Summary
이 문서는 효율적으로 파생 하 고 만능 마우스 배아 줄기 세포 라인 blastocyst 단계에서 문화 프로토콜을 설명 합니다.
Abstract
마우스 배아 줄기 세포 (mESC) 파생은 만능 세포는 preimplantation 배아에서 설립 하는 과정입니다. 이 라인 자동 갱신 또는 특정 조건 하에서 분화 하는 능력을 유지 합니다. 이러한 속성으로 인해 mESC은 재생 의학, 질병 모델링 및 조직 공학 연구에 유용한 도구입니다. 이 문서는 피더 세포 백혈병 금지 요인으로 보충 하는 정의 된 매체에에 허용 마우스 긴장에서 blastocysts 경작 여 mESC 라인 높은 파생 효율성 (60-80%)을 얻기 위해 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜 파생 매체 (2i 매체)에 두 개의 작은 분자 억제제의 칵테일의 간단한 추가 의해 효율적으로 mESC 라인 비 허용 마우스 긴장에서 파생에 적용할 수 있습니다. 자세한 절차 준비 및 피더 세포, 수집 및 마우스 배아, 그리고 파생의 문화와 mESC 라인의 문화 문화에 제공 됩니다. 이 프로토콜 특수 장비가 필요 하지 않습니다 하 고 기본적인 포유류 세포 문화 전문 지식 가진 어떤 실험실에서 실시 될 수 있습니다.
Introduction
배아 줄기 세포 (ESC)는 만능 세포 자체 갱신 또는 특정 조건1에서 차별화 수 유지 preimplantation 배아에서 파생 된. 이러한 속성을 바탕으로, ESC 재생 의학, 질병 모델링 및 조직 공학 연구2에 대 한 유용한 도구가 되고있다.
ESC는 preimplantation 마우스 배아, 발생 하는 낮은 성공3,4마우스 ESC (mESC) 라인에서에서 처음으로 파생 되었다. 년, 파생 효율 낮은 pluripotency 시험관을 유지의 어려움 때문에 남아 있었다. 게다가 피더 세포5, 파생 효율성을 높여주는 존재 식민지 첨부 하 고 karyotypic 안정성6, 프로토콜 이어질 pluripotency 유지 보수 개선의 몇 가지 수정을 강화 합니다. 가장 중요 한 추가 백혈병 금지 요인 (LIF)의 mESC 문화 매체7,8, 129S2 허용 배경9 에서 배아의 사용 그리고 보충 매체와 mESC의 문화 정의 혈 청, 잠재적인 차별화 요인10의 무료. 더 최근에, 강력한 증거는 보이지 mESC 배양 (2i 라고도 함)에 신호 통로의 2 개의 작은 분자 변조기의 칵테일의 pluripotency를 유지 하기 위해 최고의. 칵테일 2i MEK 억제제 물질 활성화 한 단백질 키 니 아 제 (MAPK) 통로 억제 함으로써 차별화 신호를 감소, PD0325901 및 GSK3β 억제 물 CHIR99021, 낮은 농도에서 세포 생존을 향상의 조합 구성 Wnt 통로11활성화 하 여
현재 문서에서 우리는 효율적으로 mESC 라인 마우스 blastocysts에서 파생 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 파생 매체 LIF와 혈 청 교체12보충에 피더 세포에 관대 한 긴장에서 배아를 배양 표준 절차를 따릅니다. 이 프로토콜, mESC 라인 효율성 2i 매체에서 그에 해당 된 파생 수 있습니다. 도 불구 하 고, 2i는 문제를 방지 하려면 가능한 pluripotency 유지 관리 또는 작업 비 관대 한 긴장을 할 때 추가할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
동물 및 Universitat Autònoma de 바르셀로나의 인간의 연구 윤리 위원회 및 Departament d 아래 섹션에서 설명 하는 동물의 사용 승인 되었습니다 ' 농업, Ramaderia, 낚시 나 Generalitat 드 Catalunya (프로토콜 #8741)의 Alimentació.
1. 피더 셀 비활성화 및 스토리지
참고: 인간의 포 피 섬유 아 세포 (HFF-1) 이전 90% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 10% 디 메 틸 sulfoxide (구성 된 냉동 솔루션의 1 mL에 냉동 DMSO) 사용까지 액체 질소에 저장.
