Denne protokollen beskriver disseksjon og immunostai-av voksen Drosophila melanogaster hjernen vev. Spesielt fremhever denne protokollen bruken av Drosophila sopp kropp og photoreceptor nerveceller som eksempel neuronal delsett som nøyaktig kan brukes å avdekke generelle prinsipper mange aspekter av neuronal utvikling.
Nervesystemet utvikling omfatter en sekvensiell serie av hendelser som koordineres av flere signalveier og regulatoriske nettverk. Mange av proteiner involvert i disse baner er evolutionarily konservert mellom pattedyr og andre eukaryoter, for eksempel frukt fly Drosophila melanogaster, noe som tyder på at lignende organisering prinsipper finnes under utviklingen av disse organismer. Viktigere, har Drosophila vært brukt mye å identifisere cellulære og molekylære mekanismer regulere prosesser som kreves i pattedyr inkludert neurogenesis, differensiering, axonal veiledning og synaptogenesis. Fluer har også blitt brukt med hell å modellere en rekke menneskelige neurodevelopmental sykdommer. Her beskriver vi en protokoll for trinnvis microdissection, fiksering og immunofluorescent lokalisering av proteiner i voksen Drosophila hjernen. Denne protokollen fokuserer på to eksempel neuronal bestander, sjampinjong kroppen nerveceller og retinal fotoreseptorer, og inkluderer valgfrie trinnene for å spore individuelle sopp kroppen nerveceller med mosaikk analyse med en Repressible celle markør (MARCM)-teknikk. Eksempeldata fra både vill-type og mutant hjerner vises sammen med en kort beskrivelse av en kriteriene for axonal veiledning mangler. Mens denne protokollen høydepunkter to veletablerte antistoffer for å undersøke morfologi av sopp kropp og photoreceptor nerveceller, andre Drosophila hjernen regioner og lokalisering av proteiner i andre områder av hjernen kan også være undersøkt bruker denne protokollen.
Selv om Drosophila nervesystemet er mindre enn mennesker og gnagere, gir sin kompleksitet en kraftig, imøtekommende modell for å forstå sine virveldyr kolleger. I mange tilfeller kode genomer virveldyr og fluer ligner proteiner som styrer mekanismer av nervesystemet utvikling. Faktisk, kreves mange av genene for neuronal utvikling i virveldyr har orthologs i fluer, inkludert de som er involvert i signalveier at kontroll mønstre, neurogenesis og axonal veiledning1,2,3 ,4,5. Netrin er for eksempel en ligand kreves for axonal veiledning i pattedyr og D. melanogaster6,7,8. Mens netrin var opprinnelig isolert fra embryonale chick hjernen vev6, har studier avdekket at netrin spiller en bevart rolle under utviklingen av embryonale sentralnervesystemet (CNS) i Drosophila8. Andre studier har brukt genetisk skjermer i embryonale Drosophila CNS for å identifisere bevarte ligander og reseptorer kreves for pathfinding i både Drosophila og virveldyr9.
Mens embryonale fly CNS har vært brukt mye i siste for å identifisere ligander reseptorer og intracellulær signalnettverk proteiner kreves for axonal veiledning8,9, har siste verk undersøkt måtene som mange av disse proteinene også styre pathfinding beslutninger under senere stadiene av utviklingen. Spesielt har sopp kroppen (MB) og retinal photoreceptor nervecellen utvikling (figur 1) gitt innsikt i mekanismer som kontroll pathfinding, synapse formasjon, axon beskjæring og flere andre aspekter av neuronal utvikling10,11,12,13,14,15,16,17. Photoreceptor neurons koble fly netthinnen til områder av voksen hjernen kalt lamina og forlengede og er avgjørende for videresending visuell informasjon til hjernen (anmeldt av18,19), mens sopp kroppen nerveceller sentralt ligger i fly hjernen og kreves for læring og hukommelse20,21. Både photoreceptor neurons og iboende neurons av sopp organer, kalt Kenyon celler, benytte evolusjonært bevarte diffusible og kontakt-avhengige axonal veiledning mekanismer for å finne sine etter synaptic mål. I tillegg til å være synlig i voksen fluer, kan photoreceptor og MB neurons også direkte visualiseres i larver og pupae antistoffer eller reporter, gener,22,,23,,24,,25. Muligheten til å enkelt visualisere disse to sett av neurons på ulike utviklingsmessige tidspunkt har fremmet bruken som suveren modeller for mange aspekter av neuronal utvikling.
