Summary
Ce protocole décrit la dissection et immunostaining des adultes Drosophila melanogaster tissus du cerveau. Plus précisément, ce protocole met en évidence l’utilisation de Drosophila champignon corps et photorécepteur neurones comme des sous-ensembles neuronale exemple qui peuvent être utilisés avec précision afin de découvrir les principes généraux de nombreux aspects du développement neuronal.
Abstract
Développement du système nerveux comporte une série séquentielle des événements qui se sont coordonnés par plusieurs voies de signalisation et de réseaux de régulation. Bon nombre des protéines impliqués dans ces voies sont conservés évolutionnaires entre les mammifères et les autres eucaryotes, comme la drosophile Drosophila melanogaster, suggérant que les principes d’organisation similaires existent au cours du développement de ces organismes. Ce qui est important, Drosophila a été largement utilisé pour identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires régissant les processus qui sont nécessaires chez les mammifères, y compris la neurogenèse, différenciation, guidage axonal et synaptogenèse. Les mouches ont également été utilisés avec succès pour modéliser une variété de maladies neurologiques du développement humain. Nous décrivons ici un protocole pour la microdissection étape par étape, la fixation et la localisation par immunofluorescence des protéines dans le cerveau adulte de la drosophile . Ce protocole porte sur deux populations neuronales de l’exemple, les neurones corps aux champignons et photorécepteurs rétiniens et comprend les étapes facultatives pour tracer les neurones individuels du corps aux champignons par analyse de mosaïque avec une technique de marqueur de cellules répressible (MARCM). Les données exemple de cerveaux sauvage et mutantes apparaissent ainsi qu’une brève description d’un critère de notation pour les défauts de guidage axonal. Si ce protocole met en évidence deux anticorps bien établis pour étudier la morphologie des champignons corps et les neurones photorécepteurs, autres régions du cerveau drosophile et la localisation des protéines dans d’autres régions du cerveau peut aussi être étudié en utilisant ce protocole.
Introduction
Bien que le système nerveux de drosophile est inférieur à celle des humains et des rongeurs, sa complexité fournit un modèle puissant, facile d’approche pour mieux comprendre ses homologues vertébrés. Dans de nombreux cas, les génomes de vertébrés et mouches codent des protéines très similaires qui régissent les mécanismes de développement du système nerveux. En fait, plusieurs des gènes requis pour développement neuronal chez les vertébrés ont orthologues chez les mouches, y compris ceux impliqués dans les voies de signalisation qui contrôle patterning, neurogenèse et guidage axonal1,2,3 ,4,5. Par exemple, la nétrine est un ligand requis pour guidage axonal chez les mammifères et de d. melanogaster6,7,8. Tandis que la nétrine a été isolé à l’origine d’embryon de poulet de tissu du cerveau6, des études ultérieures ont révélé que la nétrine joue un rôle conservé au cours du développement du système nerveux central embryonnaire (CNS) dans drosophile8. Autres études ont utilisé des écrans génétiques dans l' embryon Drosophila CNS pour identifier des ligands conservées et récepteurs requis pour l’axonal dans drosophile et vertébrés9.
Alors que la mouche embryonnaire CNS a été largement utilisée dans le passé pour identifier les ligands des récepteurs et les protéines de signalisation intracellulaires requis pour guidage axonal8,9, travaux récents a étudié la façon dont beaucoup de ces protéines contrôlent aussi les décisions de pathfinding lors des étapes ultérieures du développement. Plus précisément, enquête du corps aux champignons (MB) et le développement de neurone photorécepteur rétinien (Figure 1) a fourni les mécanismes que pathfinding de contrôle, la formation des synapses, élagage axone et plusieurs autres aspects de neuronale développement10,11,12,13,14,15,16,17. Les neurones photorécepteurs connectent la rétine mouche aux régions du cerveau adulte appelée limbe et médullaire et crucial pour relayer l’information visuelle vers le cerveau (évaluée par18,19), tandis que les neurones corps champignons sont centralement situé dans le cerveau de mouche et sont nécessaires pour l’apprentissage et la mémoire de20,21. Les neurones photorécepteurs et les neurones intrinsèques des organes aux champignons, appelées cellules de Kenyon, utilisent des mécanismes évolutionnaires conservées guidage axonal diffusible et dépendante du contact pour trouver leurs cibles post-synaptiques. En plus d’être visible dans les mouches adultes, photorécepteur et MB neurones peuvent également être directement visualisées dans les larves et les nymphes avec anticorps ou journaliste gènes22,23,24,25. La possibilité de visualiser facilement ces deux ensembles de neurones à différents moments du développement a favorisé leur utilisation comme superbes modèles pour de nombreux aspects du développement neuronal.
Outre son utilisation comme un modèle pour comprendre les mécanismes du développement normal du système nerveux, des études récentes ont démontré que les mouches peuvent aussi servir de modèles précis d’une grande variété de maladies humaines, y compris le Syndrome Fragile de X (FXS)26 , La déficience intellectuelle (ID)27,28,29,30,31, etc.32. Par exemple, pour étudier la fonction moléculaire des ZC3H14, un gène récemment lié à la déficience intellectuelle humaine, nous créé un modèle de mouche d’ID à l’aide d’un allèle nul de la mouche ZC3H14 orthologues, appelée Nab2,30. Mouches manque Nab2 ont des troubles de mémoire grave et prolongé la queue poly (a), récapitulant ce qui est observé chez des patients humains ou patient dérivé cellule lignes33,34. Ce qui est important, mouches manque Nab2 également affichent cérébrales graves défauts de morphologie dans leurs organes de champignons adultes34, semblable à ce qui est observé chez les mouches dépourvues du gène du syndrome FXS, FMR135. Ainsi, mouches peuvent servir comme un organisme modèle important d’étudier les développement normal du cerveau et les maladies qui perturbent l’il.
Enfin, l’accessibilité des méthodes à haut débit pour surveiller le comportement, associé avec la vaste gamme d’outils génétiques disponibles, faire drosophile , un organisme modèle de choix pour identifier les régions du cerveau qui contrôlent les comportements complexes, tels que apprentissage et mémoire, le sommeil, la parade nuptiale, soif et autres36,37,38,,39. Un outil particulièrement utile qui est au centre de « boîte à outils » une mouche généticien est le système de GAL4/UAS (Figure 2). Ce système40,41 utilise expression spécifique des tissus de l’activateur de la transcription Gal4 afin d’augmenter l’expression des gènes ou des transgènes en aval d’une séquence d’activant en amont (UAS). Modifications de ce système ont permis aux chercheurs de, par exemple, de contrôler avec précision l’excitabilité des neurones spécifiques42,43, overexpress ou précipitation des gènes spécifiques d’intérêt44, 45, d’analyser la dynamique en temps réel de calcium en vivo46et exprimer des gènes rapporteurs pour marquer les lignées neuronales41. La combinaison du système de GAL4/UAS avec la recombinaison mitotique a également permis la création de l’analyse de mosaïque avec un marqueur de cellule répressible (MARCM) système12,47. MARCM a été largement utilisé dans le traçage seul neurone pour identifier les composants de signalisation cellulaires requis pour le guidage axonal12,47. Bien que ces autres techniques et ont fourni un certain nombre de renseignements précieux sur les mécanismes cellulaires requis pour le fonctionnement du système nerveux, la plupart exigent que le cerveau de Drosophila tout d’abord être disséqué ; enlèvement soigneux du cerveau est tenue de conserver bon cerveau patrons morphologie et connexion entre les régions du cerveau. Le protocole suivant utilise des neurones corps et photorécepteur champignons commepopulations neuronales exemple telle qu’elle vous guide à travers la dissection et cerveaux de drosophile par immunofluorescence souillant d’adulte.
Protocol
1. génétique de drosophila melanogaster et procédures facultatives de choc thermique
- Une fois les mouches ont été croisés et la progéniture F1 ont éclos, obtenir des femelles ou des mâles du génotype approprié. Selon les régions du cerveau à l’étude, les mouches doivent être prélevés tous les jours et séparés par sexe, afin que la fonction de l’âge et/ou sexuellement dimorphes patrons de connectivité de cerveau peuvent distinguer plus facilement.
Remarque : En option : si mouches sont utilisées pour l’analyse de la mosaïque avec un marqueur de cellule répressible (MARCM) analyse 12 , 47, embryons, larves ou nymphes devraient être choqué à 37 ° C pendant 30-45 min à chaleur induire la recombinaison mitotique. Afin de cibler des régions spécifiques des organes aux champignons pour analyse MARCM, choc thermique devrait être chronométré selon l’horaire déterminé par 12 et décrites dans la Figure 5 B. Si vous utilisez MARCM pour enquêter sur d’autres régions cérébrales que les organes de champignons, les expériences pilotes doivent être effectuées afin de déterminer le stade optimal pour être soumis au choc thermique. Tandis que les étapes suivantes sont écrites en ce qui concerne d’éclos vole, pharates adultes peuvent également être disséqués en suivant ces étapes, après avoir retiré la pupe.
2. Préparation de la Station de dissection
- Position le stéréomicroscope et source de lumière avec joint goosenecks optiques de fibre sur une grande table de travail. Pour favoriser les mouvements de main ferme et réduire les main " secouer " pendant la dissection, il est essentiel qu’un espace reste suffisant main et du bras est disponible autour du microscope. Veiller à ce qu’il y a environ 8 à 10 pouces de chaque côté du microscope et de 4 à 6 pouces entre la base du microscope et le bord du banc.
- De remplissage 2 ou 3 puits d’un verre plat 9 puits ou 3 puits avec 1,0 mL de tampon PTN (0.1 M Sodium Phosphate tampon pH 7,2, 0,1 % agent de surface non ioniques, voir Table des matières pour les composants de la mémoire tampon complète) et le placer à côté de la station de dissection sur la glace. Cerveaux disséqués nouvellement est transférés à ce plat et stockés jusqu’au niveau de la fixation.
- Remarque : si l’imagerie live est requise, tampon de dissection doit être 1 x de tampon Phosphate Buffered Saline (PBS) ou HL3 48. Si la localisation intracellulaire des protéines n’est requise, PBS également utilisable comme un tampon de rechange pour la dissection et de fixation. Après fixation, perméabilisation des membranes cellulaires doit alors être effectuée utilisant PTN lavages contenant 0,1 % ou 0,3 % de détergent non-ionique.
- Si PBS est utilisé pour les dissections et fixation, pointes de pipette doivent être rincé au moins une fois avec un tampon contenant du détergent (par exemple, PTN) pour empêcher le cerveau de coller pour les pointes de pipette en plastique au cours du transfert aux tubes de microcentrifuge.
- à l’aide d’un verre vide de 35 mm ou en plastique boîte de Pétri, construire un plat de dissection contenant un élastomère de silicone. En bref, mélanger les composants élastomère selon le fabricant ' s directions, versez dans des plats de 35 mm et laissez-le se polymériser pendant la nuit sur une surface plane. Élastomère contenant des plats de dissection doit servir à protéger les pointes fines de dissection forceps, qui peuvent facilement être endommagés si le contact se fasse entre la pince et une surface plus dure, comme un plat en verre. Nous achetons aussi régulièrement des plats disponibles dans le commerce de silicone recouvert des détaillants en ligne. Pour augmenter le contraste au cours de la dissection, silicone élastomère dissection plats contenant du charbon de bois inactivé (et donc de couleur noire) sont particulièrement utiles.
3. Procédure de Dissection cerveau adulte
- anesthésier 3-5 jours adulte vieux d. melanogaster avec CO 2 ou à l’aide de glace. Si à l’aide de glace, place le flacon contenant les mouches à l’envers (Branchez l’extrémité vers le bas) dans un seau de glace pour environ 5 min. Placer le flacon dans la glace à l’envers empêche vole de devenir logé dans la nourriture. Une fois que les mouches ont été anesthésiés, placez les mouches sur une séance de pad ou Pétri métal froide dans la glace ou sur un CO 2 émettant pad mouche. Si dissection cerveaux pour analyser la neurodégénérescence, mouches plus âgés peuvent également servir.
- Placer une petite quantité (150-200 µL) de PTN dans le centre de l’assiette de la dissection à l’aide d’une pipette de transfert ou d’une pipette de p200 pour créer un " bulle " du PTN. Placer le plat de la dissection sous le stéréomicroscope et ajuster l’éclairage et l’accent afin que la bulle de PTN remplit le champ de vision et est éclairée uniformément.
- Manipuler les mouches pour qu’elles soient " le ventre vers le haut " (c.-à-d., la face ventrale vers le haut) en position couchée sur le métal ou le CO 2 pad.
- En utilisant une paire de pinces #5, saisir l’abdomen d’une mouche à être disséqué et, gardant la main sur la volée, d’il submerger complètement dans la PTN sur le plat de dissection.
Remarque : Pour le reste du protocole, toutes les étapes devraient être effectuées alors que la tête est immergée dans PTN. - Une deuxième paire de pinces #5, empoignez la base de la mouche trompe et tirez sur les deux paires de pinces dehors pour détacher la tête de mouche de l’organisme. Jeter l’abdomen et du thorax. Au cours de cette étape, il est essentiel que la tête n’est pas libérée et autorisée à flotter à la surface de la PTN. Une fois que la tête est flottant, il peut être très difficile à saisir encore une fois sans s’écraser le cerveau.
Remarque : L’utilisation de cette méthode, les connexions entre le cerveau et le cordon nerveux ventral sont rompues. Si les connexions intactes entre ces régions du SNC sont tenues, un protocole de dissection alternatifs, tels que 49 , 50, doit être suivi. Si la trompe se détache de la tête de la mouche avant de retirer la tête, il y aura un trou où était la trompe. Dans ce cas, saisir la tête de mouche au bord du trou près d’un œil. Retirez ensuite la tête à l’aide d’une quantité modérée de la force tout en tirant sur les deux paires de pinces en dehors de l’autre. Parfois, lorsque la tête est éliminée de l’organisme, les restes de cordon gut et/ou ventrale de nerf adhérente à la tête et doit être retirés avant de poursuivre la dissection. - Alors qu’une paire de pinces saisit la trompe, la deuxième paire devrait saisir le bord médial de le œil droit de voler. Tirer lentement, la pince l’un de l’autre. Cette étape doit être exécutée avec une petite quantité de force latérale stable. Comme la pince se déplacer lentement en dehors de l’autre, la trompe devrait s’arracher de la tête et créer un trou central dans la cuticule de la tête. Jeter la trompe avec la première paire de pinces, sans lâcher la partie médiale de le œil droit de la deuxième paire.
Remarque : L’adulte est de d. melanogaster cerveau dans la caudale (c.-à-d. postérieur/arrière) de la région de la tête de mouche. Ainsi, la préhension de cette région de la tête doit être évitée. Dans l’idéal, seulement la rostrale (c.-à-d., avant) partie de la tête près de la rétine interne devrait être directement saisi par la pince. Le cerveau et la trachée associée doivent maintenant être visibles dans le trou central de la cuticule. En ce moment, n’importe quel fils blancs filandreuses de trachée qui sort de l’orifice peuvent être enlevés et jetés. - Avec la deuxième paire de pinces, saisissez le bord médial de la rétine gauche (au bord du trou central de la cuticule de la tête). Pour enlever les rétines et la cuticule associé, tirez lentement sur la pince de l’autre à un angle de 180 °. Comme la rétine se dissocie de la lobe optique sous-jacente, vous devriez sentir une légère diminution de la tension. Avancer lentement pour éviter de déchirer le lobe optique.
Remarque : Séparer la pince trop rapidement au cours de cette étape peut entraîner la déchirure de thlobe optique e ou perturbation des structures corporelles aux champignons. Parfois, la cuticule sera supprimée, mais des morceaux de la rétine reste attachées au lobe optique. Si les organes de champignons de l’imagerie, il n’est pas entièrement nécessaire d’enlever la rétine entière. Cependant, l’analyse des autres régions du cerveau (par exemple l’innervation des neurones rétiniens des lobes optiques cerveau) peut exiger la rétine à être complètement enlevée, tel que décrit par 48 , 51.
Remarque : Comme la rétine est lentement séparée du lobe optique sous-jacente du cerveau, le lobe optique devrait être observable comme une structure opaque blanche, recouverte de blanche, filandreuse trachée. Après avoir retiré une rétine, elle peut être ignorée. Lorsqu’on analyse le pathfinding des neurones de la rétine, notamment il faut pendant cette étape pour ne pas endommager le lobe optique. Un protocole additionnel a été consacrée la dissection et l’imagerie direct des neurones photorécepteurs est également disponible 48. - Maintenant, retirez soigneusement tout autant de la trachée visible que possible. La trachée peut déjà contenir ou remplir plus tard avec l’air, provoquant des cerveaux de flotter et, éventuellement, être perdus au cours des étapes ultérieures d’immunostaining. Pour supprimer la trachée, il a enlever le cerveau à l’aide des pinces #5 très aiguisés.
- Supprimer la rétine restant et la cuticule environnante en utilisant les deux paires de pinces pour saisir la région médiale de la rétine gauche de mouche. Soigneusement déchirure de la rétine en deux pour retirer les morceaux de la rétine et la cuticule. Dans certains cas, retirer la cuticule restante sans écraser le cerveau s’avère particulièrement difficile. Dans ces cas, nous avons trouvé que les brins restants du cordon nerveux ventral peuvent au contraire être actionnées par une paire de pinces tandis que l’autre paire de pinces sert à retirer avec précaution le dernier de la cuticule.
- à l’aide d’une pipette de p200, déplacer des cerveaux disséqués dans un puits du plat 9 ou 3 puits contenant PTN. Cerveau de même génotype devrait être regroupées ensemble dans le même bien et gardé sur glace. Il convient de fixer des tissus cérébraux dans l’heure de la dissection. Cerveau peut être fixé en petits lots et mis en commun s’il faut un plus grand nombre de cerveaux. Dans la plupart des cas, un chercheur expérimenté peut disséquer un cerveau habituellement et le transférer dans le plat en verre collection dans environ 3-5 min.
4. Fixation et procédure de coloration par immunofluorescence
- à l’aide d’une pipette de p200, transfert cerveaux disséqués de la boîte 9-cupule à un tube à microcentrifugation 0,5 mL rempli de 0,5 mL de paraformaldéhyde à 4 % dilué dans PTN. Au moins 10-15 cerveaux du même génotype peut être combinés dans un des tubes de microcentrifuge. Toutes les étapes restantes (jusqu’au montage des cerveaux sur glissières) sont remplis dans les tubes de microcentrifuge de 0,5 ml.
ATTENTION : Paraformaldéhyde (PFA) doit être manipulé sous une hotte. PFA déchets devraient être enregistrées et éliminés de façon appropriée. 20 % de paraformaldéhyde acheté en ampoules de verre peut être aliquoté dans des tubes de microcentrifuge et stockée à-20 ° C jusqu'à ce que nécessaire. - à l’intérieur d’une hotte aspirante, incuber les cerveaux de paraformaldéhyde à 4 % pendant 20 min avec une vitesse lente bascule à température ambiante.
- Après fixation, permettre aux cerveaux se déposer au fond du tube microcentrifuge par gravité.
Remarque : Parfois, le cerveau peut coller à la paroi du tube microcentrifuge. Dans ce cas, il est généralement utile de tourner latéralement le tube entre le pouce et l’index ou de tapoter très légèrement le tube sur le banc pour promouvoir le naufrage des cerveaux. - Fixateur d’enlever à l’aide d’un p1000 Pipeter et effectuer deux " rapide " lave avec 500 µL de PTN, permettant le cerveau se déposer au fond du tube microcentrifuge entre les lavages. Au cours de ces lavages rapides, une fois que tous les cerveaux ont arrangé par gravité vers le bas du tube microcentrifuge, le PTN peut être immédiatement échangé contre tampon frais ; aucune durée de lavage supplémentaire n’est nécessaire.
NOTE : En général, laissant le tampon supplémentaire dans le tube est préférable à risquer l’élimination du cerveau. Un examen attentif de l’embout de la pipette est souvent nécessaire de veiller à ce qu’aucuns cerveau n’ont été retirés par erreur le tube. Si les cerveaux ont été accidentellement dans la pointe, les verser dans le tube de microcentrifuge, attendez que le cerveau à s’installer et continuer supprimant toute PTN supplémentaire qui reste. - Après le dernier lavage rapide, utiliser une pipette p1000 pour effectuer trois " longue " lave : ajouter 500 µL de PTN et lavage pendant 20 min à température ambiante sur un rocker/nutator. Tous les futurs " longue " lavages devraient être de 20 min.
Remarque : Après ces lavages, fixé les cerveaux peuvent être conservés pendant la nuit à 4 ° C à PTN. - Supprimer le dernier lavage à l’aide d’une pipette p1000 et incuber le cerveau sur une bascule ou nutator à température ambiante dans 0,5 mL de solution [PTN + 5 % de sérum de chèvre normal (NGS)] pendant au moins 30 min à température ambiante de blocage.
- Anticorps secondaires de chèvre sera utilisé dans les étapes subséquentes du protocole. Si des anticorps secondaires d’une autre espèce doit servir, sérum normal de cette espèce (plutôt que NGS) doit être utilisé dans les solutions de blocage et d’anticorps.
- à l’aide d’une pipette p1000, enlever la solution de saturation et ajoutez l’anticorps primaire dilué dans PTN (PTN + 5 % NGS + anticorps primaire dilué). Lorsque vous utilisez un anticorps primaire pour la première fois, la dilution optimale de cet anticorps devrait être déterminée empiriquement.
Remarque : Pour visualiser les neurones corps aux champignons, anticorps reconnaissant Fas2 sont généralement utilisés. Ces anticorps sont disponibles de la Banque du développement des hybridomes études (DSHB) comme anticorps 1 4 et doivent être dilués 01:20 dans PTN + 5 % NGS.
Remarque : Pour visualiser les neurones photorécepteurs, anticorps reconnaissant chaoptin sont généralement utilisés. Chaoptin anticorps sont disponibles auprès de la DSHB comme les anticorps 24B10 et doit être dilué 01:20 dans PTN + 5 % NGS.
Remarque : Le processus de fixation élimine généralement fluorescence d’une protéine fluorescente comme la protéine fluorescente verte (GFP). Par conséquent, avec MARCM pour analyser le guidage axonal de neurones individuels de Mo, utilisez un anticorps reconnaissant GFP. - Incuber des cerveaux dans la solution d’anticorps primaire sur un rocker/nutator pour 2-3 nuits à 4 ° C.
- Après l’incubation avec l’anticorps primaires, permettre aux cerveaux déposer au fond du tube microcentrifuge puis supprimer la solution de l’anticorps primaire.
- à l’aide d’une pipette p1000, effectuer 2 " rapide " lavages et 3 " longue " 20 min lave avec 0,5 mL de PTN comme décrit ci-dessus dans les étapes 4.4 et 4.5, soigneusement permettant aux cerveaux pour régler par gravité vers le bas du tube microcentrifuge entre chaque lavage.
- Cerveau incuber pendant 3 h à température ambiante avec des anticorps secondaires marqués fluorescent appropriés. Anticorps secondaires sont habituellement diluées dans 0,5 mL de PTN + 5 % end à une concentration de 1 : 200.
Remarque : Une fois que les anticorps secondaires fluorescents ont été ajoutés, cerveau doit être conservé dans le noir pour le reste de l’expérience.
Remarque : dans les cas résiduels GFP fluorescence reste, lorsque vous effectuez l’analyse MARCM il est conseillé d’utiliser un anticorps secondaire marqué avec un fluorophore ayant des longueurs d’onde d’excitation/émission semblables comme GFP (p. ex., Fluoroscein isothyocyanate (FITC) ou Alexa488). - Suite à l’incubation de l’anticorps secondaire, permettent des cerveaux à déposer au fond du tube microcentrifuge et enlever la solution de l’anticorps secondaire.
- Effectuer 2 " rapide " lavages et 3 " longue " 20 min lave avec 0,5 mL de PTN comme décrit ci-dessus dans les étapes 4.4 et 4.5, soigneusement permettant aux cerveaux pour déposer au fond du tube microcentrifuge entre chaque lavage.
- Suite à la troisième " longue " 20 min lavage, utilisation une pipette de p200 pour enlever autant de tampon possible. Milieu de montage
- Ajouter 75 µL de fluorescent anti-fade sur le cerveau. Cerveaux de pipette et milieu de montage dans la pipette, une fois pour mélanger. Ne pas inverser le tube étant donné que le cerveau peut se retrouver bloqué sur le cap ou les parois du tube microcentrifuge.
Remarque : Après suspension de cerveaux dans le milieu de montage, tubes peuvent être enveloppés dans du papier d’aluminium pour ralentir le fluorophore trempe et stockés à 4 ° C durant la nuit. Si nécessaire, cerveaux peuvent être stockés pendant plusieurs jours à 4 ° C, mais devrait idéalement être montés sur glissières dès que possible.
5. Adultes de d. melanogaster cerveaux sur lames de Microscope et de l’imagerie de montage
- construire une " pont " diapositive. Placez deux " base " lamelles environ 1 cm de distance sur une diapositive chargée positivement. Veiller à ce que le côté chargé positivement de la diapositive vers le haut. Respecter les lamelles à la diapositive avec vernis à ongles comme le montre la Figure 3 A. Il est généralement utile sceller les trois bords extérieurs de chaque base lamelle couvre-objet avec vernis à ongle pour assurer le support de montage ne pas mèche sous ces lamelles de base. Laisser sécher complètement les vernis à ongles (10-15 min) avant de procéder.
- Placer la lame sous le stéréomicroscope et déposer la montage media solution contenant le cerveau disséqué dans l’espace entre les deux lamelles couvre-objet. Pour donner plus de contraste, il est utile de manoeuvrer les lumières de col de cygne pour qu’ils soient parallèles à la paillasse.
- Remove extra Montage support de la lame à l’aide d’une pipette, en veillant à ne pas Pipeter le cerveau hors de la diapositive. Médias de
- mèche de montage supplémentaire à l’extérieur. Ceci permettra le cerveau être positionné plus précisément au cours de la prochaine étape.
- À l’aide d’une paire de pinces et le stéréomicroscope, positionner le cerveau sur la diapositive dans une grille avec des lobes antennaires face up.
- Placer une lamelle couvre-objet (la " pont ") sur le cerveau ( Figure 3 A). Utiliser le vernis à ongle pour sceller les côtés de la lamelle du pont où ils contacter le " base " lamelles.
- à l’aide d’une pipette de p200, remplir lentement de la cavité du Centre sous le pont avec les supports de montage fraîches ( Figure 3 B). Mettre une goutte à la fois sur le bord libre de la lamelle de centre et permettre le support de montage à mèche sous le couvre-objet de pont de centre. Continuer jusqu'à ce que toute la cavité est remplie avec le montage des médias, puis sceller le haut et en bas avec vernis à ongles clair.
- Une fois que le vernis à ongle est sec, les diapositives d’images immédiatement ou conserver dans une boite opaque glissière étanche à -20 ° C.
- Sous huitaine, image cerveau à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser avec des lasers à excitation et cubes appropriés aux anticorps fluorescents secondaires choisies du filtre. Z-empiler les images des neurones corps aux champignons sont généralement obtenus en utilisant 20 X ou 40 X objectifs. Imagerie des neurones photorécepteurs rétiniens peut-être nécessiter un grossissement supérieur.
Representative Results
La méthode décrite ci-dessus permet la visualisation fiable et reproductible de pratiquement n’importe quelle région du cerveau drosophile adulte. Ici nous avons mis l’accent sur les organes de champignons et les neurones photorécepteurs, mais d’autres études ont utilisé des méthodes similaires pour visualiser les régions du cerveau comme la pars intercerebralis52, horloge neurones53,54et antennaire lobe projection neurones55, parmi beaucoup d’autres. Ce qui est important, cette technique permet de visualiser les structures du cerveau entier ainsi que des neurones individuels au sein de ces structures à l’aide de techniques telles que MARCM12,47. La figure 4, Figure 5et Figure 6 montrent différents types de données des organismes aux champignons et les neurones photorécepteurs dans le cerveau adulte qui peut être générés à l’aide de cette technique de dissection et immunostaining.