- 37 ° C 물 욕조에 유리병을 immersing 하 여 HFF-1 (1 mL)의 극저온 유리병을 녹여.
- 미리 데워 진된 Dulbecco에 극저온 유리병의 해 동된 내용을 추가 ' s 수정이 글 ' s 매체 (DMEM) 10% 보충 FBS를 1:10 희석.
- T75 플라스 크에 희석된 세포 (10 mL) 씨 하 고 37 ° C, 5% CO 2 문화.
- 다음날, DMSO 잔재를 제거 하는 매체를 변경 합니다. 매체를 제거 하 고 10% 보충 미리 따뜻하게 DMEM의 10 mL를 추가할 FBS.
- 는 HFFs 문화 고 문화 confluent 단계를 도달할 때까지 모든 48 h 매체를 변경 합니다. 약 7 ~ 10 일 걸릴 수 있습니다.
- 비활성화 솔루션을 준비, 미토마이신 C DMEM 10% 보충에 희석 FBS 10 µ g/mL의 최종 농도에. 37 ° C, 5% CO 2 3 h에 대 한 비활성화 솔루션 셀을 품 어.
- 비활성화 솔루션을 제거 하 고 몇 번이 고 2 mL의 행 크 스 균형 소금 솔루션 (HBSS) 미토마이신 C 잔해 제거와 셀 린스.
- 사 세포를 분리, 미리 데워 진된 트립 신-EDTA 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO 2 5 분 동안 품 어.
- 관찰 들은 분리 되도록 거꾸로 현미경 세포 (0.3 수 가늠 구멍 또는 나 10 배 목표). 없는 경우, 37 ° C, 5% CO 2에서 몇 분 더 그들을 품 어. 다시 거꾸로 현미경 세포 검사.
- 셀 덩어리를 분리 하기 위해 파스퇴르 피 펫과 솔루션을 플라스틱.
- DMEM 10 %FBS resuspend 보충의 4 mL를 추가 하 여 효소 솔루션을 무력화.
- 세포 현 탁 액의 약 수를 받아 고 HBSS에 1: 100 희석. 셀의 수를 확인 하려면 로드 희석의 10 µ L를 Neubauer ' s 챔버. 거꾸로 현미경 (20 x 목표와 0.45 나) 챔버의 큰 사각형 중 하나에 있는 셀.
- 4 큰 사각형의 총에서 계산 반복
- . N으로 세포 (N)의 총 수를 계산 셀의 평균 수 = 총 볼륨 희석 x 10 4 x x 계산.
2. 피더 세포 배양
- 파생 프로세스를 시작 하기 전에 1-4 일 재개 1 x 10 6을 포함 하는 극저온 유리병 비활성화 HFF-1 셀 37에서 물 욕조에 ° c.
- 확인에 해 동된 HFF-1의 1:6 희석 사전 예 열 10 %FBS 37에 온도 유지 보완 DMEM ° c.
- 돼지 피부에서 미리 데워 0.2% 젤라틴의 500 µ L 4-잘 접시의 모든 잘을 10 분 동안 37 ° C에서 접시를 유지
- 우물에서 젤라틴의 500 µ L을 제거 하 고 HFFs 희석의 500 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 우물의 바닥에 HFFs의 균일 분배를 보장 하기 위해 접시 바위. 원형 움직임을 피하, 그렇지 않으면 셀 우물의 센터에 집중 합니다.
- 접시 적어도 24 h에 각 잘 사 HFFs의 단층을 37 ° C, 5% CO 2를 품 어.
- 다음날, 거꾸로 현미경 (10 X 목표와 0.3 나) 세포를 관찰 하 고 그들이 부착 되 고 균질 분산을 확인. DMSO 잔재를 제거 하는 매체를 변경 합니다. 매체를 제거 하 고 추가 10% 보충 미리 따뜻하게 DMEM의 500 µ L FBS.
3. 배아 수집 및 문화
- 4 일전 배아 컬렉션 관리 5 IU 임신 암 말의 ' s 6-12 주 오래 된 여성 쥐에 복 주사에 의해 혈 청 생식 샘 자극 호르몬.
참고: 다른 마우스 긴장에서 여성 사용할 수 있습니다 129S2 또는 B6CFAF1 긴장, 여성 사용 했습니다. 그럼에도 불구 하 고 때 매체 (예: CBA), 비-허용 긴장에서 여성 협력 한다으로 보충 2i 단계 4.2에서에서 설명 했 듯이. - 후 48 h, 복 주입, 인간 융 생식 샘 자극 호르몬의 5 IU를 관리 하 고 남성, 적어도 8 주 오래 된, 1:1 비율로 여성 친구. 다음 날은 남성에서 여성을 분리.
- 배아 컬렉션, 전날 35 m m 세포 배양 4 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 보충 KSOMaag 매체의 여러 40 µ L 방울과 페 트리 접시를 준비 하 고 완벽 하 게 커버를 미네랄 오일 접시를 채우십시오. Equilibrate 매체를 37 ° C, 5% CO 2 접시를 품 어.
- 배아 조작 펫을 준비 하 긴 밀고 유리 분 젠 버너를 사용 하 여 파스퇴르 피 펫의 얇은 부분을 열. 일단 부드러운, 불꽃에서 그것을 철회 하 고 떨어져 두 끝을 당겨. 원하는 길이에 그것을 휴식. 끝에 내경 100-150 µ m 이어야 한다.
- 경부 전위 45-48 h 게시물-coitum (컴퓨터)에 의해 여성 쥐를 안락사.
- 절단 곡선 부드럽게 날카로운가 위 피부 및 똑 바른 날카로운가 위 복 하 여 복 부 구멍을 노출 하는 쥐를 해 부. 집게와 함께 한 자 궁을 잡아, 바로 날카로운가 위를 사용 하 여 수 란 관을 잘라 고에 Hepes 버퍼 CZB 매체 (HCZB) 13 37 ° C. 반복 다른 수 란 관을 제거 하는 과정.
- 1 mL 주사기 oviducts 로드 HCZB 플러시 시계 집게 2 셀 배아를 수집 하 여 장소에서 개최.
참고: 준비 물 내리는 바늘 걸릴 30 G 피하 주사, 결국, 잘라내어 거칠 돌에 무뚝뚝한 끝을. - 입 피 펫 장치를 사용 하 여, 배아를 선택, HCZB에 그들을 씻어 및 blastocyst 단계까지 37 ° C, 5% CO 2 이전 준비 배아 문화 접시에 그들을 문화. 50 배아까지 각 40 µ L 드롭에서 경작 될 수 있습니다. 배아 개발은 stereomicroscope 아래 모든 24 시간 모니터링.
참고: 또는, 배아 수집할 수 있습니다 체 외에서 배아 문화 단축 blastocyst 단계에서. 이 경우에, 3.5-4.5 시공 하루에 암컷을 안락사, 자 궁 해 부. HCZB와 플러시.
4. 줄기 세포 파생
- 배아 시드, 당일
- 파생 판의 준비
- 100 µ M 2 β mercaptoethanol, 1과 DMEM 매체를 보완 하 여 파생 매체 준비 비-필수 아미노산 x 혈 청 교체, 및 10의 20 3 U/mL LIF.
- 원하는 경우 또한 MEK 억제제 PD0325901의 1 개의 µ M와 3 추가 GSK3 억제제 2i 매체를 CHIR99021의 µ M.
- 걸릴에서 사 HFFs (단계 2.6)의 단층와 함께 4-잘 접시는 인큐베이터입니다. 매체를 제거 하 고 각 음을 미리 데워 파생 매체의 800 µ L를 추가 합니다. 인큐베이터에 접시를 반환.
- Zona pellucida 제거 및 배아 시드
- 35 m m 세포 배양 신랄 한 Tyrode의 3 개의 30 µ L 방울과 페 트리 접시를 준비 ' 파생 매체의 s 솔루션 14 및 3 개의 30 µ L. 미네랄 오일 방울을 커버 하 고 37에서 요리를 계속 ° c.
- 는 인큐베이터에서 배아 문화 접시를 가져가 라. 하나, 산 성 Tyrode에 문화 상품에서 전송 된 blastocysts ' s 솔루션 드롭 배아 조작 피 펫을 사용 하 여. 만약에 가능 하다 면, 유도 과정을 시작 하려면만 확장 된 blastocysts 선택.
- 는 Zona pellucida 소화는 stereomicroscope에서 모니터링합니다. 최대한 빨리 zona pellucida 사라집니다, 파생 매체 드롭 산 성 Tyrode에 밖으로 세척 하기 위하여는 blastocyst 전송 ' s 솔루션.
- 각 우물에는 인큐베이터와 씨 한 zona 무료 blastocyst 급지대에서 4-잘 파생 판 셀 걸릴.
- 인큐베이터와 37 ° C, 5% CO 2 문화 4-잘 파생 판 돌아갑니다.
- 모니터링 줄기 세포 성장 및 매체 변경
- 문화는 거꾸로 한 현미경 (20 X 목표와 0.45 나) 아래 모든 24 시간 모니터링. 부 어 굴절 세포 파생물을 둘러싼 또는 심지어 추진 피더 세포 옆으로 등 줄기 세포 분화의 흔적 인지 주의 하는 것이 중요 하다.
- 다른 매일 문화 매체를 변경 합니다. 인큐베이터에서 4-잘 접시를가지고, 각 우물에서 매체를 제거 하 고 사용 하는 경우 미리 따뜻하게 파생 매체 LIF와 2i, 보충의 800 µ L를 추가 합니다. 문화 outgrowths (6-8 일)을 관찰 하는 때까지 유지.
5. 줄기 세포 배양 및 유지 보수
- 준비 Kolle 같은 핸들 및 줄기 세포 조작 펫. 따라 단계 내경 250-300 µ m. 끝으로 줄기 세포 조작 펫을 준비 하는 3.4 Kolle 같은 핸들을 준비 하 당겨진된 파스퇴르 피 펫의 다른 부분을 사용 합니다. 열 및 후크를 얻기까지 모양.
- 는 인큐베이터에서 4-잘 문화 접시 고 아래는 stereomicroscope 파생물을 찾습니다. 핸들을 사용 하 여 차별화 된 세포와 지류 파생물을 둘러싸고 멀리 밀어.
참고: 파생물의 최종 분화를 피하기 위해, 그것은 파생물의 가장자리에서 모든 분화 된 세포를 제거 하는 것이 중요. - 줄기 세포 조작 피 펫으로 파생물을 발음 하 고 50 µ L 트립 신-EDTA 드롭에서 새로운 접시에 놓습니다.
- 메스를 사용 하 여 기계적으로 그리고 효소 그것을 세분화 하기 위해 여러 부분에서 가지를 잘라.
- 바로, 트립 신 행동을 무력화 파생 매체의 신선한 드롭으로 파생물 조각을 전송.
- 지류의 단층으로 새로운 4-잘 접시에 파생물 조각 전송합니다. 잘 당 최대 10 조각을 전송 하 고 37 ° C, 5% CO 2 파생 매체와 문화.
- 는 MESC 라인 설립을 고려 하기 전에 적어도 6 주 동안 줄기 세포와 같은 문화를 유지 합니다. 모든 다른 하루와 서브 컬쳐 매체를 변경 그들 일주일에 한 번.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 프로토콜에 따라 이상 파생물 형성의 95% 달성 되어야 문화 (그림 1A)의 첫 번째 주 후. 6 구절 후 mESC 라인의 설립의 60-80% 평균 성공 실험적인 복제 사이 변수 이다. 2i 추가 크게 개선 되지 않습니다 결과 허용 마우스 변종, 129S2 배경 등을 작업할 때 하지만 작업 비 관대 한 긴장을 할 때 필요 합니다.
마우스 ESC 식민지 평면 모양으로 일반 형태를 제시 해야 하 고 치료 (그림 1B-C) 없이 교양 때 가장자리를 정의 또는 2i와 교양 (그림 1D). 식민지 제시 주변 차별화 표시 되어야 합니다 (그림 1E-F) 삭제. 얻은 파생 효율성 예상 값 보다 낮은 경우에, 제어 mESC 식민지 및 2 차 배양의 성장 그들을 더 자주 피하려고 자라 난,이 세포 죽음을 일으킬 수와 차별화 (그림 1G-H)를 홍보 것입니다.
그림 1 : 문화에서 mESC 식민지의 대표 이미지. (A) 파생물의 첫 주 문화 (B, C) 여러 mESC 식민지 통로 10 제시 정의 된 가장자리와 평면 모양 후는 blastocyst에서 파생 된. 2i mESC 라인에서 (D) 식민지 취급. (E, F) 반 차별 mESC 식민지 주변 분화 징후 (파선된 타원으로 강조)를 제시의 예. (G, H) 나쁜 형태와 차별화의 징후를 제시 하는 자란된 mESC 식민지의 예. 바 규모 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
문화의 6 주 후 얻은 putative mESC 라인의 stemness를 확인 하려면 pluripotency와 분화 마커의 존재를 평가 한다. MESC 라인 Oct4, Sox2 등 pluripotency 표식에 대 한 긍정적인 되어야 합니다 (그림 2 A-B). 또한, 셀 피더 셀 DMEM 10% 보충 없이 10 일 동안 배양 하 여 자발적인 분화의 유도 후 FBS, mESC 라인 ectoderm 마커 β-tubulin 클래스 III (Tuj1)에 대 한 긍정적인 것으로 예상 된다 (그림 2C), mesoderm 마커 α-부드러운 근육 걸 (αSMA) (그림 2D) 그리고 endoderm 마커 Alpha-Fetoprotein (AFP) (그림 2E). 평가 5 표식에 대 한 긍정적인 줄만 진정한 mESC 라인 간주 하 고 따라서 파생 효율의 계산에 사용 해야 합니다. 일반적으로,이 현재 프로토콜을 사용 하 여 생성 하는 거의 모든 mESC 라인에 해당 합니다.
그림 2 : Pluripotency와 차별화 표식에 대 한 대표적인 면역 형광. mESC 식민지 (B)을 표현 (녹색) (A) Oct4, Sox2 (빨간색). (C) Tuj1 (녹색), (D) αSMA (녹색) 및 (E) AFP (녹색) 표현 mESC 식민지 분화. 모든 이미지에 핵 물질 (블루) Hoeschst와 counterstained는. 바 규모 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MESC 선 파생 많은 실험실에서 일상적으로 사용 하는 잘 알려진 절차는, 비록 그 효율 항상 pluripotency 유지 보수를 방해할 수 있는 여러 요인으로 인해 예상 대로 높은 것은 아닙니다. 현재 문서에서 우리가 쇼, 단계적으로, 간단 하 고 신뢰할 수 있는 프로토콜을 사용 하 여 높은 효율성과 mESC 라인을 설정 하는 방법. 이러한 효율성은 문학에서 보고 된 것과 유사한.
최대 효율을 보장 하기 위해, 그것은 매일 셀을 제어 하는 것이 중요 또는 매일, 시간 이후 포인트 표시는 그냥 설명. 세포 죽음과 감 별 법이 추진 하 고 이후 식민지의 전면에 자라 난을 피하기 위해 필수적 이다. 그것은 또한 그들의 subculture 동안 식민지의 트립 신-EDTA에 노출 가능한 한 많이 감소 하는 것이 중요 때문에이 또한 세포 생존 능력을 줄일 수 있습니다.
또 다른 중요 요인은 피더 세포의 소스와 그들의 문화 이다. 여러 연구 결과 HFF, 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEF) 및 마우스 STO 섬유 아 세포는 동일 하 게 esc 키 파생 및 문화15지원할 수 설명 했다. 그러나, HFF 문화16, MEF 및 STO 보다 두 번 더 내구성까지 성장 mESC 대 한 더 많은 시간 이다. 따라서, HFF의 사용은 추가 mESC 비주류를 방지합니다.
얻은 파생 효율성 보고 결과 보다 낮은 경우에, 그것은 신중 하 게 파생 매체, 특히 혈 청 교체의 모든 구성 요소를 확인 하는 것이 중요. 혈 청 교체의 다른 배치 파생 효율성17,18에 큰 차이가 발생할 수 있습니다. 따라서, 각 새로운 배치는 사용 하기 전에 테스트 되어야 한다.
그것은 중요 한 지적 mESC 파생 소스 또한 크게 파생 효율에 영향을 미칠 수 있습니다 사용 하는 배아의 유전 배경. 실제로, 마우스 긴장 있다 (예: 129S2 및 C57BL6) 관대 한 긴장 및 표준 조건9,19mESC 라인을 그들의 능력에 따라 (CBA, 끄 덕 FVB 등) 비 관대 한 긴장으로 분류 되었습니다. 여기 보고 프로토콜 적용할 수 있습니다 성공적으로 배아에 두 유형의 긴장으로 비 허용 긴장에서 배아를 작업할 때 칵테일 2i 파생 매체에 포함. 2i 중간 유전 배경6에 관계 없이 pluripotency를 유지 하기 위해 mESC 라인의 신호 패턴을 조절 할 수 있다. 주요 한계는, 강한 신호 패턴 mESC 라인 2 차별화에 저항력이 될 교양된 문화20, 동안 인수 때문. 이 한계를 극복 하기 위해 mESC 라인 인수 신호 약화을 분화의 유도 하기 전에 하나 이상의 통과 위해 2i 없이 경작 한다.
전반적으로,이 작품 단순히으로 가능 하 고 그들을 극복 하는 방법과 주요 어려움에 포인팅으로 단계를 보여줌으로써 mESC 파생의 연습을 쉽게 할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
피더 세포 배양, 동물 보호에 대 한 룸 Estabulari 드 라 UAB와 비디오를 기록 하기 위한 Domènec 마틴 그의 기술 지원에 감사 Jonatan 루카스 하 고. 이 작품 정부의 드 Economia y Competitividad AGL2014-52408-R 및 Generalitat 드에 의해 지원 되었습니다 카탈루냐 2014 SGR-524. MVC는 PIF UAB 장학금의 수혜자.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL sryringe | BD | 309628 | |
| 2-β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350-010 | |
| 4-well plate | Thermo Scientific Nunc | 176740 | |
| Acidic Tyrode's solution | Home-made | See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M. | |
| BSA | Sigma | A3311 | |
| Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Molecular Probes - Invitrogen | A-21200 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies. |
| CHIR990212 | Axon Medchem | 1386 | Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
| CryoTube | Thermo Scientific Nunc | 3754518 | |
| DMSO | Sigma | 41640 | |
| DMEM | BioWest | L0107 | |
| FBS | BioWest | S1810 | Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC |
| Flushing needle | BD | 304000 | Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone |
| Gelatin from porcine skin | Fluka | 48724 | Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month. |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594 | Molecular Probes - Invitrogen | A-11037 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody. |
| HBSS | BioWest | L0611 | |
| Hepes-buffered CZB | Home-made | See composition in Chatot et al, 1989 | |
| Human chorionic gonadotropin | Divasa-Farmavic | Veterin-Corion 3000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
| Human foreskin fibroblasts | ATCC | ATCCSCRC-1041 | For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen. |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles. |
| KSOMaag Evolve | Zenith Biotech | ZEKS-050 | Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use. |
| Leukemia Inhibitory Factor | Merk Millipore | ESG1106 | |
| Mice | Charles River/Harlan | It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor. | |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | Embryo tested. Photosensitive. |
| Mitomycin C | Serva | 2980501 | Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer. |
| Mouse anti-tubulin β III (Tuj1) | Biolegend | MMS-435P | 1:500 dilution |
| Mouse monoclonal anti-αSMA | Sigma | A5228 | 1:200 dilution |
| Mouse monoclonal anti-AFP | R&D Systems | MAB1368 | 1:50 dilution |
| Mouse monoclonal anti Oct3/4 | Santa cruz | Sc-5279 | 1:50 dilution |
| Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-035 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | 1408 | Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
| Petri dish (35mm) | Thermo Scientific Nunc | 153066 | |
| Petri dish (60mm) | Thermo Scientific Nunc | 150288 | |
| Pregnant mare's serum gonadotropin | Foligon | Foligon-1000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
| Rabbit policlonal anti-Sox2 | Merck Millipore | AB5603 | 1:200 dilution |
| T75 falcon | Thermo Scientific | 130190 | |
| Trypsin-EDTA 10x | BioWest | X0930 | Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution |
References
- Biswas, A., Hutchins, R.
- Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. PNAS. 72 (4), 1441-1445 (1976).
- Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nat Prot. 9 (3), 559-574 (2014).
- Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336 (6200), 688-690 (1988).
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
- Brook, F. A., Gardner, R. L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proc Nat Acad Sci U S A. 94 (11), 5709-5712 (1997).
- Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer. Lab Invest. 82 (12), 1765-1767 (2002).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Wakayama, S., et al. Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies. Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).
- Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).
- Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Lab Press. New York. (2003).
- Lee, K. H. Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture. Pluripotent Stem Cells. , 85-115 (2013).
- Ma, Y., et al. Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res Ther. 3 (29), (2012).
- Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).
- Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells. Cytotechnology. 58 (3), 173-179 (2008).
- Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines. Int. J. Dev. Biol. 38 (2), 385-390 (1994).
- Gonzalez, J. M., et al. Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency. Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).