I tillegg brukes som modell for å forstå mekanismene av normal nervesystemet utvikling, har nyere studier vist at fluer kan også tjene som nøyaktige modeller av en rekke menneskelige sykdommer, inkludert skjøre X syndrom (FXS)26 , Intellektuelle funksjonshemming (ID),27,,28,,29,,30,,31, og andre32. For eksempel for å studere molekylære funksjonen til ZC3H14, et gen nylig knyttet til menneskelige intellektuelle handikap, vi opprettet et fly modell av ID ved å bruke en null allelet fly ZC3H14 ortholog, kalt Nab230. Fluer mangler Nab2 har alvorlige minne impairments og utvidet poly(A) haler, recapitulating hva er observert i menneskelige pasienter eller pasienten avledet cellen linjer33,34. Viktigere, vise fluer mangler Nab2 også alvorlig hjernen morfologi defekter i deres voksen sopp organer34, analog med hva er observert i fluer mangler FXS syndrom genet, FMR135. Dermed kan fluer tjene som en viktig modell organisme både normale hjernens utvikling og sykdommer som forstyrrer den.
Til slutt, tilgjengelighet av høy gjennomstrømning metoder å overvåke atferd, kombinert med det store utvalget av tilgjengelige genetisk verktøy, gjør Drosophila en modell organisme valgfrihet for å identifisere områdene av hjernen som kontrollerer komplekse atferd, som læring og hukommelse, søvn, frieri, tørst og andre36,37,38,39. Et spesielt nyttig verktøy som er i midten av et fly genetiker “verktøykasse” er GAL4/UAS systemet (figur 2). Dette systemet40,41 bruker vev bestemte uttrykk for Gal4 transcriptional aktivator for å forhøye uttrykket av gener eller effekter av transgener nedstrøms av en oppstrøms aktivere sekvens (UAS). Modifikasjoner av dette systemet har tillatt forskere til, for eksempel kontroller nøyaktig excitability av bestemte neurons42,43, overexpress eller sammenleggbare bestemte gener rundt44, 45, analysere sanntid kalsium dynamikken i vivo46og express reporter gener merke neuronal overleveringslinjer41. Kombinasjonen av GAL4/UAS systemet med mitotisk rekombinasjon også tillatt for etableringen av mosaikk analysen med en Repressible celle markør (MARCM) system12,47. MARCM har blitt brukt mye i enkelt Nevron sporing for å identifisere mobilnettet signalnettverk komponenter kreves for axonal veiledning12,47. Selv om disse og andre teknikker har gitt en rekke verdifulle innsikt på cellulære mekanismer kreves for nervesystemet fungerer, krever de fleste at Drosophila hjernen først være dissekert; forsiktig fjerning av hjernen er nødvendig for å beholde riktig hjernen morfologi og tilkobling mønstre mellom områder av hjernen. Følgende protokollen bruker sopp kropp og photoreceptor nerveceller someksempel neuronal populasjoner som fører deg gjennom dissection og immunofluorescent flekker av voksen Drosophila hjerner.
Disseksjon og visualisering metoden beskrevet over kan brukes i en rekke immunostaining og live tenkelig søknadene. Vi har skissert en generell immunostai-protokoll og har fremhevet en måte der MARCM kan brukes til å visualisere axonal morfologi av individuelle sopp kroppen nerveceller. Dessuten, disse generelle framgangsmåtene kan også brukes for imaging andre hjernen regioner i fast eller nylig dissekert voksen hjerner48,65. Live bildebehandling kan gi en mer effektiv fremgangsmåte når analysere uttrykk mønstre enhancer feller, reporter gener eller etterligne linjer66, for eksempel. Å hindre fange gjenstander fra celledød under live bildebehandling av GFP i unfixed vev, hjernen bør være dissekert i 1 x fosfat bufret saltvann (PBS) eller HL3 media48montert på broen lysbilder i 1 x PBS (eller HL3) og fotografert i mindre enn 15-20 min. omsorg bør også tas å fjerne så mye luftrøret som mulig fra dissekert hjernen før bildebehandling, siden det kan forstyrre visualisering av GFP fluorescens.
Mens flekker betingelser for å vurdere morfologi av sopp kropp og photoreceptor neurons er relativt godt etablert24,61,67, lokalisering av et bestemt protein av interesse i disse celle kanskje krever omfattende feilsøking og optimalisering. Spesielt skal flere viktige tiltak, inkludert antistoff fortynning, blokkerer buffer komponent konsentrasjon og fiksering, være optimalisert for å generere mest reproduserbare og pålitelige resultater. Først bør den optimale konsentrasjonen av primære antistoff fastsettes. Selv om kommersielt tilgjengelig antistoffer ofte har en foreslått fortynning (og vi ofte først starte med den konsentrasjonen), disse verdiene avgjøres sjelden empirisk på Drosophila vev. Derfor teste en rekke primære antistoff fortynninger som rekkevidde over og under produsentens Start forslag ofte resulterer i mer spesifikk farging. Mens primære antistoff fortynning kan ha en betydelig effekt på flekker nøyaktighet og bør kan nettopp bestemmes, tid hjernen er ruges i primære antistoff som inneholder kan løsninger variere betydelig med liten effekt på det samlede resultatet. For eksempel har vi observert lignende resultater når rugende dissekert hjerne med Fas2 antistoffer primære antistoffer for to, tre eller enda fire dager på 4 ° C. Selv om vi anbefaler minst to netter, har vi også ruges hjerner i primære antistoff løsning for en enkelt natt og fått reproduserbar flekker. Viktigere, hjelper begrense tiden hjerner er ruges i sekundære antistoffer til 3t ved romtemperatur (eller en natt på 4 ° C) grense uspesifisert binding av sekundær antistoffer til hjernevev.
Andre, kan det være nødvendig å bruke flere “blocking” reagenser for å eliminere uønskede bakgrunn signal. Alternativene inkluderer øker konsentrasjonen av NGS ~ 10%, legge til 1-10% Bovine Serum Albumin (BSA) til blokkering og primær/sekundær antistoff løsninger eller før adsorpsjon av primære antistoffer overnatting på 4 ° C med Drosophila embryo (se Referanse68, avsnitt 2.9, trinn 3).
Mens vi har skrevet ovenfor protokollen bruker PTN som foreslåtte bufferen for alle fiksering, kan vask, og antistoff inkubasjon trinn, vev fiksering i andre buffere (som PLP og PEM, oppført i Materialer tabell) resultere i dype forskjeller i signalstyrken. For eksempel har tidligere studier vist at Cyclin E er undetectable i larver imaginal plater når vev er løst i tradisjonelle 4% paraformaldehyde fortynnet i PBS, men er klart synlig når vev er løst i PLP buffer (Ken Moberg, personlig kommunikasjon, og referanse69). Endringer i bufferen komponenter, endre klokkeslett og temperatur for vev fiksering kan også påvirke immunofluorescent flekker og kan bestemmes empirisk hvis nødvendig. Vanligvis fiksering tid skal være lang nok å tillate tilstrekkelig crosslinking av cellulære komponenter og langsiktig vedlikehold av samlet mobilnettet morfologi samtidig begrenset nok til å unngå over-crosslinking og “begrave” av protein epitopes. Derfor når utgangspunktet optimalisere flekker betingelsene for en nyervervede primære antistoff, vi vanligvis begrenser fiksering tid til ca 20 min og ofte løse vev på kaldere temperaturer.
