本协议描述了成人果蝇脑组织的解剖和免疫。具体地说, 该协议强调了使用果蝇蘑菇体和感光神经元作为神经元子集的例子, 可以准确地用来揭示神经发育的许多方面的一般原则。
神经系统的发展涉及一系列的事件, 由几个信号通路和监管网络协调。在这些通路中所涉及的许多蛋白质是哺乳动物和其他真核生物之间的进化守恒, 如果蝇果蝇, 表明在这些过程中存在类似的组织原则。生物.重要的是,果蝇已被广泛用于识别哺乳动物所需的细胞和分子机制, 包括神经发生、分化、轴突引导和突。苍蝇也被成功地用于模拟各种人类神经发育疾病。在这里, 我们描述了一个协议的 step-by 一步的显微解剖, 固定和荧光定位的蛋白质在成人果蝇脑。本议定书的重点是两个例子的神经元种群, 蘑菇体神经元和视网膜光, 并包括可选的步骤, 以跟踪个别蘑菇体神经元使用镶嵌分析与阻遏细胞标记 (MARCM) 技术。示例数据来自野生类型和突变的大脑, 并显示了一个简单的描述的评分标准的轴突引导缺陷。虽然这项协议突出了两个行之有效的抗体来调查蘑菇体和感光神经元的形态, 其他的果蝇脑区和蛋白质在其他脑区的定位也可以使用此协议进行调查。
虽然果蝇神经系统比人类和啮齿类动物要小, 但它的复杂性提供了一个强大的、平易近人的模型来更好地理解其脊椎动物的对应。在许多情况下, 脊椎动物和苍蝇的基因组编码非常相似的蛋白质, 支配神经系统发育的机制。事实上, 在脊椎动物神经系统发育所需的许多基因中, 有基因在苍蝇中, 包括那些参与控制模式、神经形成和轴突引导的信号通路1,2,3 ,4,5。例如, 淳是哺乳动物轴突引导所需的配体和四腹果蝇6、7、8。虽然淳最初是从胚胎鸡脑组织6中分离出来的, 但随后的研究表明, 淳在果蝇8的胚胎中枢神经系统 (CNS) 发育过程中起到了保守作用。其他研究在胚胎的果蝇中枢神经系统中使用了遗传屏幕, 以确定在果蝇和脊椎动物9中寻所需的保守配体和受体。
虽然在过去广泛使用的胚胎飞行中枢神经系统, 以确定配体, 受体和细胞内信号蛋白所需的轴突引导8,9, 最近的工作研究了许多方法这些蛋白质也控制寻的决定在发展的后期阶段。具体地说, 对蘑菇体 (MB) 和视网膜感光神经元发育的研究 (图 1) 提供了对控制寻、突触形成、轴突修剪和神经元的其他几个方面的机制的洞察力。开发10,11,12,13,14,15,16,17。感光神经元将苍蝇视网膜连接到被称为椎板和髓质的成人大脑区域, 对于将视觉信息传递到大脑是至关重要的 (通过18,19查看), 而蘑菇体神经元位于飞脑中央, 是学习和记忆所需的20,21。光感受神经元和蘑菇体的固有神经元, 称为肯扬细胞, 利用进化保守的扩散和依赖关系的轴突引导机制, 找到他们的后目标。除了在成人果蝇中可见外, 感光细胞和 MB 神经元还可以直接在幼虫和蛹中进行可视化, 抗体或报告基因22,23,24,25。在不同的发育时间点, 能够很容易地将这两组神经元形象化, 这促进了它们作为神经发育的许多方面的高超模型的使用。
除了被用来作为一个模型来了解正常神经系统的发展机制, 最近的研究表明, 苍蝇也可以作为准确的模型的各种人类疾病, 包括脆性 X 综合征 (单口)26, 智力残疾 (ID)27,28,29,30,31, 以及其他32。例如, 为了研究最近与人类智力残疾相关的基因 ZC3H14 的分子功能, 我们用苍蝇 ZC3H14 同源的空等位基因建立了一个 ID 飞行模型, 称为 Nab230。缺乏 Nab2 的苍蝇有严重的记忆损伤和扩展聚 (A) 尾, 综述在人类患者或患者的细胞系中观察到的东西33,34。重要的是, 苍蝇缺乏 Nab2 也显示严重的大脑形态学缺陷在他们的成年蘑菇体34, 类似的是什么观察到苍蝇缺乏单口综合征基因, FMR135。因此, 苍蝇可以作为一个重要的模型有机体, 研究正常的大脑发育和疾病, 扰乱它。
最后, 可访问的高吞吐量方法来监测行为, 结合大量可用的遗传工具, 使果蝇的模型有机体的选择, 以确定大脑区域, 控制复杂的行为, 如学习和记忆, 睡眠, 求爱, 干渴, 和其他36,37,38,39。一个特别有用的工具, 是在飞行遗传学家的 “工具箱” 的中心是 GAL4/UAS 系统 (图 2)。此系统40,41使用 Gal4 转录激活剂的组织特异性表达, 以增加上游激活序列 (无人操作系统) 的基因或转基因下游的表达。这一系统的修改使得研究人员能够精确控制特定神经元的兴奋性42,43, 过度或击倒特定的感兴趣的基因44, 45, 分析 real-time 钙动力学体内46, 并表达报告基因标记神经元谱系41。GAL4/UAS 系统与有丝分裂重组的结合也允许创建镶嵌分析与阻遏细胞标记 (MARCM) 系统12,47。MARCM 已广泛应用于单神经元追踪, 以确定轴突制导所需的蜂窝信号元件12,47。虽然这些和其他技术提供了一些宝贵的洞察力的细胞机制所需的神经系统功能, 大多数要求,果蝇大脑首先被解剖;仔细的大脑切除需要保留正确的大脑形态和大脑区域之间的连接模式。下面的协议使用蘑菇体和感光神经元作为例子神经元群体, 因为它引导你通过解剖和荧光染色成人果蝇的大脑。
