. Nehmen Sie die 4-Well-Platte aus dem Inkubator, entfernen Sie das Medium aus jedem Bohrloch und fügen Sie 800 µL vorgewärmten Ableitung Medium ergänzt mit LIF und 2i, hinzu, wenn verwendet. Pflegen die Kultur bis Auswüchse (6-8 Tage) eingehalten werden.
5. Stammzelle-Kultur und Wartung
- Prepare Kolle-ähnliche Griffe und Stammzellen Manipulation Pipetten. Folgen Sie Schritt 3.4 vorzubereitende Stammzell-Manipulation Pipetten mit einem Innendurchmesser an der Spitze von 250-300 µm. verwenden andererseits zog Pasteurpipette Kolle-ähnlichen Griff vorzubereiten. Erhitzen und gestalten Sie es bis zum Erreichen eines Hakens.
- Kultur 4-Well-Platte aus dem Inkubator nehmen und zu den Auswuchs unter einem Stereomikroskop suchen. Verwenden Sie den Griff um die differenzierte Zellen und die Anleger, die den Auswuchs umgeben wegzudrücken.
Hinweis: Zur Vermeidung von eventuellen Differenzierung der Auswuchs ist es wichtig, die differenzierte Zellen vom Rand der Auswuchs entfernen. - Auswuchs mit einer Stammzelle Manipulation Pipette abzusaugen und legen Sie sie in ein neues Gericht in einem 50 µL Trypsin-EDTA Tropfen.
- Verwenden ein Skalpell zu den Auswuchs in mehrere Teile geschnitten, um es sowohl mechanisch als auch enzymatisch disaggregieren.
- Sofort, übertragen die Auswuchs Fragmente zu einem frischen Tropfen Ableitung Medium Trypsin Aktion neutralisieren.
- Übertragen die Auswuchs Fragmente auf einen neuen 4-Well-Platte mit einem monomolekularen Film Feeder. Übertragen Sie bis zu 10 Fragmente pro Bohrloch und Kultur sie mit Ableitung Medium bei 37 ° C und 5 % CO 2.
- Pflegen die Stammzell-ähnliche Kulturen für mindestens sechs Wochen vor der Prüfung der mESC-Linie gegründet. Das Medium verändern, jeden anderen Tag und Subkultur ihnen einmal pro Woche.
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Representative Results
Nach diesem Protokoll sollte mehr als 95 % der Auswuchs Bildung nach der ersten Woche der Kultur (Abbildung 1A) erreicht werden. MESC Linien nach sechs Passagen sind Variable unter experimentellen Wiederholungen mit eine durchschnittliche Erfolgsquote von 60-80 %. Die Zugabe von 2i deutlich verbessert nicht die Ergebnisse bei der Arbeit mit freizügigen Mausstämme, z. B. mit einem 129S2 Hintergrund, aber es ist notwendig, bei der Arbeit mit nicht-freizügigen Stämme.
Maus-ESC Kolonien sollte eine regelmäßige Morphologie mit einer flachen Form präsentieren und definierten Rändern, wenn ohne Behandlung (Abbildung 1 b-C) kultiviert oder mit 2i kultiviert (Abbildung 1). Kolonien präsentiert peripheren Differenzierung Zeichen sein sollte verworfen (Abb. 1E-F). Wenn die Ableitung Wirkungsgrade erzielt niedriger als die erwarteten Werte sind, Steuern Sie dem Wachstum der mESC Kolonien und Subkultur mehr oft um übermäßiges Wachstum, zu vermeiden, da dies dazu führen, Zelltod dass kann und fördere Differenzierung (Abbildung 1-H).
Abbildung 1 : Repräsentative Bilder mESC Kolonien in der Kultur. (A) Auswuchs einer Blastozyste abgeleitet, nach die erste Woche der Kultur (B, C) mehrere mESC Kolonien am Durchgang 10 Präsentation definierten Kanten und eine flache Form. (D) Kolonien von mESC Linien mit 2i behandelt. (E, F) Beispiele für semi-differenzierte mESC Kolonien peripheren Differenzierung Zeichen (markiert mit gestrichelten Ellipsen) präsentiert. (G, H) Beispiele der überwucherten mESC Kolonien präsentiert eine schlechte Morphologie und Differenzierung Zeichen. Skalieren von Balken = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Überprüfen Sie die Stemness der vermeintlichen mESC Linien nach sechs Wochen der Kultur erhalten, sollten die Anwesenheit der Pluripotenz und Differenzierung Marker bewertet werden. Die mESC Linien für Pluripotenz Marker wie Oct4 und Sox2 positiv sein sollte (Abbildung 2 A-B). Darüber hinaus nach Induktion der spontanen Differenzierung durch Kultivierung der Zellen für 10 Tage ohne Feeder-Zellen in DMEM mit 10 % ergänzt FBS, mESC Linien werden voraussichtlich positiv für das Ektoderm Marker β-Tubulin Klasse III (Tuj1) (Abbildung 2), Das Mesoderm Marker α-glatte Muskel Aktin (αSMA) (Abb. 2D) und dem Entoderm Marker Alpha-Fetoprotein (AFP) (Abb. 2E). Nur die Zeilen für die fünf Marker bewertet positiv sollte als wahre mESC Linien und somit für die Berechnung des Wirkungsgrades Ableitung verwendet. Dies entspricht in der Regel nahezu alle mESC-Linien, die mit diesem Protokoll generiert.
Abbildung 2 : Repräsentative Immunfluoreszenz gegen Pluripotenz und Differenzierung Marker. mESC Kolonien mit dem Ausdruck (A) Oct4 (grün) (B) und Sox2 (rot). Differenzierte mESC Kolonien (C) Tuj1 (grün), (D) αSMA (grün) und (E) AFP (grün) zum Ausdruck bringt. In allen Bildern ist das Kernmaterial mit Hoeschst (blau) counterstained. Skalieren von Balken = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Obwohl mESC Linie Ableitung ein bekannter Verfahren routinemäßig in vielen Laboratorien eingesetzt wird, ist der Wirkungsgrad nicht immer so hoch wie erwartet aufgrund der multiplen Faktoren, die Aufrechterhaltung der Pluripotenz stören können. In diesem Artikel zeigen wir Schritt für Schritt, wie man mESC Linien mit hohen Wirkungsgraden über ein einfaches und zuverlässiges Protokoll zu etablieren. Diese Effizienz sind ähnlich denen in der Literatur beschrieben.
Um maximale Effizienz zu gewährleisten, ist es wichtig, die Zellen täglich kontrollieren oder jeden zweiten Tag, seit der Zeit genannten Punkte sind nur beispielhaft. Es ist unbedingt zu vermeiden die Überwucherung der Kolonien, da das Absterben von Zellen und Differenzierung fördert. Es ist auch wichtig, so viel wie möglich die Belichtung der Kolonien zu Trypsin-EDTA während ihrer Subkultur zu reduzieren, weil dies auch Zellviabilität reduzieren kann.
Ein weiterer entscheidender Faktor ist die Quelle der Feeder-Zellen und ihrer Kultur. Mehrere Studien haben gezeigt, dass HFF, Maus embryonalen Fibroblasten (MEF) und Maus STO Fibroblasten ebenso ESC Ableitung und Kultur15unterstützen können. HFF sind jedoch bis zu zwei Mal haltbarer als MEF und STO in Kultur16, sodass mehr Zeit für die mESC zu wachsen. So vermeidet die Verwendung von HFF zusätzliche mESC Subkulturen.
Wenn die Ableitung Wirkungsgrade erzielt niedriger als die Ergebnisse gemeldet sind, ist es wichtig, alle Komponenten des Mediums Ableitung, vor allem Serum Ersatz sorgfältig zu prüfen. Verschiedene Chargen Serum Ersatz führt zu signifikanten Unterschiede in der Ableitung Effizienz17,18. Daher muss jede neue Charge vor der Verwendung überprüft werden.
Es ist wichtig darauf hinzuweisen, dass den genetischen Hintergrund der Embryonen verwendet, da eine Quelle für mESC Ableitung die Ableitung Effizienz auch erheblich beeinträchtigen kann. In der Tat sind Mausstämme in freizügigen Stämme (z. B. 129S2 und C57BL6) und non-permissive Stämme (z. B. CBA, NOD und FVB) nach ihrer Fähigkeit zur mESC Linien unter Standardbedingungen9,19Ausbeute eingestuft worden. Das Protokoll hier berichtet kann erfolgreich auf Embryonen aus beiden Arten von Belastungen angewendet werden, solange die 2i cocktail Mittel-und Ableitung enthalten ist, bei der Arbeit mit Embryonen aus non-permissive Stämme. Das 2i Medium ist in der Lage, die Signalisierung Linienmuster mESC Pluripotenz, unabhängig von der genetischen Hintergrund6zu modulieren. Die wichtigste Einschränkung ist, dass aufgrund der starken Signalisierung Muster während Kultur20, mESC Linien im 2i resistent gegen Differenzierung erworben. Um diese Einschränkung zu umgehen, sollten mESC Linien ohne 2i für mindestens einen Gang vor der Induktion der Differenzierung, Schwächen die Signalisierung erworben kultiviert werden.
Insgesamt kann diese Arbeit die Praxis der mESC Ableitung zu erleichtern, zeigt die Schritte so einfach wie möglich und zeigt die größten Schwierigkeiten und wie man sie überwinden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Jonatan Lucas für seine technische Unterstützung mit Feeder-Zellkultur, Servei Estabulari De La UAB für Tierpflege und Domènec Martín für die Videoaufnahme. Diese Arbeit wurde unterstützt vom Ministerio de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R und Generalitat de Catalunya 2014 SGR-524. MVC ist ein PIF-UAB-Stipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL sryringe | BD | 309628 | |
| 2-β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350-010 | |
| 4-well plate | Thermo Scientific Nunc | 176740 | |
| Acidic Tyrode's solution | Home-made | See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M. | |
| BSA | Sigma | A3311 | |
| Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Molecular Probes - Invitrogen | A-21200 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies. |
| CHIR990212 | Axon Medchem | 1386 | Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
| CryoTube | Thermo Scientific Nunc | 3754518 | |
| DMSO | Sigma | 41640 | |
| DMEM | BioWest | L0107 | |
| FBS | BioWest | S1810 | Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC |
| Flushing needle | BD | 304000 | Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone |
| Gelatin from porcine skin | Fluka | 48724 | Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month. |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594 | Molecular Probes - Invitrogen | A-11037 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody. |
| HBSS | BioWest | L0611 | |
| Hepes-buffered CZB | Home-made | See composition in Chatot et al, 1989 | |
| Human chorionic gonadotropin | Divasa-Farmavic | Veterin-Corion 3000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
| Human foreskin fibroblasts | ATCC | ATCCSCRC-1041 | For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen. |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles. |
| KSOMaag Evolve | Zenith Biotech | ZEKS-050 | Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use. |
| Leukemia Inhibitory Factor | Merk Millipore | ESG1106 | |
| Mice | Charles River/Harlan | It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor. | |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | Embryo tested. Photosensitive. |
| Mitomycin C | Serva | 2980501 | Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer. |
| Mouse anti-tubulin β III (Tuj1) | Biolegend | MMS-435P | 1:500 dilution |
| Mouse monoclonal anti-αSMA | Sigma | A5228 | 1:200 dilution |
| Mouse monoclonal anti-AFP | R&D Systems | MAB1368 | 1:50 dilution |
| Mouse monoclonal anti Oct3/4 | Santa cruz | Sc-5279 | 1:50 dilution |
| Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-035 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | 1408 | Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
| Petri dish (35mm) | Thermo Scientific Nunc | 153066 | |
| Petri dish (60mm) | Thermo Scientific Nunc | 150288 | |
| Pregnant mare's serum gonadotropin | Foligon | Foligon-1000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
| Rabbit policlonal anti-Sox2 | Merck Millipore | AB5603 | 1:200 dilution |
| T75 falcon | Thermo Scientific | 130190 | |
| Trypsin-EDTA 10x | BioWest | X0930 | Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution |
References
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