Flere kontroller skal inkluderes i alle immunofluorescence eksperiment for å undersøke spesifisiteten av primære og sekundære antistoffer og effekten av effekter av transgener/genetisk bakgrunn på observerte fenotypen. For å fastslå om primære antistoffer brukes spesielt gjenkjenner protein av interesse, skal vev fra fluer mangler dette protein og/eller vev overexpressing proteinet inkluderes som kontroller. Tillegg av overflødig renset antigen protein kan også bli inkludert for å finne ut om det primære antistoffet gjenkjenner andre epitopes i fly hjernen. Til slutt, alle fluorescerende signal når primære antistoffer utelates representerer uspesifisert binding av valgte sekundære antistoffer.
Flere viktige kontroller bør også inkluderes for å vurdere bidrag av genetisk bakgrunn eller tilstedeværelse av effekter av transgener til farging intensitet eller neuronal morfologi. For eksempel fluene brukes i MARCM eksperimentet i figur 5 inneholder flere effekter av transgener (hsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, badekar > GAL80 og OK107-GAL4), hver bør analyseres separat for effekter på sopp kroppen morfologi. På en aller minste, sjampinjong kropp morfologi av fluer bør som inneholder både OK107-GAL4 og UAS-CD8-GFP bli analysert. Det kan også være nødvendig å vurdere effekten av varme sjokk og Flp recombinase produksjon på sopp kropputvikling ved å analysere fluer som inneholder både hsFLP og FRT82B. Selv om MARCM kan gi betydelig innsikt om et bestemt protein selvstendig kontrollerer axonal veiledning, kan antall kontroller å nøyaktig denne konklusjonen være en mindre begrensninger av denne teknikken. Mindre komplisert eksperimenter gjelder også lignende kontroller. For eksempel tar et eksperiment der GAL4/UAS systemet brukes i kombinasjon med en RNAi transgene å pusse uttrykk for et protein av interesse for alle neurons. I dette eksperimentet, minst to effekter av transgener vil være til stede: en pan-nevrale GAL4-driver, for eksempel elav-GAL4, og UAS-RNAi transgene. Morfologi av sopp kroppen nerveceller i fluer som inneholder hvert av disse effekter av transgener alene bør undersøkes i tillegg til eksperimentelle tilstanden der flyr havn både effekter av transgener i samme fly.
Til slutt, for å avgjøre om protein av interesse uttrykt i sopp kroppen nerveceller er det vanligvis nødvendig å co flekken hjernen med antistoffer mot Fas2. Fluorescerende proteiner som GFP og RFP membranen bundet CD8-GFP kan eventuelt også uttrykkes ved hjelp av GAL4/UAS systemet og brukt i kombinasjon med antistoffer gjenkjenne protein av interesse. Siden Fas2 bare gjenkjenner fasciculated axons som sopp kroppen α og β lobes, har bruk av GAL4-drevet, membran-bundet CD8-GFP vært spesielt nyttig for merking sopp kroppen nerveceller.
Feil i axonal veiledning er ofte ikke 100% penetrant og selv hjernen til den likt anleggspreg kan vise noen variasjon. Derfor når analysere nylig generert mutant alleler feil i sopp kroppen eller photoreceptor pathfinding, skal en kombinasjon av forskjellige alleler og tilnærminger benyttes. De fleste studier i litteraturen bruker flere ulike tilnærminger til å undersøke om et protein spiller en celle autonome rolle i å kontrollere axonal veiledning: jeg) analyse av pathfinding mangler i homozygous null fluer (fortrinnsvis med forskjellige null alleler), ii) analyse av pathfinding mangler i fluer mangler protein bare interesse neurons (vanligvis via RNAi), iii) MARCM analyse av pathfinding feil og iv) redde eksperimenter der genet er nytt uttrykt i nervecellene i homozygous null flyr. Ideelt sett bør flere dusin hjerner per genotype bli analysert for feil i neuronal morfologi.
Selv om protokollen beskrevet her hovedsakelig fokuserer på immunofluorescent lokalisering av proteiner i fast vev, blir flere fremtidige anvendelser av denne teknikken utviklet til bildet live hjernevev. Når hjernen er dissekert (vanligvis i celle kultur medier), kan de deretter kultivert i flere dager på 25 ° C. Disse ex vivo culturing metoder blir utviklet for å undersøke en rekke biologiske prosesser, som protein aktivitet som fremmer axon regenerasjon etter skade70,71, intracellulær signalnettverk dynamics72, og nevrale utvikling73.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Changhui Pak og Alysia Vrailas Mortimer for utgangspunktet undervisning SMK hjernen disseksjon teknikken. Vi takker også medlemmer av Ken Moberg lab, spesielt Chris runder, for kritisk lesing manuskriptet. Antistoffer gjenkjenne Fas2 (1 d-4) og chaoptin (24B10) ble innhentet fra utviklingsmessige studier Hybridoma banken. Antistoff 24B10 ble avsatt til DSHB med Seymour Benzer og Nansi Colley24,60,61, antistoff 1 d 4 ble avsatt til DSHB av Corey Goodman 22,23,56. Fly aksjer anskaffet fra Bloomington lager Center. Vi ønsker også å takke Ohio landbruket forskning og utvikling Center (OARDC) MCIC Imaging Center for bruk av AC confocal mikroskopet å image hjernen i figur 4A og B. SMK støttes av et stipend fra NICHD (1 R15 HD084241-01A1).
Microdissection forceps/tweezers | Ted Pella | 505-NM | |
Sylgard dishes | Living Systems Instrumentation | DD-50-S-BLK | Available from amazon.com |
Fas2 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 | |
Chaoptin Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 24B10 | |
GFP Antibody | Aves Lab | GFP-1010 | |
Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody | ThermoFisher | A-11039 | |
Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody | ThermoFisher | A-21236 | |
20% paraformaldehyde | Electron Microscope Services | RT15713 | |
VectaShield | Vector Labs | H-1000 | |
SuperFrost Plus Slides | ThermoFisher | 99-910-01 | |
Coverslips | ThermoFisher | 12-553-454 | |
Na Phosphate Buffer monobasic | Sigma | S3139 | |
Na phosphate Buffer dibasic | Sigma | S3264 | |
Triton X 100 | Sigma | X100-100ml | |
fingernail polish | Electron Microscope Services (EMS) | 72180 | |
stereomicroscope | Leica S6D with KL300 LED light source | ||
9-well dish (spot plate) | VWR | 89090-482 | |
nutator/rocker | Fisher | 22-363-152 or 88-861-041 | |
35mm dish | Genesee Scientific | 32-103 | |
Sylgard | Fisher | 50-366-794 | |
Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Potential Fixation Buffers | |||
PTN Buffer | 0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed | ||
PLP buffer | 2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O | ||
PEM buffer | 0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fly Stocks available from Bloomington | |||
elav (c155)-GAL4 | BL458 | Pan-neuronal GAL4 driver | |
w*;;;OK107-GAL4 | BL 854 | GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome) | |
y(1), w(67c23); c739-GAL4 | BL 7362 | GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome) | |
y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP | BL 64305 | GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP | |
w*; 201Y-GAL4 | BL 4440 | GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome) | |
y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP | BL 64296 | GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP | |
w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub>Gal80/CyO | BL 5145 | MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome | |
w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP | BL5146 | MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome | |
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub>GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4 | BL 44408 | MARCM stock for flipping 3rd chromosome | |
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub>GAL80;OK107-GAL4 | BL44406 | MARCM stock for flipping 2nd chromosome | |
w*, hsFLP, tub>GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4 | BL 44407 | MARCM stock for flipping X chromosome | |
y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO | BL 5137 | GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein) | |
y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP | BL 5139 | MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome | |
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO | BL 28832 | MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome | |
w*; FRTG13, Tub>GAL80 | BL 5140 | MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome | |
y(1), w*;; FRT82B, Tub>GAL80 | BL 5135 | MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome |