이 프로토콜 설명 해 부와 성인 초파리 melanogaster 의 immunostaining 뇌 조직. 특히,이 프로토콜은 신경 개발의 많은 측면을 기본 일반적인 원리를 밝히기 위해 정확 하 게 사용할 수 있는 예제 신경 하위 집합으로 초파리 버섯 몸과 포토 리셉터 뉴런의 사용을 강조 표시 합니다.
신 시스템 개발 순차적 일련을의 여러 신호 경로 규제 네트워크 조정 되는 이벤트를 포함 한다. 이 경로에 관련 된 단백질의 많은 포유류와 과일 파리 초파리 melanogaster, 유사한 조직 원리의 개발 하는 동안 존재 제안 등 다른 진핵생물 사이 보존 봤을 유기 체입니다. 중요 한 것은, Drosophila 성체, 차별화, axonal 지침 및 synaptogenesis을 포함 한 포유류에 필요한 프로세스를 규제 하는 세포질이 고 분자 메커니즘을 식별 하기 위해 광범위 하 게 사용 되었습니다. 파리 또한 인간의 neurodevelopmental 질병의 다양 한 모델을 성공적으로 사용 되어 왔습니다. 여기 우리는 단계별 기정, 고정, 및 성인 초파리 뇌 내 단백질의 immunofluorescent 지역화에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜 두 예제 신경 인구 버섯 몸 신경, 망막 대뇌에 집중 하 고 개별 버섯 몸 신경 Repressible 셀 마커 (MARCM) 기법으로 모자이크 분석을 사용 하 여 추적을 선택적 단계를 포함. 야생-타입 및 돌연변이 두뇌에서 예제 데이터 axonal 지도 결함에 대 한 채 점 기준의 간략 한 설명과 함께 표시 됩니다. 이 프로토콜 하이라이트 두 잘 설립 항 체 버섯 몸 및 포토 리셉터 뉴런, 다른 초파리 뇌 영역 및 다른 뇌 영역 내에서 단백질의 지 방화의 형태를 조사 하는 동안 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 조사.
초파리 신 경계 인간과 설치류 보다 작습니다, 하지만 그 복잡성 척추 대응 이해를 강력 하 고 친근 한 모델을 제공 합니다. 대부분의 경우에서 척추와 파리의 게놈 신 시스템 개발의 메커니즘을 지정 하는 매우 비슷한 단백질을 인코딩합니다. 사실, 많은 유전자의 필요한 척추 신경 개발에 대 한 포함 하 여, 파리에 orthologs 관계가 신호 경로에 컨트롤 패턴, 성체, 및 axonal 지도1,2,3 ,,45. 예를 들어 netrin 포유류에 D. melanogaster6,,78axonal 지도에 필요한 ligand 이다. Netrin 미 발달 병아리 뇌 조직6에서 원래 고립 된 동안, 후속 연구 밝혀졌다 그 netrin 초파리8미 발달 중앙 신경 시스템 (CNS)의 개발 하는 동안 보존된 역할을 담당. 다른 연구 보존된 ligands와 초파리 및 척추 동물9길에 필요한 수용 체를 식별 하는 배아 초파리 CNS에서에서 유전 스크린을 사용 했습니다.
최근 작품의 많은 방법을 조사는 배아 비행 CNS는 ligands, 수용 체, 그리고 세포내 신호 단백질 axonal 안내8,9에 필요한 식별 하는 과거에 광범위 하 게 사용 되었다, 이 단백질은 또한 개발의 나중 단계 동안 길 결정을 제어합니다. 특히, 버섯 몸 (MB) 및 포토 리셉터 망막 신경 개발 (그림 1)의 조사는 제어 길, 시 냅 스 형성, 축 삭 가지 치기, 그리고 신경의 다른 여러 측면 메커니즘에 대 한 통찰력 제공 하고있다 개발10,11,12,13,14,15,,1617. 포토 리셉터 신경 세포는 lamina 라는 성인 두뇌의 지역에 비행 망막 연결 되며 골 수와 뇌 (18,19의 검토), 버섯 몸 신경 동안 시각적 정보를 릴레이 대 한 중요 한 중앙 비행 뇌에 위치 하 고 학습 및 메모리20,21에 필요한. 포토 리셉터 신경 및 Kenyon 셀 이라고 하는 버섯 시체의 내장 신경 그들의 시 냅 스 후 목표를 찾을 수 봤이 보존된 diffusible 연락처-종속 axonal 지도 및 메커니즘을 활용 합니다. 성인 파리에 표시 되 고, 이외에 포토 리셉터와 MB 뉴런 수 있습니다 또한 직접 구상 될 애벌레 및 번데기 항 체 또는 리포터 유전자22,23,,2425에. 쉽게 다른 발달 시간 지점에서 신경 세포의 두 집합을 시각화 하는 기능 신경 개발의 여러 측면에 대 한 최상의 모델으로 그들의 사용을 승진 했다.
