Summary
توضح هذه المقالة بروتوكول لاشتقاق بكفاءة وثقافة pluripotent خطوط الخلايا الجذعية من الأجنة الماوس في مرحلة الكيسة.
Abstract
اشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية (مسك) الماوس هو العملية التي pluripotent هي أنشأت خطوط الخلايا من الأجنة preimplantation. هذه الخطوط الاحتفاظ بالقدرة على تجديد ذاتية أو التفريق تحت شروط معينة. بسبب هذه الخصائص، يتم مسك أداة مفيدة في الطب التجديدي، والنمذجة المرض، ودراسات هندسة الأنسجة. توضح هذه المقالة بروتوكول بسيط للحصول على خطوط مسك مع اشتقاق عالية الكفاءة (60-80 في المائة) باستزراع blastocysts من سلالات الماوس متساهلة في تغذية الخلايا في المعرفة المتوسطة وتستكمل مع العوامل المثبطة اللوكيميا. يمكن أيضا تطبيق البروتوكول كفاءة استخلاص خطوط ©جميع من سلالات الماوس غير متساهلة، بإضافة بسيطة من خليط من اثنين مثبطات جزيء صغير إلى متوسط الاشتقاق (متوسط 2 طاء). وترد الإجراءات المفصلة في إعداد والثقافة لتغذية الخلايا، جمع وثقافة الأجنة الماوس، واشتقاق والثقافة من خطوط ©جميع. هذا البروتوكول لا يتطلب معدات متخصصة ويمكن أن تنفذ في أي مختبر خبرة الثقافة الأساسية خلايا الثدييات.
Introduction
الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) هي pluripotent الخلايا المشتقة من الأجنة بريمبلانتيشن، التي تحتفظ بالقدرة على تجديد ذاتية أو التفريق تحت ظروف محددة1. وبناء على هذه الخصائص، أصبحت ESC أداة مفيدة للطب التجديدي، والنمذجة المرض، والأنسجة الدراسات الهندسية2.
استمدت ESC للمرة الأولى من الأجنة الماوس preimplantation، تنشأ خطوط ESC (مسك) الماوس مع النجاح منخفضة3،4. لسنوات، ظلت كفاءة اشتقاق منخفضة نظراً لصعوبة الحفاظ على بلوريبوتينسي في المختبر. وإلى جانب ذلك وجود تغذية الخلايا5، مما يحسن كفاءة الاشتقاق، وتعزيز مرفق مستعمرة والاستقرار كاريوتيبيك6، عدة تعديلات للبروتوكول يؤدي إلى حدوث تحسن في الصيانة بلوريبوتينسي. كانت أهم الإضافة من اللوكيميا المثبطة عامل (LIF) إلى مسك الثقافة المتوسطة7،8، استخدام الأجنة من الخلفية الدلالية 129S29 وثقافة مسك مع المتوسطة وتستكمل مع تعريف المصل، خالية من عوامل التمايز المحتمل10. في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت الأدلة الدامغة أن إضافة خليط من اثنين المغيرون جزيء صغير من مسارات الإشارات إلى مسك الثقافة المتوسطة (المعروفة باسم 2i) أفضل وسيلة للحفاظ على بلوريبوتينسي. 2 طاء كوكتيل يتكون من مجموعة المانع مجاهدي خلق PD0325901، مما يقلل من إشارات التمايز عن طريق تثبيط بروتين mitogen تنشيط المسار كيناز (MAPK)، ومثبطات GSK3β CHIR99021، مما يعزز بقاء الخلية في منخفض الكثافة بتنشيط مسار Wnt11.
في هذه المادة، يمكننا وصف بروتوكول بسيط لكفاءة استخلاص خطوط ©جميع من blastocysts الماوس. ونحن اتباع الإجراءات القياسية، استزراع الأجنة من سلالات متساهلة في تغذية الخلايا في اشتقاق المتوسطة وتستكمل مع ليف و استبدال مصل12. يمكن اشتقاق عقب هذا البروتوكول، ومسك خطوط مع الكفاءات المماثلة لتلك التي تم الحصول عليها في المتوسط 2 طاء. وعلى الرغم من ذلك، يمكن إضافة 2 طاء لتجنب المشاكل المحتملة مع الحفاظ على بلوريبوتينسي أو عند العمل مع سلالات غير متساهلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
استخدام الحيوانات في المقاطع أدناه قد تم وافقت عليها "لجنة الأخلاقيات" في الحيوان والإنسان البحث جامعة برشلونة المستقلة ود خلية ' الصيد الزراعة، راماديريا، وأنا Alimentació من محافظة كاتالونيا (بروتوكول #8741).
1-تغذية الخلية المنظمة والتخزين
ملاحظة: القلفة البشرية الليفية (الأكايمية-1) كانت مجمدة في السابق في 1 مل من محلول التجميد التي تتكون من 90% مصل بقرى الجنين (FBS) و 10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ( [دمس]) وتخزينها في النتروجين السائل حتى استخدام.
- ذوبان الجليد قنينة مبردة من الأكايمية-1 (1 مل) من غمر القنينة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- إضافة محتويات القنينة المبردة المذابة إلى دولبيكو المعالجون مسبقاً ' s النسر التعديل ' s المتوسطة (دميم) وتستكمل مع 10% FBS لجعل 01:10 إضعاف.
- بذور الخلايا المخفف (10 مل) في قارورة T75 والثقافة لهم في 37 درجة مئوية و 5% CO 2- تغيير
- في اليوم التالي، على المديين المتوسط والقضاء على البقايا [دمس]. إزالة المتوسطة وإضافة 10 مل دميم دافئة قبل استكمالها مع 10% FBS. الثقافة في هفس
- وتغيير المتوسطة كل 48 ساعة حتى يصل إلى الثقافة مرحلة المتلاقية. قد يستغرق هذا الأمر حوالي 7 إلى 10 أيام.
- لإعداد حل المنظمة، وتمييع mitomycin C في دميم وتستكمل مع 10% FBS بتركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل. احتضان الخلايا مع حل المنظمة ح 3 في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-
- إزالة حل المنظمة وشطف الخلايا ثلاث مرات مع 2 مل من هانكس متوازن الملح الحل (حبس) للقضاء على فلول ميتوميسين ج.
- لفصل الخلايا المعطل، إضافة 1 مل من قبل حرارة يدتا التربسين الحل واحتضان لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-
- مراقبة الخلايا تحت مجهر مقلوب التأكد من أنها منفصلة (الهدف العاشر 10 مع 0.3 الفتحة العددية أو NA). إذا لم تكن كذلك، احتضان منهم لبضع دقائق إضافية في 37 درجة مئوية و 5% CO 2. فحص الخلايا مرة أخرى تحت المجهر المقلوب.
- "الماصة؛" الحل مع ماصة باستور كي ننأى بكتل الخلية.
- تحييد الحل الانزيمية بإضافة 4 مل دميم وتستكمل مع 10% FBS وريسوسبيند- تأخذ قاسمة لتعليق خلية
- وجعل إضعاف 1: 100 في حبس. لتحديد عدد الخلايا، تحميل 10 ميليلتر لتمييع في نويباور ' s الدائرة. عد الخلايا الموجودة في إحدى الساحات الكبيرة الدائرة بموجب مجهر مقلوب (الهدف x 20 مع نا 0.45).
- تكرار العد في مجموعة من أربعة مربعات كبيرة. حساب إجمالي عدد الخلايا (ن) كنون = متوسط عدد الخلايا معدود x الحجم الإجمالي x تمييع x 10 4-
- الطرد المركزي بقية العينة لمدة 5 دقائق في 200 x غ. تجاهل المادة طافية وبيليه مع تجميد الحل بتركيز 10 6 خلايا كل مل ريسوسبيند.
- قاسمة التعليق في قنينات المبردة مع 10 6 خلايا (1 مل) كل. ضع قارورة المبردة في حاوية تجميد وتجميد في-80 درجة مئوية.
- في اليوم التالي، تخزين القنينات المبردة في النتروجين السائل-
2. وحدة تغذية "الخلية والثقافة"
- واحد إلى أربعة أيام قبل البدء في عملية الاشتقاق، إبطال ذوبان قنينة مبردة التي تتضمن 1 × 10 6 خلايا الأكايمية-1 في حمام مائي في 37 درجة مئوية.
- جعل إضعاف 1:6 1-الأكايمية المذابة في تسخينها قبل دميم وتستكمل مع 10% FBS والحفاظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية.
- ملء كل بئر من صفيحة 4-جيدا مع 500 ميليلتر من قبل حرارة 0.2 ٪ الجيلاتين من جلد الخنزير والاحتفاظ باللوحة في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 10 إزالة 500 ميليلتر من الجيلاتين من الآبار
- وإضافة 500 ميليلتر لتمييع هفس. روك بلطف لوحة لضمان توزيع هفس في الجزء السفلي من الآبار بصورة موحدة. تجنب حركات دائرية، خلاف ذلك سوف تركز الخلايا في مركز البئر.
- احتضان لوحة مالا يقل عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5% CO 2 للحصول على المونولاير هفس المعطل في كل بئر- مراقبة الخلايا تحت مجهر مقلوب (الهدف العاشر 10 مع نا 0.3)
- في اليوم التالي، والتحقق من أنها تعلق والبلوتينيوم الموزعة. تغيير وسيلة للقضاء على فلول [دمس]. إزالة المتوسطة وإضافة 500 ميليلتر من دميم دافئة قبل استكمالها مع 10% FBS.
3. جمع الجنين والثقافة
- أربعة أيام قبل جمع الأجنة، وإدارة 5 وحدات دولية من الفرس الحامل ' s المصل تروج عن طريق الحقن داخل للفئران الإناث 6-12 أسبوع القديمة.
ملاحظة: لقد استخدمنا الإناث من 129S2 أو من سلالات B6CFAF1، على الرغم من أن يمكن استخدام الإناث من سلالات الماوس الأخرى. ومع ذلك، عند العمل مع الإناث من سلالات غير المتساهلة (مثلاً CBA)، المتوسطة ينبغي أن تستكمل مع 2 طاء كما هو مذكور في الخطوة 4، 2- - بعد 48 ساعة، إدارة 5 وحدات دولية من الإنسان المشيمية تروج عن طريق الحقن داخل، وتتزاوج الإناث مع الذكور، على الأقل 8 أسابيع من العمر، بنسبة 1:1. فصل الإناث عن الذكور في اليوم التالي- إعداد ثقافة خلية 35 ملم طبق بيتري مع عدة قطرات ميليلتر 40 كسوماج المتوسطة وتستكمل مع 4 مغ/مل ألبومين المصل البقري (BSA)
- اليوم قبل جمع الأجنة، وملء اللوحة مع الزيوت المعدنية تغطية كامل القطرات. احتضان الطبق على 37 درجة مئوية و 5% CO 2 حجته المتوسطة-
- لإعداد الماصات التلاعب بالأجنة، حرارة الجزء أرق من الزجاج طويلة ذات الرؤوس ماصة باستور استخدام موقد بنسن. بمجرد لينة، وسحبها من اللهب وسحب طرفي عن بعضها البعض. كسرها إلى الطول المطلوب. يجب أن يكون القطر الداخلي في تلميح 100-150 ميكرومتر.
- Euthanize الفئران الإناث بخلع عنق الرحم ح 45-48 وظيفة-كويتوم (p.c.).
- تشريح الفئران لفضح تجويف البطن بقطع الجلد مع منحنى سلس مقص حاد والصفاق مع مقص حاد مستقيم. انتزاع الرحم واحد مع الملقط وقطع قناة استخدام مقص حاد مستقيم، ووضعه في كزب مخزنة حبيس المتوسطة (هكزب) 13 في 37 درجة جيم تكرار العملية لإزالة في قناة أخرى.
- دافق أوفيدوكتس مع حقنه 1 مل محملة هكزب الذي عقد في مكان بالملقط الساعاتي لجمع الأجنة 2-خلية-
ملاحظة: إعداد تأخذ إبرة التنظيف إبرة حقن 30 غ، قطع النهاية، والبرية إلى تلميح صراحة على حجر جلخ. - باستخدام أجهزة ماصة الفم، التقاط الأجنة وغسلها في هكزب والثقافة لهم في الطبق الثقافة الجنين المجهز سابقا على 37 درجة مئوية و 5% CO 2 حتى مرحلة الكيسة. ما يصل إلى 50 الأجنة يمكن أن يكون مثقف في كل قطره 40 ميليلتر. رصد التنمية الجنين كل 24 ساعة تحت ستيريوميكروسكوبي.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، الأجنة يمكن جمعها في مرحلة الكيسة لتقصير الثقافة الجنين في المختبر. وفي هذه الحالة، euthanize الإناث في يوم p.c. 3.5-4.5، تشريح الرحم. وتدفق عليه مع هكزب-
4. اشتقاق الخلايا الجذعية
- من إعداد لوحات الاشتقاق في اليوم من زرع الجنين، إعداد المتوسطة الاشتقاق بتكميل المتوسطة دميم مع 100 ميكرومتر 2-β ميركابتوثانول، 1 x "الأحماض الأمينية" الأساسية عدم ، 20% لاستبدال المصل، و 10 3 U/mL ليف.
- إذا رغبت في ذلك، أيضا إضافة 1 ميكرومتر من مجاهدي خلق مثبطات PD0325901 و 3 ميكرومتر مثبطات GSK3 CHIR99021 للحصول على متوسط 2 طاء-
- تأخذ لوحة 4-جيدا مع أحادي الطبقة هفس المعطل (الخطوة 2، 6) من حاضنة. إزالة المتوسطة وإضافة 800 ميليلتر من الاشتقاق قبل حرارة متوسطة لكل بئر. العودة اللوحة للحاضنة.
- إزالة Zona pellucida والجنين البذر
- إعداد ثقافة خلية 35 ملم طبق بيتري مع قطرات ثلاث 30 ميليلتر من تيرودي الحمضية ' s الحل 14 وقطرات ثلاث 30 ميليلتر من المتوسطة الاشتقاق. تغطية القطرات مع الزيوت المعدنية وإبقاء الطبق على 37 درجة مئوية.
- أخذ الطبق الثقافة الجنين من الحاضنة. واحداً تلو الآخر، نقل بلاستوسيستس من قطرات الثقافة إلى تيرودي حمضية ' s حل انخفاض استخدام ماصة تلاعب الأجنة. إذا كان ذلك ممكناً، حدد فقط blastocysts الموسعة لبدء عملية الاشتقاق.
- مراقبة الهضم zona pellucida تحت ستيريوميكروسكوبي. حالما يختفي بيلوسيدا زونا، نقل الكيسة إلى انخفاض متوسط اشتقاق من أجل تغسل تيرودي الحمضية ' حل s-
- تأخذ لوحة الاشتقاق 4-جيدا من حاضنة والبذور واحدة خالية من زونا الكيسة على وحدة التغذية خلايا في كل بئر-
- عودة لوحة الاشتقاق 4-جيدا للحاضنة والثقافة في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-
- تغير نمو الخلايا الجذعية الرصد والمتوسطة
- رصد ثقافات كل 24 ساعة تحت مجهر مقلوب (الهدف X 20 مع نا 0.45). من المهم ملاحظة ما إذا كانت هناك علامات على تمايز الخلايا الجذعية، مثل تورم الخلايا الانكسار المحيطة بثمرة أو حتى دفع التغذية الخلايا جانبا.
- كل يوم، تغيير وسيلة للثقافة. تأخذ اللوحة 4-جيدا من الحاضنة وإزالة المتوسطة من كل بئر وإضافة 800 ميليلتر من المتوسطة اشتقاق المعالجون قبل استكمالها مع ليف و 2 طاء، إذا ما استخدمت. الحفاظ على الثقافة حتى هي لاحظت أووتجرووثس (6-8 أيام)-
5. زراعة الخلايا الجذعية وصيانة
- تحضير يشار تشبه مقابض والماصات التلاعب بالخلايا الجذعية. اتبع الخطوة 3.4 بإعداد الماصات التلاعب بالخلايا الجذعية مع قطر داخلي في غيض من 250-300 ميكرون. استخدم الجزء الآخر من ماصة باستور سحبت لإعداد المؤشر مثل يشار. الحرارة والشكل حتى الحصول على هوك-
- لوحة الثقافة 4-جيدا خارج الحاضنة وتحديد موقع ثمرة تحت ستيريوميكروسكوبي. استخدم المقبض لدفع بعيداً الخلايا المتمايزة ومغذيات التي تحيط ثمرة.
ملاحظة: لتجنب التفريق في نهاية المطاف من ثمرة، من المهم لإزالة جميع الخلايا المتمايزة من الحافة من ثمرة. - نضح ثمرة مع ماصة تلاعب خلايا الجذعية، ووضعه في طبق جديد في قطره 50 ميليلتر التربسين-يدتا.
- استخدام مشرط لقطع ثمرة في عدة أجزاء من أجل تفصيل ذلك ميكانيكيا وانزيماتيكالي على السواء-
- على الفور، نقل أجزاء ثمرة إلى قطره جديدة من الاشتقاق المتوسطة لتحييد عمل التربسين.
- نقل أجزاء ثمرة لصفيحة 4 آبار جديدة مع أحادي الطبقة مغذيات. نقل الأجزاء يصل إلى 10 في كل بئر والثقافة لهم مع اشتقاق المتوسطة في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-
- الحفاظ على الثقافات الشبيهة بالخلايا الجذعية لمدة ستة أسابيع على الأقل قبل النظر في السطر مسك المنشأة. تغيير المتوسط كل يوم وثقافة فرعية أخرى منها مرة واحدة في أسبوع-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في أعقاب هذا البروتوكول، ما يزيد على 95% تكوين ثمرة يجب أن يتحقق بعد الأسبوع الأول من الثقافة (الشكل 1A). إنشاء خطوط ©جميع بعد ستة ممرات متغيراً بين replicates التجريبي، مع نجاح متوسط من 60-80%. إضافة 2 طاء لا يحسن إلى حد كبير النتائج عند العمل مع سلالات الماوس المتساهلة، مثل تلك التي مع خلفية 129S2، ولكن من الضروري عند العمل مع سلالات غير متساهلة.
المستعمرات ESC الماوس ينبغي أن يقدم مورفولوجيا عادية بشكل مسطح وتحديد الحواف عند مثقف دون علاج (الشكل 1B-ج) أو مثقف مع 2 طاء (الشكل 1). تجاهل المستعمرات يجب أن يكون عرض علامات التمايز الطرفية (الشكل 1E-F). إذا كانت الكفاءة اشتقاق الحصول على أقل من القيم المتوقعة، السيطرة على نمو المستعمرات مسك وثقافة فرعية أكثر منهم كثيرا تجنب فرط، وهذا يمكن أن يسبب موت الخلايا ويعزز التمايز (الشكل 1-ح).
الشكل 1 : صور الممثلة مسك المستعمرات في الثقافة- (أ) ثمرة المستمدة من الكيسة بعد الأسبوع الأول من الثقافة (ب، ج) مسك عدة مستعمرات في مرور 10 حواف محددة بعرض وشكل مسطح. (د) المستعمرات من خطوط ©جميع تعامل مع 2 طاء. (ه، و) أمثلة لمستعمرات مسك متمايزة شبه عرض علامات التمايز الطرفية (أبرزت مع الحذف متقطع). (ز، ح) أمثلة لمستعمرات مسك متضخمة عرض علامات سيئة مورفولوجيا والتمايز. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
للتحقق من ستيمنيس للخطوط ©جميع المفترضة التي تم الحصول عليها بعد ستة أسابيع ثقافة، ينبغي تقييم وجود علامات بلوريبوتينسي والتمايز. يجب أن تكون الأسطر ©جميع إيجابية بالنسبة لعلامات بلوريبوتينسي مثل Oct4 و Sox2 (الشكل 2 أ-ب). وعلاوة على ذلك، بعد تحريض تمايز العفوية باستزراع الخلايا لمدة 10 أيام دون تغذية الخلايا في دميم وتستكمل مع 10% FBS، خطوط ©جميع يتوقع أن تكون إيجابية بالنسبة للفئة β-tubulin ماركر الأديم الظاهر الثالث (Tuj1) (الشكل 2)، ميسوديرم ماركر α-السلس العضلات أكتين (αSMA) (الشكل 2D) وعلامة الأنسجة الفافيتوبروتين (وكالة فرانس برس) (الشكل 2E). ينبغي أن تعتبر خطوط ©جميع الحقيقية الإيجابية لخمس علامات تقييم الخطوط فقط وهكذا المستخدمة لحساب كفاءة الاشتقاق. عادة، وهذا يتوافق مع تقريبا جميع خطوط ©جميع التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول.
الشكل 2 : الممثل الفلورة ضد علامات بلوريبوتينسي والتمايز. ©جميع المستعمرات معربا عن Oct4 (A) (أخضر) (ب) و Sox2 (أحمر). التمييز بين المستعمرات مسك الإعراب (ج) Tuj1 (الأخضر)، (د) αSMA (الأخضر) ووكالة فرانس برس (E) (أخضر). هو كونتيرستينيد بالمواد النووية في جميع الصور مع هويشست (أزرق). تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أن مسك خط الاشتقاق إجراء معروفة تستخدم بشكل روتيني في العديد من المختبرات، كفاءتها ليس دائماً مرتفعا كما هو متوقع بسبب العوامل المتعددة التي يمكن أن تخل بصيانة بلوريبوتينسي. في هذه المادة ونحن إظهار، خطوة بخطوة، كيفية إنشاء خطوط مسك بكفاءة عالية باستخدام بروتوكول بسيط ويمكن الاعتماد عليها. هذه الفعالية مماثلة لتلك التي ذكرت في الأدبيات.
لضمان أقصى قدر من الكفاءة، من المهم مراقبة الخلايا يوميا أو مرة كل يومين، منذ الساعة النقاط التي أشارت إلى توضيحية فقط. من الضروري تجنب فرط المستعمرات، أن هذا يعزز موت الخلايا وتمايزها. من المهم أيضا لتقليل قدر الإمكان التعرض للمستعمرات إلى التربسين-يدتا أثناء على ثقافة فرعية، لأن هذا يمكن أن تقلل أيضا بقاء الخلية.
عامل أساسي آخر هو مصدر تغذية الخلايا وثقافتهم. أظهرت العديد من الدراسات أن الليفية ستو الأكايمية والليفية الجنينية الماوس (MEF) والماوس أيضا قادرة على دعم اشتقاق المفتاح ESC والثقافة15. بيد أن الأكايمية حتى دائم أكثر من مرتين من MEF وستو في16من الثقافة، مما يتيح المزيد من الوقت ©جميع أن تنمو. وهكذا يتجنب استخدام الأكايمية تهاونا مسك إضافية.
إذا اشتقاق الكفاءة التي تم الحصول عليها أقل من النتائج المبلغ بها، فمن المهم فحص دقيق لجميع مكونات المتوسطة الاشتقاق، خصوصا المصل الاستبدال. دفعات مختلفة لاستبدال المصل يمكن أن تؤدي الاختلافات الكبيرة في اشتقاق الكفاءات17،18. ولذلك، يجب اختبار كل دفعة جديدة قبل استخدامه.
من المهم أن نشير إلى أن الخلفية الوراثية للأجنة المستخدمة كمصدر لاشتقاق ©جميع أيضا بدرجة كبيرة يمكن أن تؤثر على كفاءة الاشتقاق. وفي الواقع، قد صنفت سلالات الماوس إلى سلالات المتساهلة (مثل 129S2 و C57BL6) وسلالات غير المتساهلة (مثل المصرف المركزي وإيماءة وففب) وفقا لقدرتها تسفر عن مسك خطوط تحت الظروف القياسية9،19. البروتوكول ذكرت هنا يمكن يمكن تطبيقها بنجاح على الأجنة من كلا النوعين من سلالات طالما يتم تضمين 2 طاء كوكتيل في الأجلين المتوسط والاشتقاق عند العمل مع الأجنة من سلالات غير متساهلة. متوسطة 2 طاء غير قادرة على تعديل نمط خطوط ©جميع للحفاظ على بلوريبوتينسي، بغض النظر عن الخلفية الوراثية6إرسال الإشارات. القيد الرئيسي أنه، نظراً لنمط الإشارات القوية المكتسبة خلال20من الثقافة، مسك خطوط المستزرعة في 2 طاء تصبح مقاومة للتمايز. للتغلب على هذا التحديد، ينبغي أن مثقف مسك خطوط دون 2 طاء لمرور واحد على الأقل قبل تنظيم دورات تعريفية للتمايز إلى إضعاف مما يشير إلى اكتساب.
عموما، يمكن أن يخفف هذا العمل ممارسة الاشتقاق مسك بإظهار الخطوات قدر الإمكان ببساطة، والتأشير على أهم الصعوبات وكيفية التغلب عليها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر لوكاس Jonatan له المساعدة التقنية مع تغذية الخلية والثقافة، سيرفي استابولاري de la اتحاد المصارف العربية لرعاية الحيوان ومارتن دومينيك لتسجيل الفيديو. حظي بدعم هذا العمل من الوزارة دي ايكونوميا y AGL2014 كومبيتيتيفيداد-52408-R ودي محافظة كاتالونيا SGR 2014-524. بعثة التحقق المشتركة مستفيدة زمالة PIF-اتحاد المصارف العربية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL sryringe | BD | 309628 | |
| 2-β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350-010 | |
| 4-well plate | Thermo Scientific Nunc | 176740 | |
| Acidic Tyrode's solution | Home-made | See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M. | |
| BSA | Sigma | A3311 | |
| Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Molecular Probes - Invitrogen | A-21200 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies. |
| CHIR990212 | Axon Medchem | 1386 | Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
| CryoTube | Thermo Scientific Nunc | 3754518 | |
| DMSO | Sigma | 41640 | |
| DMEM | BioWest | L0107 | |
| FBS | BioWest | S1810 | Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC |
| Flushing needle | BD | 304000 | Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone |
| Gelatin from porcine skin | Fluka | 48724 | Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month. |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594 | Molecular Probes - Invitrogen | A-11037 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody. |
| HBSS | BioWest | L0611 | |
| Hepes-buffered CZB | Home-made | See composition in Chatot et al, 1989 | |
| Human chorionic gonadotropin | Divasa-Farmavic | Veterin-Corion 3000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
| Human foreskin fibroblasts | ATCC | ATCCSCRC-1041 | For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen. |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles. |
| KSOMaag Evolve | Zenith Biotech | ZEKS-050 | Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use. |
| Leukemia Inhibitory Factor | Merk Millipore | ESG1106 | |
| Mice | Charles River/Harlan | It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor. | |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | Embryo tested. Photosensitive. |
| Mitomycin C | Serva | 2980501 | Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer. |
| Mouse anti-tubulin β III (Tuj1) | Biolegend | MMS-435P | 1:500 dilution |
| Mouse monoclonal anti-αSMA | Sigma | A5228 | 1:200 dilution |
| Mouse monoclonal anti-AFP | R&D Systems | MAB1368 | 1:50 dilution |
| Mouse monoclonal anti Oct3/4 | Santa cruz | Sc-5279 | 1:50 dilution |
| Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-035 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | 1408 | Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
| Petri dish (35mm) | Thermo Scientific Nunc | 153066 | |
| Petri dish (60mm) | Thermo Scientific Nunc | 150288 | |
| Pregnant mare's serum gonadotropin | Foligon | Foligon-1000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
| Rabbit policlonal anti-Sox2 | Merck Millipore | AB5603 | 1:200 dilution |
| T75 falcon | Thermo Scientific | 130190 | |
| Trypsin-EDTA 10x | BioWest | X0930 | Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution |
References
- Biswas, A., Hutchins, R. Embryonic stem cells. Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).
- Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. PNAS. 72 (4), 1441-1445 (1976).
- Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nat Prot. 9 (3), 559-574 (2014).
- Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336 (6200), 688-690 (1988).
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
- Brook, F. A., Gardner, R. L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proc Nat Acad Sci U S A. 94 (11), 5709-5712 (1997).
- Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer. Lab Invest. 82 (12), 1765-1767 (2002).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Wakayama, S., et al. Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies. Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).
- Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).
- Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Lab Press. New York. (2003).
- Lee, K. H. Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture. Pluripotent Stem Cells. , 85-115 (2013).
- Ma, Y., et al. Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res Ther. 3 (29), (2012).
- Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).
- Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells. Cytotechnology. 58 (3), 173-179 (2008).
- Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines. Int. J. Dev. Biol. 38 (2), 385-390 (1994).
- Gonzalez, J. M., et al. Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency. Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).