上面描述的解剖和可视化方法可用于各种免疫和实时成像应用。我们已经概述了一个一般的免疫协议, 并强调了一种方法, 其中 MARCM 可以用来可视化轴突形态的个别蘑菇体神经元。此外, 这些一般程序也可用于成像其他脑区的固定或新解剖成人大脑48,65。在分析增强器陷阱、报告基因或模拟线66的表达模式时, 实时成像可以提供更有效的方法。为了防止在未固定组织中的 GFP 的活体成像过程中捕捉到细胞死亡, 应在1x 磷酸缓冲生理盐水 (pbs) 或 HL3 介质48中对大脑进行解剖, 在 1x pbs (或 HL3) 的桥式幻灯片上安装, 并在少于 15-20 分钟的图像中进行成像. 护理也应采取, 以消除尽可能多的气管从解剖大脑之前的成像, 因为它可以干扰可视化 GFP 荧光。
而染色条件, 以评估蘑菇体和感光神经元的形态学是相对完善的24,61,67, 在这些细胞的特定蛋白的本地化类型可能需要进行大量的故障排除和优化。特别是, 应优化几个关键步骤, 包括抗体稀释、阻断缓冲成分浓度和固定, 以产生最可重现和可靠的结果。首先, 应确定原抗体的最佳浓度。虽然商业上可得的抗体通常有一个建议的稀释 (我们通常开始使用这种浓度), 这些价值是很少确定的经验, 在果蝇组织。因此, 测试一系列的主要抗体稀释, 在制造商的开始建议的范围以上, 往往导致更具体的染色。虽然初级抗体稀释对染色精度有显著影响, 应精确确定, 但在含有溶液的初级抗体中, 时间大脑的孵育可能相差很大, 对整体结果影响不大。例如, 我们已经观察到类似的结果时, 孵化解剖大脑与 Fas2 抗体初级抗体的两个, 三, 甚至四天在4° c。虽然我们建议至少两个晚上, 我们还培养了一夜之间的主抗体溶液的大脑和获得可重复染色。重要的是, 在室温下 (或在4° c 的一晚), 限制大脑在二次抗体中孵育到3小时的时间, 有助于限制次级抗体与脑组织的非特异性结合。
其次, 可能需要使用额外的 “阻断” 试剂来消除不需要的背景信号。选择包括增加 NGS 的浓度到 ~ 10%, 增加 1-10% 牛血清白蛋白 (BSA) 的阻断和主/二级抗体溶液, 或 pre-adsorption 的主抗体过夜在4° c 与果蝇胚胎 (见引用68, 2.9 节, 步骤 3)。
虽然我们已经写了上述协议使用 PTN 作为建议的缓冲所有固定, 洗涤和抗体孵化步骤, 组织固定在其他缓冲区 (如进进和 PEM, 列出在材料表) 可能导致深刻的差异信号强度。例如, 以前的研究表明, 当组织固定在 PBS 的传统4% 甲醛中时, 细胞周期蛋白 E 在幼虫形象盘中是无法检测到的, 但是当组织在进进的缓冲中被固定时, 它是清晰可见的 (Ken Moberg, 个人通信和引用69)。除了缓冲成分的变化, 改变组织固定的时间和温度也可以显著影响荧光染色, 并可以根据经验确定如果需要。一般情况下, 固定时间应足够长, 以使细胞成分有足够的交联, 并能长期维持细胞的整体形态, 同时限制足以防止 over-crosslinking 和 “掩埋” 蛋白质表位。因此, 在最初优化新获得的初级抗体的染色条件时, 我们通常将固定时间限制在大约20分钟, 并且通常会在更冷的温度下修复组织。
在任何免疫荧光实验中都应包括多种控制, 以研究原发性和继发抗体的特异性以及转基因/遗传背景对观察表型的影响。为了确定主要的抗体是否是专门用来识别蛋白质的兴趣, 苍蝇组织缺乏这种蛋白质和/或组织表达的蛋白质应包括作为控制。额外的纯化抗原蛋白也可以被包括来确定是否主要抗体承认其他表位在苍蝇脑。最后, 当主抗体被省略时出现的任何荧光信号都代表所选二次抗体的非特异性结合水平。
还应包括一些重要的控制, 以评估遗传背景或转基因的存在对染色强度或神经元形态学的贡献。例如, 在图 5中的 MARCM 实验中使用的苍蝇包含多个转基因 (hsFLP、UAS-CD8-GFP、FRT82B、浴盆和 #62; GAL80 和 OK107-GAL4), 每一个都应分别分析其对蘑菇体形态的影响。在最起码的情况下, 应分析含有 OK107-GAL4 和 UAS-CD8-GFP 的苍蝇的蘑菇体形态。通过对含有 hsFLP 和 FRT82B 的苍蝇进行分析, 也可能需要评估热休克和 Flp 重组生产对蘑菇体发育的影响。虽然 MARCM 可以提供重要的洞察力, 是否一个给定的蛋白质自主控制轴突指导, 需要的控制数量, 以准确地作出这一结论可能是一个小的限制这一技术。在不太复杂的实验中, 类似的控制也适用。例如, 进行一个实验, 其中GAL4/UAS系统与 rna 干扰的转基因结合使用, 并在所有神经元中的一种感兴趣的蛋白质的击倒表达。在这个实验中, 至少有两个转基因将存在: 一个泛神经元 GAL4 驱动程序, 如elav-GAL4,和无人参与干扰转基因。除了果蝇在同一蝇中转基因的实验条件外, 还应研究转基因单飞蝇中的蘑菇体神经元的形态。
最后, 为了确定是否有兴趣的蛋白质表达的蘑菇体神经元, 通常是必要的 co-stain 的大脑与抗体 Fas2。另外, 荧光蛋白, 如 GFP, RFP, 或膜绑定 CD8-GFP 也可以使用GAL4/UAS系统表达, 并与识别感兴趣的蛋白质的抗体结合使用。由于 Fas2 只承认形成蘑菇体α和β裂片的 fasciculated 轴突, 使用 GAL4-driven, 膜结合 CD8-GFP 对标记蘑菇体神经元特别有用。
轴突引导的缺陷往往不是100% 渗透, 即使是同一基因型的大脑也可能表现出一定的变异性。因此, 当分析新产生的突变等位基因的缺陷, 蘑菇体或感光寻, 应利用不同的基因和方法的组合。文献中的大多数研究使用几种不同的方法来研究蛋白质是否在控制轴突引导中发挥细胞自主作用: i) 纯合空蝇寻缺陷的分析 (优选使用不同的怒江ll 等位基因), ii) 寻缺陷的分析苍蝇缺乏的蛋白质只在神经元 (通常通过 rna 干扰), iii) MARCM 分析寻缺陷, 和 iv) 的抢救实验中的基因 re-expressed 在神经元的纯合空苍蝇.理想的情况下, 每个基因型的几十个脑应分析的缺陷, 神经元形态学。
虽然这里描述的协议主要集中在固定组织内的蛋白质的荧光定位, 这项技术的未来应用正在开发的图像活体脑组织。一旦大脑被解剖 (通常在细胞培养基中), 它们就可以在25° c 下培养数天。这些ex 体内培养方法正在开发中, 目的是研究各种生物过程, 例如促进轴突再生的蛋白质活性70,71, 细胞内信号动力学72和神经元开发73。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢博士和 Alysia Vrailas 在最初的教学 SMK 脑解剖技术。我们还要感谢肯 Moberg 的实验小组成员, 特别是克里斯。从发育研究杂交瘤库中获得了 Fas2 (1D4) 和 chaoptin (24B10) 的抗体。抗体24B10 被 DSHB Benzer 和南四湖 Colley24,60,61, 抗体1D4 由科里古德曼22,23,56存入 DSHB。飞行股票是从布卢明顿股票中心获得的。我们还要感谢俄亥俄州农业研究和发展中心 (OARDC) MCIC 成像中心, 利用共焦显微镜对图4A 和 B 中的大脑进行成像. SMK 得到研究院 (1 R15 HD084241-01A1) 的赠款的支持。
Microdissection forceps/tweezers | Ted Pella | 505-NM | |
Sylgard dishes | Living Systems Instrumentation | DD-50-S-BLK | Available from amazon.com |
Fas2 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 | |
Chaoptin Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 24B10 | |
GFP Antibody | Aves Lab | GFP-1010 | |
Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody | ThermoFisher | A-11039 | |
Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody | ThermoFisher | A-21236 | |
20% paraformaldehyde | Electron Microscope Services | RT15713 | |
VectaShield | Vector Labs | H-1000 | |
SuperFrost Plus Slides | ThermoFisher | 99-910-01 | |
Coverslips | ThermoFisher | 12-553-454 | |
Na Phosphate Buffer monobasic | Sigma | S3139 | |
Na phosphate Buffer dibasic | Sigma | S3264 | |
Triton X 100 | Sigma | X100-100ml | |
fingernail polish | Electron Microscope Services (EMS) | 72180 | |
stereomicroscope | Leica S6D with KL300 LED light source | ||
9-well dish (spot plate) | VWR | 89090-482 | |
nutator/rocker | Fisher | 22-363-152 or 88-861-041 | |
35mm dish | Genesee Scientific | 32-103 | |
Sylgard | Fisher | 50-366-794 | |
Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Potential Fixation Buffers | |||
PTN Buffer | 0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed | ||
PLP buffer | 2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O | ||
PEM buffer | 0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fly Stocks available from Bloomington | |||
elav (c155)-GAL4 | BL458 | Pan-neuronal GAL4 driver | |
w*;;;OK107-GAL4 | BL 854 | GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome) | |
y(1), w(67c23); c739-GAL4 | BL 7362 | GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome) | |
y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP | BL 64305 | GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP | |
w*; 201Y-GAL4 | BL 4440 | GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome) | |
y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP | BL 64296 | GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP | |
w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub>Gal80/CyO | BL 5145 | MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome | |
w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP | BL5146 | MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome | |
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub>GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4 | BL 44408 | MARCM stock for flipping 3rd chromosome | |
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub>GAL80;OK107-GAL4 | BL44406 | MARCM stock for flipping 2nd chromosome | |
w*, hsFLP, tub>GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4 | BL 44407 | MARCM stock for flipping X chromosome | |
y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO | BL 5137 | GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein) | |
y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP | BL 5139 | MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome | |
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO | BL 28832 | MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome | |
w*; FRTG13, Tub>GAL80 | BL 5140 | MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome | |
y(1), w*;; FRT82B, Tub>GAL80 | BL 5135 | MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome |