Summary
Este artigo descreve um protocolo para eficientemente derivar e cultura linhas de células-tronco pluripotentes de embriões de rato no estágio de blastocisto.
Abstract
Derivação de células-tronco embrionárias (mESC) do mouse é o processo pelo qual pluripotentes linhagens celulares estabelecidas dos embriões pré-implantação. Estas linhas mantêm a capacidade de renovar o Self ou diferenciar sob condições específicas. Devido a essas propriedades, o mESC são uma ferramenta útil na medicina regenerativa, modelagem de doença e estudos de engenharia de tecidos. Este artigo descreve um protocolo simples para obter linhas de mESC com eficiências de alta derivação (60-80%) pelo cultivo de blastocistos de estirpes de rato permissiva em células alimentador definido suplementado com fator inibitório de leucemia. O protocolo também pode ser aplicado derive eficientemente mESC linhas de cepas não-permissiva do mouse, pela simples adição de um coquetel de dois inibidores da pequeno-molécula ao meio de derivação (2i médio). Os procedimentos detalhados sobre a preparação e a cultura de células de alimentador, coleta e cultura de embriões de rato e derivação e cultura das linhas mESC são fornecidos. Este protocolo não requer equipamento especializado e pode ser realizado em qualquer laboratório com conhecimentos de cultura de pilha mamífera básica.
Introduction
Células-tronco embrionárias (ESC) são pluripotentes células derivadas de embriões pré-implantação, que mantêm a capacidade de renovar o Self ou diferenciar sob condições específicas1. Baseado sobre essas propriedades, ESC tornaram-se uma ferramenta útil para a medicina regenerativa, modelagem de doença e de estudos engenharia de tecido2.
ESC foram derivados pela primeira vez embriões pré-implantação do mouse, originando linhas ESC (mESC) rato com sucesso baixa3,4. Durante anos, a eficiência de derivação permaneceu baixa devido à dificuldade de manutenção da pluripotência em vitro. Além disso, a presença de alimentador células5, que melhoram a eficiência de derivação, promover a fixação da colônia e realçar estabilidade espectofotômetro6, várias modificações das protocolo conduzir a uma melhoria na manutenção da pluripotência. As mais importantes foram a adição de fator inibitório de leucemia (LIF) mESC meio de cultura7,8, a utilização de embriões da 129S2 fundo permissiva9 e a cultura dos mESC com suplementado com definido soro, livre de potenciais fatores de diferenciação10. Mais recentemente, evidências convincentes tem mostrado que a adição de um coquetel de dois moduladores da pequeno-molécula de vias de sinalização para o meio de cultura de mESC (conhecido como 2i) é melhor manter a pluripotência. O cocktail de 2i consiste numa combinação de inibidor MEK PD0325901, que reduz os sinais de diferenciação por inibição da via de quinase (MAPK) proteína mitogen-ativado, e o inibidor de GSK3β CHIR99021, que aumenta a sobrevivência da pilha de baixa densidade Ativando o Wnt caminho11.
No presente artigo, descrevemos um protocolo simples derive eficientemente mESC linhas de blastocistos de rato. Seguimos os procedimentos padrão, cultivo de embriões de estirpes permissivas em células alimentador suplementado de derivação com LIF e uma substituição de soro12. Seguir este protocolo, mESC linhas pode ser derivada com eficiências equivalentes às obtidas no meio de 2i. Apesar disso, 2i pode ser adicionado para evitar possíveis problemas com manutenção de pluripotência, ou quando se trabalha com cepas não-permissiva.
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Protocol
o uso dos animais descritos nas seções abaixo foi aprovado pelo Comitê de ética em pesquisa humana da Universitat Autònoma de Barcelona e Animal e pelo departamento d ' Agricultura, Ramaderia, Pesca eu Alimentació da Generalitat de Catalunya (protocolo #8741).
1. armazenamento e inativação de célula alimentador
Nota: fibroblastos humanos prepúcio (HFF-1) foram previamente congelados em 1 mL de solução de congelação composta de 90% soro Fetal bovino (FBS) e 10% de dimetil sulfóxido ( DMSO) e armazenados em nitrogênio líquido até uso.
- Descongelar um frasco criogênico do HFF-1 (1 mL) mergulhando o frasco em banho maria a 37 ° C.
- Adicionar o conteúdo descongelado do frasco criogênico para pré-aquecido Dulbecco ' s Modified Eagle ' s médio (DMEM) suplementado com 10% FBS tornar um 01:10 diluição.
- As células diluídas (10 mL) de sementes num balão T75 e cultura-los a 37 ° C e 5% de CO 2.
- No dia seguinte, mudar o meio para eliminar os restos de DMSO. Retire o meio e adicione 10 mL de DMEM pré-aquecido suplementado com 10% FBS.
- Cultura os HFFs e mudar o meio cada 48 h até a cultura atinge o estágio confluente. Isto pode demorar cerca de 7 a 10 dias.
- Para preparar a solução de inactivação, diluir mitomicina C em DMEM suplementado com 10% FBS em uma concentração final de 10 µ g/mL. Incubar as células com a solução de inativação por 3 h a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Remover a solução de inactivação e enxágue as células três vezes com 2 mL de Hanks equilibrado sal solução (HBSS) para eliminar os restos de mitomicina C.
- Para desprender as células inactivadas, adicionar 1 mL de solução de tripsina-EDTA pré-aquecido e incubar durante 5 min a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Observar as células sob um microscópio invertido para garantir que eles são desanexados (10 x objetivo com 0,3 abertura numérica ou nd). Se não forem, incube-los por mais uns minutos a 37 ° C e 5% de CO 2. Verifique as células novamente sob o microscópio invertido.
- Pipetar a solução com uma pipeta Pasteur para dissociar as touceiras de celular.
- Neutralizar a solução enzimática adicionando 4 mL de DMEM suplementado com 10% FBS e ressuspender.
- Tomar uma alíquota da suspensão celular e faça uma diluição de 1: 100 em HBSS. Para determinar o número de células, carregar 10 µ l da diluição em um Neubauer ' câmara de s. Contar as células, localizadas em uma das grandes praças da câmara sob um microscópio invertido (objetivo de x 20 com um at 0.45).
- Repetir a contagem em um total de quatro quadrados grandes. Calcular o número total de células (N) como N = número médio de células contadas x volume total x diluição x 10 4.
- Centrifugar o resto da amostra durante 5 min à 200 x. g. descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado com o congelamento solução em uma concentração de 10 6 células / mL.
- Alíquota a suspensão em frascos criogênicos com 10 6 células (1 mL) cada. Coloque os frascos criogênicos num recipiente frio e congelar a -80 ° C.
- No dia seguinte, conservar os frascos criogênicos em azoto líquido.
2. Cultura de pilha alimentador
- um a quatro dias antes de iniciar o processo de derivação, descongelar um frasco criogênico contendo 1 x 10 6 inativada HFF-1 células em um banho de água a 37 ° C.
- Fazer uma diluição de 1:6 do HFF-1 descongeladas em pré aquecido DMEM suplementado com 10% FBS e manter a temperatura a 37 ° C.
- Encha cada poço de uma placa de 4 com 500 µ l de gelatina previamente aquecido de 0,2% de pele suína e manter a placa a 37 ° C durante 10 min.
- Remover a 500 µ l de gelatina de poços e adicionar 500 µ l da diluição HFFs. Agitar suavemente a placa para garantir uma distribuição uniforme dos HFFs no fundo dos poços. Evite movimentos circulares, caso contrário, as células irão concentrar-se no centro do poço.
- Incubar a placa pelo menos 24 h a 37 ° C e 5% CO 2 para obter uma monocamada de HFFs inactivadas em cada poço.