정상적인 신 시스템 개발의 메커니즘을 이해 하는 모델로 사용 되 고, 이외에 최근 학문은 설명 했다 파리도 다양 한 허약한 X 증후군 (FXS)26 포함 하 여 인간의 질병의 정확한 모델로 사용할 수 있습니다. , 지적 장애 (ID)27,,2829,30,31, 그리고 다른 사람32. 예를 들어 ZC3H14의 분자 기능 연구, 최근 인간의 지적 장애에 연결 하는 유전자 만들었습니다 ZC3H14 ortholog의 Nab230라는 null 대립 유전자를 사용 하 여 ID의 비행 모델. 파리 Nab2 부족 심각한 메모리 장애가 있고, 인간 환자에서 관찰은 무슨 업과 확장 많은 꼬리, 또는 환자 파생 셀 라인33,34. 중요 한 것은, 파리 Nab2를 또한 부족 그들의 성인 버섯 시체34, 무슨 파리 FXS 증후군 유전자 FMR135부족에서 관찰은 유사한 심각한 두뇌 형태학 결함을 표시 합니다. 따라서, 파리는 정상적인 두뇌 개발 및 그것을 방해 하는 질병을 연구 하는 중요 한 모델 생물으로 사용할 수 있습니다.
마지막으로, 동작, 사용 가능한 유전 도구의 광대 한 배열을 함께 모니터링 높은 처리량 메서드의 액세스 가능성 확인 초파리 모델 유기 체와 같은 복잡 한 동작을 제어 하는 뇌 영역을 식별에 대 한 선택의 학습 및 메모리, 수 면, 구애, 갈증, 그리고 다른36,,3738,39. 비행 유전학의 “도구 상자”의 센터에 있는 1 개의 특히 유용한 도구가입니다 GAL4/UAS 체계 (그림 2). 이 시스템40,41 유전자 또는 transgenes 다운스트림의 상류 활성화 순서 (UAS)의 식을 높이기 위해 조직 특정 표현의 Gal4 transcriptional 활성 제를 사용 합니다. 이 시스템의 수정 허용, 예를 들어 정확 하 게 제어할 특정 뉴런42,43, overexpress 또는 노크 다운 관심44, 의 특정 유전자의 흥분 연구원 45, 실시간 칼슘 역학 vivo에서46, 분석 하 고 신경 계보41를 리포터 유전자를 표현. 또한 Repressible 셀 마커 (MARCM) 시스템12,47와 모자이크 분석의 창조에 대 한 허용 mitotic 재결합 GAL4/UAS 시스템의 조합입니다. MARCM는 axonal 지도12,47에 필요한 세포 신호 구성 요소를 식별 하기 위해 단일 신경 추적에 광범위 하 게 사용 되었습니다. 이들과 다른 기술을 신 경계 기능에 필요한 세포질 기계 장치에 다양 한 중요 한 통찰력 제공, 비록 대부분 필요는 초파리 뇌 먼저 수 해 부; 두뇌의 주의 제거는 두뇌 지구 사이 정확한 두뇌 형태학 및 연결 패턴을 유지 해야 합니다. 다음 프로토콜 사용으로 버섯 몸과 포토 리셉터 뉴런예 신경 인구로 안내 하는 절 개 하 고 immunofluorescent 성인 얼룩 초파리 두뇌.
위에서 설명한 해 부 및 시각화 방법을 immunostaining의 다양 한에서 사용할 수 있습니다 하 고 이미징 응용 프로그램을 라이브. 우리 일반 immunostaining 프로토콜을 설명 했습니다 하 고 있는 MARCM를 사용할 수 있는 개별 버섯 몸 뉴런의 axonal 형태를 시각화 하는 방법 중 하나를 강조 했습니다. 또한, 다른 뇌 영역에서 고정 된 이미지에 대 한 이러한 일반적인 절차를 사용하실 수 있습니다 또는 갓 해 부 성인 두뇌48,65. 예를 들어 증강 트랩, 리포터 유전자 또는 모방 라인66의 표현 패턴을 분석할 때 라이브 영상 보다 효율적인 접근을 제공할 수 있습니다. 방지 하기 위해 떼어낸된 조직에서 GFP의 라이브 영상 동안에 세포 죽음에서 아티팩트를 캡처, 두뇌 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 또는 HL3 미디어48x 1에 해 부, 다리 슬라이드 PBS (또는 HL3), x 1에 탑재 된 고 미만 15-20 분 관리에에서 몇 군데 또한 GFP 형광의 시각화를 방해할 수 있기 때문에, 이미징, 이전 해 부 두뇌에서 가능한 많은 기도 제거로 이동 한다.
버섯 몸과 포토 리셉터 뉴런의 형태를 평가 하기 위한 얼룩 조건이 상대적으로 잘 설립24,61,67이 셀에 대 한 관심의 특정 단백질의 지역화 하는 동안 종류는 광범위 한 문제 해결 및 최적화 필요할 수 있습니다. 특히, 항 체 희석, 차단 버퍼 구성 요소 농도, 및 고정를 포함 하 여 몇 가지 중요 한 단계는 가장 재현 가능 하 고 신뢰할 수 있는 결과를 생성 최적화 되어야 합니다. 첫째, 기본 항 체의 최적 농도 결정 되어야 합니다. 비록 상업적으로 사용할 수 있는 항 체 자주 권장된 희석 (그리고 우리는 종종 처음 그 농도 사용 하 여 시작), 초파리 조직에 이러한 값 경험적으로 결정 거의 됩니다. 따라서, 테스트 범위 위와 제조업체의 시작 제안 자주 아래 좀 더 구체적인 얼룩이 지기 귀착되는 1 차적인 항 체 희석의 시리즈. 1 차적인 항 체 희석 얼룩 정확도에 큰 영향을 미칠 수 있습니다 정확 하 게 결정 되어야, 시간 두뇌는 포함 하는 1 차적인 항 체에서 알을 품을 하는 동안 솔루션 전체 결과에 거의 영향와 상당히 달라질 수 있습니다. 잠복기 해 부 Fas2 항 체 1 차적인 항 체와 두뇌 2, 3, 4 ° c.에도 4 일 때 예를 들어 우리가 비슷한 결과 관찰 해야 적어도 2 박 권장, 하지만 우리는 밤에 대 한 1 차적인 항 체 솔루션에 두뇌를 incubated 또한 있고 재현 얼룩을 얻은. 중요 한 것은, 두뇌는 실내 온도 (또는 4 ° C에서 1 박) 3 h 이차 항 체에 알을 품을 하는 시간의 양을 제한 뇌 조직에도 일반적인 바인딩을 2 차 항 체의 도움이 됩니다.
둘째, 그것은 제거 원치 않는 배경 신호를 추가 “차단” 시 약을 사용 하 여 필요할 수 있습니다. 옵션 ~ 10%, 1-10% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 또는 추가 하는 차단 및 1 차/2 항 체 솔루션, 초파리 배아 (참조 4 ° C에서 하룻밤 주 항 체의 사전 흡착 NGS의 농도 증가 등 참조68, 단원 2.9, 3 단계).
모든 고정을 위한 제안 버퍼 PTN를 사용 하 여 위의 프로토콜을 작성 하는 동안 세척, 그리고 항 체 외피 단계, 조직 고정 (PLP, PEM, 자료 테이블에 나열 된) 등 다른 버퍼에 심오한 차이 발생할 수 있습니다. 신호 강도입니다. 예를 들어 이전 학문은 E 조직, PBS에 희석 하는 전통적인 4 %paraformaldehyde 고정 때 애벌레 imaginal 디스크에서 감지 되지 않습니다 하지만 조직 PLP 버퍼 (켄 Moberg, 개인 고정 때 명확 하 게 표시 됩니다 설명 했다 통신, 및69참조). 버퍼에 변화 뿐만 아니라 조직 고정도 크게 영향을 미칠 수 immunofluorescent에 대 한 시간과 온도 변경 하는 구성 요소 얼룩 하 고 필요한 경우 경험적으로 결정 될 수 있다. 일반적으로, 고정 시간 충분 세포 구성 성분의 충분 한 가교에 대 한 및 장기적인 유지 관리 하면서 전반적인 세포 형태학의 제한 이상 가교 및 단백질 epitopes의 “매장”을 방지 하기 위해 충분. 따라서, 처음 새로 구입한 1 차 항 체에 대 한 착 조건을 최적화, 우리 일반적으로 정착 시간 약 20 분을 제한 하 고 종종 추운 온도에서 조직을 고정 시킬 것 이다.
몇 가지 컨트롤이 어떤 면역 형광 실험 관찰된 표현 형에 transgenes/유전 배경 효과 뿐만 아니라 1 차 및 이차 항 체의 특이성 조사에 포함 되어야 합니다. 특히 사용 되 고 기본 항 체 관심사의 단백질을 인식 하는지 여부를 확인, 파리 부족이 단백질 또는 단백질 overexpressing 조직에서에서 조직 컨트롤로 포함 되어야 합니다. 초과 순화 된 항 원 단백질의 1 차적인 항 체 비행 두뇌에서 다른 epitopes를 인식 하는지 여부를 확인 하려면 포함할 수 있습니다. 마지막으로, 모든 형광 신호 1 차 항 체는 생략 하는 경우 현재 선택한 2 차 항 체에 의해 일반적인 바인딩 수준을 나타냅니다.
몇 가지 중요 한 컨트롤 또한 유전 배경 기여 또는 transgenes 착 강도 또는 신경 형태학의 존재를 평가 하기 위해 포함 되어야 합니다. 예를 들어 그림 5 에서 MARCM 실험에 사용 되는 파리에는 여러 transgenes (hsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, 욕조 > GAL80, 및 OK107 GAL4), 각각의 버섯 몸 형태에 대 한 효과 대 한 별도로 분석 해야 합니다. 파리의 아주 최소, 버섯 몸 형태에 OK107 GAL4 및 UAS-CD8-GFP를 분석 되어야 합니다. 열 충격의 효과 평가 하기 위해 해야 할 수도 있습니다를 Flp recombinase 생산 분석 하 여 버섯 몸 개발에 포함 하는 hsFLP 및 FRT82B 있습니다. MARCM는 주어진된 단백질 axonal 지도 제어 하는 여부에 자율적으로 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다,이 결론을 정확 하 게 확인 하는 데 필요한 컨트롤 수가이 기술의 마이너 제한 수 있습니다. 덜 복잡 한 실험에서 유사한 컨트롤 또한 적용 됩니다. 예를 들어 GAL4/UAS 시스템은 모든 신경 세포의 단백질의 최저의 식 RNAi transgene와 함께에서 사용 되는 실험 걸릴. 이 실험에서 두 개 이상의 transgenes 있을 것입니다: elav GAL4 등 UAS RNAi transgene 팬 신경 GAL4 드라이버. 포함 하는 각 이러한 transgenes 혼자 파리에 버섯 몸 신경의 형태 실험 조건 어디 파리 같은 비행에 모두 transgenes 항구 이외에 조사 한다.
마지막으로, 관심사의 단백질은 버섯 몸 신경 표현 여부를 확인 하려면 Fas2 항 체와 공동 얼룩 두뇌에 일반적으로 필요가 있다. 또는, 형광 단백질 같은 GFP, RFP, 또는 막 바인딩된 CD8-GFP GAL4/UAS 시스템을 사용 하 고 관심사의 단백질을 인식 하는 항 체와 조합 사용 표현 또한 수 있습니다. Fas2 버섯 몸 α와 β 돌출부를 형성 하는 fasciculated 축 삭 인식, 이후 GAL4 기반, 막 도약 CD8-GFP를 사용 하 여 버섯 몸 뉴런을 표시 하는 데 특히 유용 했습니다.
결함 axonal 지도에 자주는 아니지만 100% 침투 하 고 심지어 두뇌 동일한 유전자 형의 몇 가지 변화를 보여줄 수 있습니다. 따라서, 새로 분석 버섯 몸 또는 포토 리셉터 길 돌연변이 체 대립 유전자 결함에 대 한 생성, 다른 대립 유전자 및 접근의 조합을 활용 합니다. 문학에서 대부분의 연구는 몇 가지 다른 방법을 단백질 axonal 지도 제어 셀 자치 역할 여부 조사를 사용 하 여: 나) 길의 분석 (선호를 사용 하 여 다른 뉴 homozygous null 파리에 결함ll 대립 유전자), ii) 길의 분석 파리의만 (일반적으로 통해 RNAi), 신경 단백질 부족에 결함 iii) 길 결함과 iv의 MARCM 분석) 구조 유전자가 homozygous null의 뉴런에서 다시 표현 하는 실험 파리. 이상적으로, 유전자 형 당 몇 다스 두뇌 신경 형태학에 결함에 대 한 분석 되어야 합니다.
프로토콜 설명 여기 고정된 조직 내에서 단백질의 immunofluorescent 지역화에 주로 초점을 맞추고, 비록이 기술의 몇 가지 미래의 애플 리 케이 션 이미지 라이브 뇌 조직에 개발 되고있다. 일단 두뇌는 (일반적으로 셀 문화 미디어)에 해 부, 그들은 다음 수 교양 25 ° c.에 몇 일 동안 이러한 비보 전 자란 메서드는 다양 한 생물 학적 과정, 부상70,71, 세포내에 따라 축 삭 재생을 촉진 하는 단백질의 활동을 조사 하기 위하여 개발 되 고 있다 신호 역학72, 그리고 신경 개발73.
The authors have nothing to disclose.
우리는 처음 가르치는 SMK 뇌 해 부 기술 Changhui 박세리 Alysia Vrailas 모 티 머를 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 비판적 원고를 읽기 위한 켄 Moberg의 랩 그룹, 특히 크리스 라운드의 회원을 감사 합니다. Fas2를 인식 하는 항 체 (1D 4) 및 chaoptin (24B10) 개발 연구 Hybridoma 은행에서 입수 했다. 항 체 24B10 시 모어 관련 및 난시 Colley24,,6061로 DSHB에 예금 되었다, 항 체 1D 4 코리 굿 맨 22,,2356여는 DSHB에 예금 되었다. 플라이 주식 블루밍턴 재고 센터에서 얻은 했다. 우리는 또한 오하이오 농업 연구와 개발 센터 (OARDC) MCIC 이미징 센터 confocal 현미경의 사용에 대 한 이미지 그림 4A에서 두뇌를 감사 하 고 싶습니다 및 B. SMK NICHD에서 교부 금에 의해 지원 됩니다 (1 r 15 HD084241-01A1).
Microdissection forceps/tweezers | Ted Pella | 505-NM | |
Sylgard dishes | Living Systems Instrumentation | DD-50-S-BLK | Available from amazon.com |
Fas2 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 | |
Chaoptin Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 24B10 | |
GFP Antibody | Aves Lab | GFP-1010 | |
Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody | ThermoFisher | A-11039 | |
Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody | ThermoFisher | A-21236 | |
20% paraformaldehyde | Electron Microscope Services | RT15713 | |
VectaShield | Vector Labs | H-1000 | |
SuperFrost Plus Slides | ThermoFisher | 99-910-01 | |
Coverslips | ThermoFisher | 12-553-454 | |
Na Phosphate Buffer monobasic | Sigma | S3139 | |
Na phosphate Buffer dibasic | Sigma | S3264 | |
Triton X 100 | Sigma | X100-100ml | |
fingernail polish | Electron Microscope Services (EMS) | 72180 | |
stereomicroscope | Leica S6D with KL300 LED light source | ||
9-well dish (spot plate) | VWR | 89090-482 | |
nutator/rocker | Fisher | 22-363-152 or 88-861-041 | |
35mm dish | Genesee Scientific | 32-103 | |
Sylgard | Fisher | 50-366-794 | |
Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Potential Fixation Buffers | |||
PTN Buffer | 0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed | ||
PLP buffer | 2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O | ||
PEM buffer | 0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fly Stocks available from Bloomington | |||
elav (c155)-GAL4 | BL458 | Pan-neuronal GAL4 driver | |
w*;;;OK107-GAL4 | BL 854 | GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome) | |
y(1), w(67c23); c739-GAL4 | BL 7362 | GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome) | |
y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP | BL 64305 | GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP | |
w*; 201Y-GAL4 | BL 4440 | GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome) | |
y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP | BL 64296 | GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP | |
w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub>Gal80/CyO | BL 5145 | MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome | |
w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP | BL5146 | MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome | |
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub>GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4 | BL 44408 | MARCM stock for flipping 3rd chromosome | |
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub>GAL80;OK107-GAL4 | BL44406 | MARCM stock for flipping 2nd chromosome | |
w*, hsFLP, tub>GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4 | BL 44407 | MARCM stock for flipping X chromosome | |
y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO | BL 5137 | GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein) | |
y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP | BL 5139 | MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome | |
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO | BL 28832 | MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome | |
w*; FRTG13, Tub>GAL80 | BL 5140 | MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome | |
y(1), w*;; FRT82B, Tub>GAL80 | BL 5135 | MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome |