Summary
この資料では、効率的に派生し、胚盤胞の段階でマウス胚からの多能性幹細胞株を培養するプロトコルについて説明します。
Abstract
マウス胚性幹細胞 (mESC) の導出は、着床前の胚からの多能性細胞が確立されたプロセスです。これらの行は、自己更新または特定の条件の下で区別するための能力を保持します。これらのプロパティにより mESC、再生医療、疾患モデル作製、および組織エンジニア リングの研究に有用なツールです。寛容なマウス系統白血病阻害因子を添加した培地でフィーダー細胞から胚盤胞培養 mESC 行高導出効率 (60 ~ 80%) を取得するための単純なプロトコルを説明します。プロトコルは、派生メディア (2i 中) に 2 つの小分子阻害剤のカクテルの簡単な付加によって効率的に mESC 行を非感受性マウス系統から派生にも適用できます。準備とフィーダー細胞、コレクションと mESC 行のマウス胚および派生のカルチャとカルチャのカルチャに関する詳細な手順を提供しています。このプロトコルは、特殊な機器を必要としないし、基本的な哺乳類の細胞の文化の専門知識を持つ任意の研究室で実施することができます。
Introduction
胚性幹細胞 (ESC) は、自己更新または [特定の条件1を区別する能力を保持する着床前胚由来多能性細胞です。これらのプロパティに基づいて、esc キー、再生医療、疾患モデル作製、組織工学研究2便利なツールとなっています。
ESC は、初めて着床前マウス胚、低成功3,4マウス ESC (mESC) 線を元から派生しました。長年、導出効率残った多能性体外を維持が困難なのため、低。その上フィーダー細胞の5導出の効率を向上させる存在促進コロニーの添付ファイルと、核型安定性6、多能性維持の改善にプロトコル リードのいくつかの変更。最も重要なだった白血病抑制因子 (LIF) のまた mESC 培7、8、129S2 寛容な背景9からの胚の使用と mESC を添加した培地での培養が定義されています。血清、潜在的な差別化要因10の無料。最近では、説得力のある証拠はまた mESC 培 (2 i として知られている) するシグナル伝達経路の 2 つの小分子変調のカクテルの多能性を維持するために最善であることを示しています。マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ (MAPK) 経路を阻害することによって分化信号を減らす、PD0325901 MEK 阻害剤の GSK3β 阻害剤 CHIR99021 は、低密度で細胞の生存を高める組み合わせから成るカクテル 2i11wnt シグナル経路を活性化。
本稿では効率的に mESC 行をマウス胚盤胞に由来する単純なプロトコルをについて説明します。LIF と血清交換12導出培にフィーダー細胞に寛容な系統からの胚を培養標準の手順を従ってください。このプロトコル、mESC ラインは、2 i の中で得られたものと同等の効率で派生できます。これにもかかわらず、非寛容な系統を扱うときに多能性維持、または可能性のある問題を回避する 2 i を追加できます。
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Protocol
動物と Autònoma · デ · バルセロナの人間研究に関する倫理委員会、部門 d の以下のセクションに記載されている動物の使用を承認されている ' Ramaderia、育種釣り私ジャナラリター ・ デ ・ カタルーニャ (プロトコル #8741) の Alimentació
。1 フィーダー細胞の不活性化とストレージ
注: ひと包皮線維芽細胞 (HFF-1) 以前 90% 胎仔ウシ血清 (FBS) と 10% ジメチル ジメチルスルホキシド (成る凍結溶液 1 mL でフリーズした。DMSO)、使用するまで液体窒素に保存されます
。- 37 ° C の水浴のバイアルを浸すことによって HFF 1 (1 mL) のセラムを解凍 。
- 極低温バイアルの解凍の内容を予め温めておいたダルベッコに追加 ' 更新イーグル s ' s 媒体 (DMEM) 10% を 1:10 に FBS 希釈 。
- T75 フラスコで希薄化後のセル (10 mL) をシードし、37 ° C、5% CO 2 でそれらを文化します 。
- 次の日は、DMSO の残党を排除するために媒体を変更します。メディアを削除し、10% に予め温めておいた DMEM の 10 mL を追加 FBS 。
- 、タイトピロー包装文化し、文化融合の段階に達するまで、媒体ごとの 48 h を変更します。これは約 7 〜 10 日かかる場合があります 。 不活化ソリューションを準備、10% を DMEM にマイトマイシン C を希釈する
- 10 μ G/ml の最終的な集中に FBS。37 ° C、5% CO 2 で 3 h の不活化ソリューションと細胞をインキュベートします 。
- 不活性化ソリューションを削除、三度と 2 mL のハンクス平衡塩ソリューション (HBSS) マイトマイシン C の残骸を除去するために細胞をすすいでください 。
- 不活化セルを解除するには、予め温めておいたトリプシン EDTA 溶液の 1 mL を追加し、37 ° C、5% CO 2 で 5 分間インキュベートします 。
- が切断されていることを確認する倒立顕微鏡下で細胞を観察 (0.3 の開口または NA 10 × 対物)。そうでない場合は、37 ° C、5% CO 2 で、数分間インキュベートします。再び倒立顕微鏡下で細胞を確認してください 。
- 細胞塊を分離するためにソリューションをパスツール ピペット ピペットします 。
- 10 %fbs と再懸濁します DMEM の 4 つの mL を追加することによって酵素のソリューションを中和します 。
- 細胞懸濁液の因数と HBSS で 1: 100 希釈を行います。セルの数を決定する、ノイバウアーに希釈の 10 μ L を読み込む ' s 商工会議所。(0.45 NA で 20 × 対物) 倒立顕微鏡下で商工会議所の大きな四角形の 1 つであるセルをカウントします。
- 4 つの大きな正方形の合計にカウントの繰り返し。N (N) のセルの合計数を計算するセルの数の平均値を = 容量希釈 x 10 4 x x カウント 。
- 上清 200 x g. 破棄で 5 分間サンプルの残りの部分を遠心し、凍結 1 mL あたり 10 の 6 セルの濃度の溶液にペレットを再懸濁します 。
- 因数 10 6 セル (1 mL) 各セラム チューブの懸濁液。冷凍コンテナーでセラム チューブを置き、-80 でフリーズ ° C
- 次の日は、液体窒素でセラム チューブを格納します 。
2。フィーダー細胞培養
- 導出プロセスを開始する前に 1 〜 4 日雪解けセラム 1 x 10 の 6 を含む不活化 37 で水浴の HFF 1 セル ° C
- で解凍 HFF 1 の 1:6 希釈加温 10 %fbs と 37 温 DMEM を ° C
- 豚皮から予め温めておいた 0.2% のゼラチンの 500 μ L で 4 ウェル プレートのすべての井戸を埋めるし 37 ° C で 10 分間でプレート
- は井戸からゼラチンの 500 μ L を取り外してタイトピロー包装希釈を 500 μ l 添加します。井戸の底にタイトピロー包装の均一な分布を確実にプレートがみ合います。円形の動きを避けるために、井戸の中央に細胞が集中 。
- 少なくとも 24 h 各ウェルで不活化タイトピロー包装の単分子膜を取得する CO 2 を 37 ° C、5% でプレートをインキュベートします 。
- 次の日は (0.3 NA と 10 × 対物) 倒立顕微鏡下で細胞を観察し、接続されているが、均一を確認します。DMSO の残党を排除するために媒体を変更します。メディアを取り出して、10% に予め温めておいた DMEM を 500 μ l 添加 FBS 。
3。胚のコレクションおよび文化
- 4 日採卵前に、管理 5 IU 妊馬の ' 6-12 週齢の雌マウスに腹腔内投与による s 血清ゴナドトロピン
。 注: 他のマウス系統から女性を使用できますが、129S2 または B6CFAF1 株から雌を使用している我々。それにもかかわらず、とき (例えば CBA)、非寛容な株から雌と作動媒体補わなければなりません 2i と手順 4.2 で説明した 。
- 後 48 h と腹腔内投与によるひと絨毛性ゴナドトロピンの 5 IU を管理する少なくとも 8 週齢、1:1 の比率で男性と女性を仲間します。次の日、男性から女性を区切ります 。
- 採卵前日は 35 mm 細胞培養シャーレ 4 mg/ml のウシ血清アルブミン (BSA) KSOMaag 培のいくつかの 40 μ L 滴を準備し、鉱物油滴を完全にカバーするためにプレートを埋めます。媒体を平衡に CO 2 を 37 ° C、5% で皿をインキュベートします 。 胚操作ピペットを準備する
- は熱長い先端ガラス パスツール ピペット ブンゼン バーナーを使用しての薄い部分です。柔らかい、炎から引き出すし、2 つの端を離れて引っ張る。希望の長さにそれを破る。先端の内径が 100-150 μ m にする必要があります 。
- 頚部転位 45 48 h の ポストの coitum (パソコン) による雌マウスを安楽死させる 。
- は、湾曲した滑らかな鋭いハサミで皮膚とまっすぐ鋭いハサミで腹膜を切断することによって腹腔内を公開するマウスを解剖します。ピンセットで 1 つ子宮をつかむ、まっすぐ鋭いはさみを使用して卵管を切断し、Hepes バッファー CZB 培地 (HCZB) 13 37 に ° c. その他の卵管を削除する処理を繰り返します 。 2 細胞期胚を収集する時計鉗子によって行われて
- フラッシュ HCZB 搭載 1 mL 注射器で卵管
。 注: フラッシュの針を 30 G の注射針を準備する、最後をカットし、研磨石の鈍い先端に地面します 。
- 口のピペットなどの器具を使用して、胚をピックアップ、HCZB で洗って、胚盤胞期まで 37 ° C、5% CO 2 で事前に準備された胚培養皿にそれらを文化します。50 胚までそれぞれ 40 μ L ドロップで培養することができます。胚開発顕微鏡の下のすべての 24 h を監視します
。 注: 代わりに、胚を 体外で 胚培養を短縮する胚盤胞の段階で収集できます。この場合、3.5 から 4.5 p. c. の日に女性を安楽死させる、子宮を解剖します。HCZB とフラッシュと 。
4。幹細胞誘導
- 胚の播種日 派生プレートの準備
- 100 μ M β 2 メルカプトエタノール、1 を DMEM 培地を補うことで派生メディアの準備 x 非必須アミノ酸、血清の置換、および 10 の 20 3 U/mL LIF。
- に応じて、また追加 MEK 阻害剤 PD0325901 の 1 μ M と 3 μ M の GSK3 阻害剤 2i 媒体を取得する CHIR99021 です 。
- 取るから不活化タイトピロー包装 (ステップ 2.6) の単分子膜 4 ウェル プレート、インキュベーター。メディアを取り出して、予め温めておいた派生中の 800 μ L を各ウェルに追加します。インキュベーターにプレートを返します 。
- 透明帯除去、播種胚
- 35 mm 細胞培養シャーレ酸性 Tyrode 3 30 μ L 滴と準備 ' s ソリューション 14 派生中 3 30 μ L 滴。鉱物油と滴をカバーし、37 で皿を保つ ° C
- は、インキュベーターから胚培養皿を取る。一つずつ酸性 Tyrode 文化滴から、胚盤胞を転送 ' s ソリューション ドロップ操作、胚のピペットを使用しています。可能な場合のみ、拡張胚盤胞導出プロセスを開始するを選択します 。
- は、顕微鏡下で透明帯消化を監視します。透明帯が消えると、すぐに、派生中ドロップする酸性 Tyrode を洗浄するために胚盤胞を転送 ' s ソリューションです 。
- 各ウェルにインキュベーターと種子 1 つ透明帯除去胚盤胞フィーダーから 4 も派生板細胞を取る 。
- 4 よく導出プレート インキュベーターと 37 ° C、5% CO 2 で文化に戻ります 。
- 監視幹細胞成長および媒体を変更
- 培養倒立顕微鏡 (0.45 NA で 20 × 対物) の下のすべての 24 h を監視します。幹細胞の分化、腫れの屈折細胞周囲の副産物かもさておき、フィーダー細胞を押すなどの兆候があるかどうかに注意することが重要だ 。
- 毎日、文化の媒体を変更します。インキュベーターから 4 ウェル プレートを取る、各ウェルからメディアを取り出して、使用される場合は LIF と 2 i、予め温めておいた導出培の 800 μ L を追加します。(6-8 日) 観察される増殖までの文化を維持します 。
5。幹細胞文化およびメンテナンス
- 準備 Kolle のようなハンドルおよび幹細胞操作ピペット。フォロー ステップ 250-300 μ m の先端の内径と幹細胞操作ピペットを準備するのに 3.4 Kolle のようなハンドルを準備するのにプルのパスツール ピペットの他の部分を使用します。熱し、フックを得るまで形状します 。
- は、インキュベーター外 4 ウェル培養プレートを取るし、顕微鏡下で伸長を探します。分化細胞や副産物を囲む餌箱を押してすぐハンドルを使用します
。 メモ: 最終的な分化、伸長を避けるためには、それは副産物の端から差別化されたすべてのセルを削除することが重要です 。
- 幹細胞操作ピペットと伸長を吸引し、50 μ L のトリプシン-EDTA ドロップで新しい料理 。
- メスを使用して、両方の機械的および酵素の分解およびそれのためにいくつかの部分に突起をカットします 。
- すぐにトリプシンを中和するために導出中の新鮮なドロップに伸長フラグメントを転送します 。
- は、フィーダーの単分子膜の新しい 4 ウェル プレートに伸長フラグメントを転送します。ウェルあたり最大 10 個の断片を転送し、誘導培地で 37 ° C および 5% の CO 2 とそれらを文化します 。
- は、mESC の樹立を検討する前に、少なくとも 6 週間の幹細胞のような文化を維持します。他のすべての日とサブカルチャー媒体を変更して週に 1 回 。
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Representative Results
このプロトコルに従い以上伸長形成の 95% の文化 (図 1 a) の最初の週後達成する必要があります。6 継代後 mESC の樹立は、60-80% の平均成功の実験的複製間で変数です。2i 添加ほど向上しません結果 129S2 のバック グラウンドを持つものなど、寛容なマウス系統を操作するときが、非寛容な系統を使用するときに必要です。
マウス esc キー コロニー フラットの形をした正規の形態を示すべきである (図 1 b-C) 治療せず培養した場合のエッジを定義や 2i で培養された (図 1)。コロニー周辺分化標識の提示をする必要があります (図 1E-F) を破棄されます。得られた導出効率は予期される値より低い場合、この細胞死を引き起こすことができる (図 1-H) の分化を促進すると増殖を避けるために頻繁にそれらをより多くの mESC 植民地とサブカルチャーの成長を制御します。
図 1: MESC 植民地文化の代表的なイメージです。(A) 伸長後の最初の週は文化通路 10 提示に定義された端 (B C) いくつか mESC コロニーと平らな形状は、胚盤胞から派生しました。MESC ラインから (D) コロニーは 2i と扱われます。(E, F)半分化 mESC コロニー周辺分化サイン (点線の楕円で強調表示) の例です。(G, H)生い茂った mESC 植民地悪い形態と差別化の兆候を提示の例です。スケール バー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
文化の 6 週後に得られる推定 mESC ラインの幹細胞性を確認するには、多能性と分化マーカーの存在が評価されなければなりません。MESC ラインは Oct4、Sox2 のような多能性マーカー陽性にする必要があります (図 2 の B)。さらに、10% を DMEM にフィーダー細胞なしで 10 日間、細胞を培養によって自発的な分化誘導後 FBS、mESC 行予定外胚葉のマーカーの β-チューブリン クラス III (Tuj1) の肯定的な (図 2)中胚葉のマーカー α-平滑筋アクチン (αSMA) (図 2 D) と内胚葉のマーカー α-フェトプロテイン (AFP) (図 2 e)。評価 5 つのマーカーに陽性線だけ真 mESC ラインを考察し、誘導効率の計算のためにこうして使用されます。通常、これは、現在のプロトコルを使用して生成された事実上すべての mESC 行に対応します。
図 2: 多能性と分化マーカーに対する代表的な蛍光。mESC 植民地 (A) Oct4 (緑) を表現する (B) と Sox2 (赤)。(C) Tuj1 (緑)、(D) αSMA (緑) と (E) AFP (緑) を表現する mESC 植民地は区別されます。すべてのイメージの核物質は、ヘキスト (青) と counterstained です。スケール バー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
MESC 行派生は日常的に多くの実験室で使用されるよく知られているプロシージャが、その効率は常に多能性維持を妨げることができる複数の要因のために期待高。本稿で示す、ステップバイ ステップ、シンプルで信頼性のあるプロトコルを使用して高効率 mESC ラインを確立する方法。これらの効率は文献で報告されたものに似ています。
最大の効率を確保するため、毎日、細胞を制御することが重要ですし、毎日、以降示されたポイントだけ説明。これは細胞死と分化を促進するためにコロニーの増殖を避けるために不可欠です。これはまた細胞生存率を減らすことができるためにも、継代培養中植民地のトリプシン-EDTA への暴露を可能な限り減らすために重要です。
もう一つの重要な要因は、フィーダー細胞のソースと彼らの文化です。いくつかの研究は、マウス、マウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEF) HFF STO 線維芽細胞が均等に esc キー導出と文化15をサポートすることが実証しています。ただし、HFF は文化16MEF と STO より 2 倍以上耐久性まで成長する mESC のより多くの時間を許可します。したがって、HFF の使用は、余分な mESC サブカルチャーを回避できます。
得られた導出効率よりも低い場合報告された結果、派生中、特に血清交換のすべてのコンポーネントを慎重にチェックすることが重要です。血清交換の異なるバッチは導出効率17,18の差につながります。したがって、各の新しいバッチは、使用前にテストする必要があります。
導出の効率にも大きく影響 mESC 派生のための源として使用される胚の遺伝的背景を指摘することが重要です。確かに、マウス系統は、寛容な菌株 (129S2 C57BL6 など) と標準条件9,19下 mESC ラインをもたらす能力に応じて (CBA、うなずく FVB など) 非寛容な系統に分類されています。ここで報告されるプロトコル正常に適用できます胚系統の両方のタイプからカクテル 2 i は、非寛容な系統から胚を操作するとき導出中に含まれている限り。2i 媒体は mESC 行数6遺伝的背景に関係なく、多能性を維持するために信号のパターンを調整することができます。主な制限は、mESC 線耐性分化になって 2i で培養した培養20日中に取得した強く信号パターンのため。この制限を克服するために取得した信号を弱めるため分化誘導する前に少なくとも 1 つの通路の 2 i なし mESC 行を培養する必要があります。
全体的にみて、この作品は、単として可能な主な難しさとそれらを克服する方法を指差して手順を示すことによって mESC 派生の練習を軽減できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
ジョナタン ルーカスは、フィーダー細胞培養、動物のケアのための Servei Estabulari デ ラ UAB とビデオを記録するための Domènec ・ マルティンと技術的な援助を感謝いたします。この作品は Ministerio デ エコノミア y Competitividad AGL2014-52408-R、ジャナラリター ・ デ ・支えられているカタルーニャ 2014 SGR 524。MVC は、PIF UAB フェローシップの受益者です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL sryringe | BD | 309628 | |
| 2-β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350-010 | |
| 4-well plate | Thermo Scientific Nunc | 176740 | |
| Acidic Tyrode's solution | Home-made | See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M. | |
| BSA | Sigma | A3311 | |
| Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Molecular Probes - Invitrogen | A-21200 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies. |
| CHIR990212 | Axon Medchem | 1386 | Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
| CryoTube | Thermo Scientific Nunc | 3754518 | |
| DMSO | Sigma | 41640 | |
| DMEM | BioWest | L0107 | |
| FBS | BioWest | S1810 | Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC |
| Flushing needle | BD | 304000 | Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone |
| Gelatin from porcine skin | Fluka | 48724 | Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month. |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594 | Molecular Probes - Invitrogen | A-11037 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody. |
| HBSS | BioWest | L0611 | |
| Hepes-buffered CZB | Home-made | See composition in Chatot et al, 1989 | |
| Human chorionic gonadotropin | Divasa-Farmavic | Veterin-Corion 3000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
| Human foreskin fibroblasts | ATCC | ATCCSCRC-1041 | For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen. |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles. |
| KSOMaag Evolve | Zenith Biotech | ZEKS-050 | Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use. |
| Leukemia Inhibitory Factor | Merk Millipore | ESG1106 | |
| Mice | Charles River/Harlan | It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor. | |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | Embryo tested. Photosensitive. |
| Mitomycin C | Serva | 2980501 | Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer. |
| Mouse anti-tubulin β III (Tuj1) | Biolegend | MMS-435P | 1:500 dilution |
| Mouse monoclonal anti-αSMA | Sigma | A5228 | 1:200 dilution |
| Mouse monoclonal anti-AFP | R&D Systems | MAB1368 | 1:50 dilution |
| Mouse monoclonal anti Oct3/4 | Santa cruz | Sc-5279 | 1:50 dilution |
| Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-035 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | 1408 | Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
| Petri dish (35mm) | Thermo Scientific Nunc | 153066 | |
| Petri dish (60mm) | Thermo Scientific Nunc | 150288 | |
| Pregnant mare's serum gonadotropin | Foligon | Foligon-1000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
| Rabbit policlonal anti-Sox2 | Merck Millipore | AB5603 | 1:200 dilution |
| T75 falcon | Thermo Scientific | 130190 | |
| Trypsin-EDTA 10x | BioWest | X0930 | Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution |
References
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