- No dia seguinte, observar as células sob um microscópio invertido (objetivo de X 10 com 0,3 ND) e verifique se eles estão anexados e homogeneamente distribuídos. Mude o meio para eliminar os restos de DMSO. Remover o meio e adicione 500 µ l de DMEM pré-aquecido suplementado com 10% FBS.
3. Colheita de embriões e cultura
- quatro dias antes da colheita de embriões, administrar 5 IU de égua grávida ' gonadotropina do soro s por injeção intraperitoneal de ratos fêmeas de 6 a 12 semana.
Nota: Nós usamos fêmeas do 129S2 ou estirpes de B6CFAF1, embora as fêmeas de outras tensões do mouse podem ser usadas. No entanto, quando trabalhar com fêmeas de cepas não-permissivo (por exemplo, CBA), médio deve ser complementado com 2i como mencionado na etapa 4.2. - Após 48 h, administrar 5 UI de gonadotrofina coriônica humana por injeção intraperitoneal e acasalar as fêmeas com os machos, pelo menos 8 semanas de idade, na proporção de 1:1. Separar as fêmeas os machos no dia seguinte.
- No dia anterior a colheita de embriões, preparar uma cultura de células de 35mm placa de Petri com vários 40 gotas de µ l de KSOMaag suplementado com 4 mg/mL de albumina de soro bovino (BSA) e encher o prato com óleo mineral para cobrir totalmente as gotas. Incubar o prato em 37 ° C e 5% CO 2 para equilibrar o meio.
- Para preparar pipetas de manipulação do embrião, aqueça a parte mais fina de um vidro com ponta longa pipeta Pasteur usando um bico de Bunsen. Depois de macio, tire-a da chama e separar as duas extremidades. Quebrá-lo para o comprimento desejado. O diâmetro interno na ponta deve ser de 100-150 µm.
- Eutanásia de ratos fêmeas por deslocamento cervical 45-48 h post-coitum (p.c.).
- Dissecar os ratos para expor na cavidade abdominal por um corte a pele com curva suave tesoura afiada e o peritônio com tesoura afiada em linha reta. Pegar um útero com fórceps, cortar o oviduto usando tesouras afiadas direto e colocá-lo no tampão Hepes CZB médio (HCZB) 13 a 37 ° C. Repita o processo para remover outro oviduto.
- Flush os ovidutos com uma seringa de 1 mL carregados com HCZB mantido no lugar por pinças de relojoeiro para coletar os embriões de 2 células.
Nota: Para preparar a tomada de agulha-lavagem uma agulha hipodérmica de 30g, corte a extremidade e à terra para uma ponta romba sobre uma pedra abrasiva. - Usando o aparelho de pipeta de boca, pegar os embriões, lavá-los com HCZB e cultura-los a placa de cultura de embrião previamente preparado em 37 ° C e 5% de CO 2 até o estágio de blastocisto. Até 50 embriões podem ser cultivados em cada gota de 40 µ l. Monitorar o desenvolvimento do embrião cada 24 h sob um estereomicroscópio.
Nota: Como alternativa, os embriões podem ser coletados na fase de blastocisto para encurtar em vitro cultura de embriões. Neste caso, abater as fêmeas no dia 3.5-4.5 p.c., dissecar o útero. e nivelá-lo com HCZB.
4. Derivação de células-tronco
- preparação das placas de derivação
- no dia da semeadura de embrião, prepare o suporte de derivação, complementando o meio DMEM com 100 µM 2 β Mercaptoetanol, 1 x não-aminoácidos essenciais , 20% de substituição do soro e 10 3 U/mL LIF.
- Se desejar, adicione também 1 µM do inibidor MEK PD0325901 e 3 µM do inibidor GSK3 CHIR99021 para obter um meio de 2i.
- Levar a placa com a monocamada de HFFs inactivadas (passo 2.6) de 4 a incubadora. Remover o meio e adicionar 800 µ l de meio de derivação pré-aquecido a cada poço. Devolve a chapa para a incubadora.
- Remoção de Zona pelúcida e embrião semeadura
- preparar uma cultura celular de 35 mm placa de Petri com gotas de três 30 µ l de ácido Tyrode ' s solução 14 e gotas de três 30 µ l de meio de derivação. Cubra as gotas com óleo mineral e mantenha o prato em 37 ° C.
- Retirar o prato de cultura de embrião da incubadora. Um por um, transferir os blastocistos de gotas a cultura para um ácido Tyrode ' gota de solução de s usando uma pipeta de manipulação do embrião. Se possível, selecione apenas os blastocistos expandidos para iniciar o processo de derivação.
- Monitor a zona pelúcida digestão sob o microscópio. Assim que a zona pelúcida desaparece, transferência de blastocisto para uma queda média de derivação para lavar o ácido Tyrode ' solução de s.
- Levar o prato de derivação 4-poço de incubadora e semente de uma zona livre de blastocisto no alimentador de células em cada poço.
- Retornar a chapa 4-poço de derivação para a incubadora e a cultura em 37 ° C e 5% de CO 2.
- Crescimento de células-tronco de monitoramento e médio mudam
- monitorar as culturas cada 24 h sob um microscópio invertido (objetivo de X 20 com at 0.45). É importante observar se há sinais de diferenciação de células-tronco, como as células inchadas refractivas circundante a consequência natural ou mesmo empurrando o alimentador células lado.
- Todos os outros dias, alterar o meio de cultura. Retirar a placa de 4 a incubadora, remover o meio de cada poço e adicionar 800 µ l de meio de derivação pré-aquecido suplementado com LIF e 2i, se usado. Manter a cultura até Humanisme é observados (6-8 dias).
5. Manutenção e cultura de células-tronco
- preparar Kolle, como alças e pipetas de manipulação de células-tronco. Siga os passos 3.4 para preparar pipetas de manipulação de células-tronco com um diâmetro interno na ponta de 250-300 µm. Use a outra parte da pipeta Pasteur puxada para preparar o cabo de Kolle, como. Aqueça e moldá-la até a obtenção de um gancho.
- Levar o prato de cultura 4-bem fora da incubadora e localize a consequência sob um estereomicroscópio. Use a alça para afastar as células diferenciadas e os alimentadores que cercam a consequência.
Nota: Para evitar eventual diferenciação da consequência, é importante remover todas as células diferenciadas da borda da consequência a. - Aspire a consequência de uma pipeta de manipulação de células-tronco e coloque-o em um prato novo em uma gota de tripsina-EDTA 50 µ l.
- Usar um bisturi para cortar a consequência em várias partes a fim de desagregá-lo tanto mecanicamente e enzimaticamente.
- Imediatamente, transfira os fragmentos de consequência em uma gota fresca de proveniência média para neutralizar a ação da tripsina.
- Transferir os fragmentos de consequência natural para uma nova placa de 4 com uma monocamada de alimentadores. Transferência de até 10 fragmentos por alvéolo e cultura-los com proveniência média em 37 ° C e 5% de CO 2.
- Manter as culturas de células-tronco, como pelo menos seis semanas antes de considerar a linha mESC estabelecida. Alterar o meio de todos os outros dias e subcultura-los uma vez por semana.
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Representative Results
Na sequência deste protocolo, mais 95% da formação de consequência deve ser alcançado após a primeira semana da cultura (figura 1A). Estabelecimento de linhas de mESC após seis passagens é variável entre repetições experimentais, com uma média de 60-80% de sucesso. A adição de 2i não melhorar significativamente os resultados ao trabalhar com cepas de rato permissivas, tais como aqueles com antecedentes de 129S2, mas é necessário quando se trabalha com cepas não-permissiva.
Colônias de mouse ESC deve apresentar uma morfologia regular com uma forma plana e definido arestas quando cultivadas sem tratamento (figura 1B-C) ou cultivadas com 2i (Figura 1). Colônias, apresentando sinais de diferenciação periférica devem ser descartada (Figura 1E-F). Se as eficiências de derivação obtidas são inferiores aos valores esperados, controle o crescimento de colônias de mESC e subcultura-los mais frequentemente para evitar o crescimento excessivo, pois isso pode causar morte celular e promoveria a diferenciação (Figura 1-H).
Figura 1 : Imagens representativas das colônias mESC na cultura. (A) consequência natural derivado de um blastocisto após a primeira semana da cultura (B, C), mESC várias colônias na passagem 10 apresentando bordas definidas e uma forma plana. (D) colônias de linhas mESC tratadocom com 2i. (E, F) Exemplos de colônias mESC semi diferenciada apresentando sinais de diferenciação periférica (realçadas com elipses tracejadas). (G, H) Exemplos de colônias mESC overgrown apresentando um maus sinais de morfologia e diferenciação. Barras de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para verificar a stemness das linhas mESC putativo obtidos após seis semanas de cultura, deve ser avaliada a presença de marcadores de pluripotência e diferenciação. As linhas de mESC devem ser positivas para marcadores de pluripotência como Oct4 e Sox2 (Figura 2 A-B). Além disso, após a indução da diferenciação espontânea por 10 dias sem células alimentador em DMEM suplementado com 10% de cultivo as células FBS, mESC linhas deverão ser positivos para a classe de β-tubulina ectoderme marcador III (Tuj1) (Figura 2), a mesoderme marcador α-Smooth Muscle Actin (αSMA) (Figura 2D) e o marcador de endoderme alfa-fetoproteína (AFP) (Figura 2E). Apenas as linhas positivas para os cinco Marcadores avaliados devem ser consideradas verdadeira mESC linhas e, portanto, utilizadas para o cálculo da eficiência da derivação. Geralmente, isso corresponde a praticamente todas as linhas de mESC geradas usando o presente protocolo.
Figura 2 : Representante imunofluorescência contra marcadores de pluripotência e diferenciação. colônias de mESC expressando Oct4 (A) (verde) (B) e Sox2 (vermelho). Diferenciadas mESC colônias expressando (C) Tuj1 (verde), (D) αSMA (verde) e (E) AFP (verde). Em todas as imagens, o material nuclear é counterstained com Hoeschst (azul). Barras de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Embora a derivação de linha mESC é um procedimento bem conhecido rotineiramente utilizado em muitos laboratórios, sua eficiência não é sempre tão alta quanto o esperado devido os múltiplos fatores que podem perturbar a manutenção da pluripotência. No presente artigo mostramos, passo a passo, como estabelecer linhas de mESC com alta eficiência usando um protocolo simples e confiável. Estas eficiências são semelhantes aos relatados na literatura.
Para garantir a máxima eficiência, é importante controlar as células diariamente ou em dias alternados, desde o tempo pontos indicados são apenas ilustrativos. É essencial para evitar o crescimento excessivo das colônias, uma vez que este promove a diferenciação e morte celular. Também é importante reduzir tanto quanto possível, a exposição das colónias a tripsina-EDTA durante sua subcultura, porque isso pode também reduzir a viabilidade celular.
Outro fator crucial é a fonte das células do alimentador e sua cultura. Vários estudos têm demonstrado que o HFF, Mouse embrionárias fibroblastos (MEF) e mouse fibroblastos STO são igualmente capazes de suportar a derivação de ESC e cultura15. No entanto, HFF são até duas vezes mais durável do que o MEF e STO em cultura16, permitindo mais tempo para o mESC a crescer. Assim, o uso de HFF evita subculturas mESC extra.
Se as eficiências de derivação obtidas são menores do que os resultados relatados, é importante verificar cuidadosamente todos os componentes do meio de derivação, especialmente substituição de soro. Diferentes lotes de substituição do soro podem resultar em diferenças significativas na derivação eficiências17,18. Portanto, cada novo lote deve ser testado antes da sua utilização.
É importante salientar que a base genética dos embriões utilizados como uma fonte para a derivação de mESC pode afetar também significativamente a eficiência de derivação. Com efeito, cepas de rato foram classificadas em estirpes permissivas (como 129S2 e C57BL6) e estirpes não-permissivo (como CBA, NOD e FVB) de acordo com sua capacidade de produzir linhas mESC sob condições padrão9,19. O protocolo aqui relatado pode ser aplicado com sucesso embriões de ambos os tipos de cepas, enquanto o 2i cocktail está incluído no meio de derivação ao trabalhar com embriões de cepas não-permissiva. O meio de 2i é capaz de modular o sinalização padrão de linhas de mESC para sustentar a pluripotência, independentemente do fundo genético6. A principal limitação é que, devido o forte padrão de sinalização adquirido durante a cultura20, mESC linhas cultivadas em 2i tornam-se resistentes à diferenciação. Para contornar essa limitação, mESC linhas devem ser cultivadas sem 2i pelo menos uma passagem antes da indução da diferenciação para enfraquecer a sinalização adquiriu.
Em geral, este trabalho pode facilitar a prática de derivação de mESC, mostrando as etapas simplesmente como possível e apontando as principais dificuldades e como superá-las.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos Jonatan Lucas pela sua assistência técnica com a cultura de pilha do alimentador, serviço Estabulari de la UAB para cuidados com animais e Domènec Martín para gravar o vídeo. Este trabalho foi apoiado pelo Ministerio de Economia y AGL2014 competitividade-52408-R e a Generalitat de Catalunya 2014 SGR-524. MVC é beneficiário de uma bolsa de PIF-UAB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL sryringe | BD | 309628 | |
| 2-β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350-010 | |
| 4-well plate | Thermo Scientific Nunc | 176740 | |
| Acidic Tyrode's solution | Home-made | See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M. | |
| BSA | Sigma | A3311 | |
| Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Molecular Probes - Invitrogen | A-21200 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies. |
| CHIR990212 | Axon Medchem | 1386 | Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
| CryoTube | Thermo Scientific Nunc | 3754518 | |
| DMSO | Sigma | 41640 | |
| DMEM | BioWest | L0107 | |
| FBS | BioWest | S1810 | Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC |
| Flushing needle | BD | 304000 | Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone |
| Gelatin from porcine skin | Fluka | 48724 | Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month. |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594 | Molecular Probes - Invitrogen | A-11037 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody. |
| HBSS | BioWest | L0611 | |
| Hepes-buffered CZB | Home-made | See composition in Chatot et al, 1989 | |
| Human chorionic gonadotropin | Divasa-Farmavic | Veterin-Corion 3000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
| Human foreskin fibroblasts | ATCC | ATCCSCRC-1041 | For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen. |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles. |
| KSOMaag Evolve | Zenith Biotech | ZEKS-050 | Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use. |
| Leukemia Inhibitory Factor | Merk Millipore | ESG1106 | |
| Mice | Charles River/Harlan | It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor. | |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | Embryo tested. Photosensitive. |
| Mitomycin C | Serva | 2980501 | Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer. |
| Mouse anti-tubulin β III (Tuj1) | Biolegend | MMS-435P | 1:500 dilution |
| Mouse monoclonal anti-αSMA | Sigma | A5228 | 1:200 dilution |
| Mouse monoclonal anti-AFP | R&D Systems | MAB1368 | 1:50 dilution |
| Mouse monoclonal anti Oct3/4 | Santa cruz | Sc-5279 | 1:50 dilution |
| Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-035 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | 1408 | Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
| Petri dish (35mm) | Thermo Scientific Nunc | 153066 | |
| Petri dish (60mm) | Thermo Scientific Nunc | 150288 | |
| Pregnant mare's serum gonadotropin | Foligon | Foligon-1000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
| Rabbit policlonal anti-Sox2 | Merck Millipore | AB5603 | 1:200 dilution |
| T75 falcon | Thermo Scientific | 130190 | |
| Trypsin-EDTA 10x | BioWest | X0930 | Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution |
References
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