Tout d’abord, la méthode décrite ci-dessus peut servir à visualiser directement les champignons corps morphologie utilisant des anticorps qui reconnaissent Fasciculin 2 (Fas2) ou les gènes exprimés en corps aux champignons neurones34. Comme illustré dans la Figure 4A et 4 b Figure, Fas2 anticorps peuvent être utilisés pour visualiser le α, β et (dans une moindre mesure) lobes γ des organes aux champignons chez adulte Drosophila brains. Fas2 est une protéine d’adhérence de cellules nécessaires à neurone fasciculation et est exprimée en quantité élevée chez les α et β lobes23,56,57, ce qui en fait un marqueur fiable et bien établi de ces champignons neurones de corps. Notamment, le corps ellipsoïde de forme circulaire, situé dans la région centrale du cerveau adulte peuvent également être visualisé à l’aide de cet anticorps (Figure 4A).
Défauts dans les protéines de guidage axonal causent souvent incomplètement par ressuage corps champignon phénotypes mutants15,34,35. Par conséquent, dans la plupart des cas, plusieurs dizaines cerveaux doit être imagé et analysés. Par exemple, les axones de lobe β corps champignon des mouches null Nab2 croisent indûment la médiane du cerveau. Ce phénotype de « fusion » lobe « crossing over » ou β est typiquement observé chez environ 80 % des adultes Nab2 null vole mais est essentiellement absente de contrôles de type sauvage et peut être classée comme légère, modérée ou compléter la fusion34. La « fusion » des lobes β dans l’ensemble de la ligne médiane résulte de la projection controlatérale incorrecte des axones dans l’hémisphère opposé. Comme illustré à la Figure 4C et détaillée dans34,35, légère fusion se réfère aux lobes β reliés par un « brin mince des fibres Fas2 séropositifs, » alors que la fusion modérée se réfère à plusieurs lobes sensiblement connectés β qui montrent une épaisseur légèrement diminuée lobe à la ligne médiane. Fusion complète (ou « extrême ») se réfère aux lobes β qui restent toujours connectés et montrer sans diminution de l’épaisseur du lobe ou Fas2 coloration à la ligne médiane. L’ampleur de la fusion de lobe corps champignon β peut être quantifié et affiché comme démontré dans 34,35 , ou sous forme de tableau indiquant le pourcentage de cerveau montrant chaque type de défaut de morphologie.
En plus de la coloration avec des anticorps Fas2, les MARCM technique12,47,48 permet également de visualiser les décisions d’orientation axon de neurones individuels de GFP+ dans les lobes de corps aux champignons. MARCM utilise la recombinaison mitotique au cours du développement pour créer des neurones individuels ou liés par clonage ; groupes de neurones, marquées avec GFP (Figure 5A). MARCM fournit un moyen de générer un petit nombre de neurones qui n’ont pas complètement une protéine au sein d’une mouche dans le cas contraire hétérozygote. Par conséquent, cette technique a été particulièrement utile pour analyser les fonctions de guidage axonal des protéines qui sont également essentiels pour la viabilité globale organismique12,47. Les neurones null homozygotes marqués avec GFP peuvent être directement comparés pour contrôler les neurones marqués avec GFP dans un fond génétique sauvage. En outre, selon quelle en développement des larves ou des nymphes sont soumis au choc thermique, différentes classes de champignons corps neurones peuvent être pris pour cible (Figure 5B).
Un exemple du type de données générés à l’aide de cette technique est illustré à la Figure 5C, où le type sauvage (p. ex., contrôle) MARCM clones sont générés à titre d’exemple. Pour générer les différents neurones corps aux champignons GFP+ illustrés à la Figure 5C, développant F1 larves étaient initialement logés à 25 ° C. Environ 5-6 jours après l’éclosion de larve (ALH), nymphes étaient choqué pendant 30 min à 37 ° C, puis renvoyé à 25 ° C jusqu'à l’éclosion de la chaleur. Après leur éclosion adulte, cerveaux ont été disséqués dans PTN, fixe et simultanément incubées avec l’anticorps reconnaissant Fas2 (1 4, dilué 01:20 dans PTN) et GFP (dilué 1/500 à PTN). Cerveaux ont été incubées avec l’anticorps secondaires et montés sur des glissières tel que décrit ci-dessus. Cellules GFP+ ont été identifiés et photographié à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser et projections d’intensité maximale ont été créées à l’aide de ImageJ. Comme l’a démontré à la Figure 5C, contrôle GFP+ neurones générés dans les lobes α et β sont colocalisées avec Fas2 et résilier avant de communiquer avec la ligne médiane qui sépare les deux hémisphères du cerveau drosophile . Projette un seul axone bifurque vers l’avant et puis les deux projets dorsalement et médialement pour former le α et lobes β. Plusieurs études antérieures ont utilisé cette technique pour étudier si certaines protéines doivent étudier la division cellulaire autonome pour de nombreux aspects du axonogénèse, y compris l’extension, pathfinding, ramification ou élagage10, 11,12,13,14,15,16,17,34.
Outre les organes de champignons, les décisions de novateur Axonal des neurones photorécepteurs rétiniens (R-cellules) peuvent également être visualisées à l’aide de la méthode de dissection décrite ci-dessus (ainsi que par la de méthode de dissectionprescrits en référence48). Chaque ommatidie dans l’oeil de mouche contient 8 neurones photorécepteurs qui peuvent être classés en trois groupes (Figure 1) : les cellules de R1-R6, qui projettent des axones à la lame superficielle du cerveau lobe optique ; Cellules R7, qui projettent des axones vers la couche plus profonde de M6 de la médullaire ; et les cellules de R8, qui projettent des axones à la couche intermédiaire de M3 du bulbe rachidien19,58. Le modèle de projection de chaque classe de photorécepteur a été largement étudié et ensemble ces neurones ont été utilisés avec succès comme un modèle pour comprendre les voies de signalisation impliquées dans l’axone orientation19,59. Ce qui est important, tous les axones de photorécepteur peuvent être visualisés facilement dans les cerveaux de Drosophila disséqué par immunomarquage des adultes, nymphes, ou tissus larvaires utilisant un anticorps qui reconnaît chaoptin, une cellule de surface glycoprotéine24, 60 , 61. les gènes exprimant la GFP ou β-galactosidase dans chaque type de R-cellulaire (cellules R1-R6, R7 et R8) ont également été construits et peut être utilisés pour visualiser chaque classe de photorécepteur62. Étant donné que chaque type de cellule-R se termine dans un autre calque du lobe optique en développement, ces journalistes ont permis des comparaisons détaillées des voies de signalisation requis pour chaque type de cellule de trouver correctement sa cible. Un exemple des modèles d’expression produites par deux de ces gènes rapporteurs en combinaison avec la localisation de chaoptin (qui peut être utilisée comme marqueur de tous les neurones photorécepteurs) est illustré à la Figure 6. Pour visualiser les photorécepteurs R7, cerveau contenant le gène rapporteur R7 spécifique Rhodopsin4-LacZ ont été disséqués et colorées avec les anticorps anti-chaoptin et β-galactosidase. Rhodopsin 4 (Rh4) est exprimé spécifiquement dans un sous-ensemble de cellules de R763; le promoteur Rh4 permet donc de conduire l’expression du gène rapporteur dans seulement ces cellules. Comme prévu, les cellules R7 se terminent par la couche plus profonde de M6 du bulbe rachidien (signalée par un trait pointillé jaune Figure 6). De même, les cerveaux exprimant la β-galactosidase à partir du promoteur de la rhodopsine 6 (Rh6), qui s’exprime notamment dans R8 photorécepteurs63, ont été disséqués et immunomarquage utilisant des anticorps reconnaissant chaoptin et Β-galactosidase. Comme illustré à la Figure 6, R8 photorécepteurs aboutissait à la couche de R3 de lamédullaire. Bien que non illustrée ici, Rh1-LacZ permet également de visualiser la résiliation des photorécepteurs R1-R6 dans la lamina.
Figure 1 : L’adulte cerveau de Drosophila melanogaster est composé de régions fonctionnellement distinctes mais interconnectées. Cerveau (A) un aperçu de l' adulte d. melanogaster est indiqué, mettant en évidence les organes de champignons situés au centre et les neurones photorécepteurs rétiniens périphériques. (B) schéma élargi des faisceaux du corps aux champignons adultes axon (également appelées lobes) qui sont reconnus par des anticorps Fas2. Les neurones intrinsèques des organes aux champignons, appelées cellules de Kenyon, projet axones vers l’avant du corps cellulaires situés dorsalement (corps cellulaires omis dans ce diagramme) et forment des structures distinctes lobe. Dans le cerveau adulte, la forme de lobes (indiqué en rouge) γ d’un seul faisceau médial des axones, tandis que la dorsale α et β médial lobes (indiqué en bleu) d’un seul axone qui bifurque au cours du processus de pathfinding. Α ' / β' neurones développent des lobes axonales que partiellement se chevauchent avec celles des neurones α/β, mais ne sont pas reconnus par les anticorps Fas2 et figurent plus dans ce diagramme. (C) des neurones rétiniens sont essentielles pour relayer l’information visuelle de la rétine pour le lobe optique. Projet d’axones du corps cellulaire situé dans la rétine (beige) et établir des connexions avec des cellules de cible post-synaptique dans le limbe ou médullaire. R1-R6 photorécepteur (indiqués en rouge) des cellules forme spécifiques connexions avec les cellules de la couche externe du lobe optique, appelées la lamina. R7 photorécepteur cellules synapse (jaune) avec des cibles dans la couche de M6 du bulbe rachidien, alors que les cellules de R8 (indiqués en vert) projettent des axones vers la couche un peu plus superficielle de la M3 du bulbe rachidien. Partie C adapté avec la permission de Macmillan Publishers Ltd : Nature Neuroscience (référence64, droit d’auteur (2011)). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Système de GAL4/UAS the peut être utilisé pour l’expression des gènes ciblés. Pour obtenir des mouches exprimant un gène d’intérêt (« gène X ») selon un modèle spécifique de tissus, mouches doivent contenir un transgène exprimant la protéine d’activateur de la transcription Gal4 sous le contrôle d’un rehausseur spécifique de tissu et un transgène contenant l’ADN de Gal4 liaison de séquence (appelée séquence d’activation en amont ou SAMU) adjacent au gène X. en général, cette combinaison est obtenue par l’accouplement de mouches parentales qui contiennent chacun un transgène en sélectionnant pour la progéniture de1 F qui contiennent à la fois. Dans la génération de1 F qui en résulte, Gal4 devra être exprimée et se liera à la SAMU d’activer la transcription du gène X d’une manière spécifique de tissus. Ce qui est important, différents transgènes contenant du SAMU peut être utilisé en combinaison avec la même GAL4 « pilote ». Par exemple, un transgène exprimant Gal4 dans les organes de champignons (MBs) est cumulable avec un transgène contenant du SAMU à GFP express, un transgène qui renverse l’expression d’un gène d’intérêt à l’aide de l’interférence ARN ou un SAMU-transgène qui produit un journaliste. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Montage des cerveaux en préparation pour l’imagerie de l’immunofluorescence. Cerveau (A) est montées sur des lames SuperFrost Plus avec une couverture de pont pour empêcher l’aplatissement des cerveaux. Deux lamelles « de base » sont respectées une diapositive Superfrost Plus positivement chargées avec vernis à ongles clair et cerveaux disséqués est alors placés sur la diapositive entre eux. Un « pont » clair lamelle couvre-objet est placé au-dessus du cerveau et ont adhéré aux base des lamelles. (B) une fois le vernis à ongle a séché, Vectashield est reversé lentement sous le pont pour préserver la fluorescence de l’anticorps secondaire. Vernis à ongles clair est ensuite utilisée pour sceller le haut et le bas de la lamelle couvre-objet « pont ». S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Les axones de corps de champignon peuvent être visualisées clairement en utilisant des anticorps qui reconnaissent Fas2. (A) adulte Drosophila cerveaux ont été disséqués, fixe et incubées avec l’anticorps reconnaissant Fas2. Anticorps primaires ont été reconnus à l’aide de couplage Alexa488 chèvre-anti-souris Anticorps secondaires et les cerveaux ont été montées sur glissières chargées positivement et photographié à l’aide d’un microscope confocal à balayage de laser. Bisymmetrically situé aux champignons corps cellulaire corps étendent des axones vers l’avant, bifurquent et forment des faisceaux d’axon (également appelées lobes). Les axones qui forment le projetant sur le dos des lobes α et médialement débordantes de lobes β expriment Fas2. Critique, lobes β des mouches de type sauvage résilier avant la ligne médiane du cerveau. Le corps ellipsoïde situé aussi peuvent être visualisé qu’en utilisant les 4 1 anticorps. (B) la projection médialement axones de lobe γ du corps aux champignons drosophile adult également exprimer Fas2 et peuvent être visualisées à l’aide des 4 1 anticorps. En général, l’expression de Fas2 dans les axones de lobe γ est inférieure à celle des lobes α et β. (C), le corps du champignon axones du cerveau Nab2 null (génotype : Nab2ex3/Nab2ex3) du projet mal controlatérale et manquent souvent de lobes. Nab2 null cerveaux ont été disséqués, fixe et colorées avec les 4 1 anticorps pour visualiser les lobes α, β et γ de corps aux champignons. Intensité maximale Z-pile projections ainsi que les sections optiques axées sur la région de la ligne médiane sont représentées. Tandis que les axones de lobe β corps champignon sauvage rarement traversent la ligne médiane du cerveau, cerveau Nab2 null ont des quantités variables de mauvaise projection dans l’ensemble de la ligne médiane dans l’hémisphère controlatéral, résultant en lobes β « fondu ». Tel que défini dans la référence34,35, fusion douce se réfère à < lobes β avec seulement plusieurs de « fils » d’axones traversant la ligne médiane, la fusion modérée se réfère aux situations où les neurones de lobe positif β Fas2 traversent le lobe de ligne médiane mais β du cerveau largeur de la ligne médiane est diminuée, et fusion complète se réfère aux situations où il n’y a aucune réduction de l’épaisseur du lobe β tel que les lobes traversent la ligne médiane du cerveau. Puisque le corps ellipsoïde exprime aussi les Fas2, les sections optiques montrant la ligne médiane sont souvent plus utiles en visualisant la fusion lobe β. Notamment, manquant de lobes sont également fréquemment observées (notée ici avec l’astérisque blanche). Données dans la partie C sont utilisées dans la quantification des phénotypes de champignons corps de référence34, avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : MARCM peut être utilisé pour visualiser les axones des neurones individuels. (A) analyse de mosaïque avec une marqueur de cellule répressible (MARCM) utilisations FLP induite par la recombinase recombinaison mitotique sites FRT pour créer deux cellules-filles distinctes. Dans cet exemple, toutes les cellules contiennent une protéine de GAL4 corps spécifiques aux champignons sur un chromosome séparé. Suite à la recombinaison mitotique pendant la division cellulaire, une cellule de fille (en haut) exprime GFP (ou la membrane liée CD8-GFP) et contient deux allèles mutants d’un gène d’intérêt, tandis que l’autre cellule fille (en bas) hérite de deux allèles (WT) de type sauvage et un transgène exprimant la protéine Gal80 à l’aide d’un promoteur de la tubuline. Gal80 inhibe Gal4, ainsi toutes les cellules productrices de Gal80 seront non fluorescent et devraient être soit hétérozygote ou homozygote sauvage. Uniquement les cellules qui sont GFP+ contiendra deux copies de l’allèle mutant. Notez que seul un des plusieurs méthodes pour générer des cellules GFP+ qui contiennent également des deux allèles mutants d’un gène d’intérêt est montré ; s’il vous plaît voir12,45,56 pour d’autres exemples. (B) étant donné que le développement des neurones corps champignons commence avec les neurones γ, alors α'/ β' neurones et se termine par les neurones α/β, chaque classe du neurone peut être sélectivement ciblés et visualisé par la chaleur choquant à différents moments du développement. Comme décrit dans le 12, un choc thermique de 40 min à 37 ° C qui se produit ≤2, 5 jours après l’éclosion de larve (ALH) visera spécifiquement les γ, neurones, tandis qu’un choc thermique qui se produit de 3,5 à 4,5 jours ALH (à la fin du stade de larves L3) ciblera α'/ β' neurones et une chaleur que o de choc ccurs entre 5-7 jours ALH (au cours du développement pupe) ciblera les neurones α/β. (C) les axones sauvage individuels ont été visualisées utilisant MARCM. Nymphes sauvage ~ 5-6 jour (génotype : hsFLP, SAMU-CD8-GFP ; Une cuve FRT82B, SAMU-CD8-GFP/FRT82B, > Gal80 ; OK107-GAL4/+) étaient la chaleur choqué à 37 ° C pendant 40 min induire la recombinaison mitotique. Cerveaux ont été disséqués, fixe et colorées avec les anticorps reconnaissant GFP (1/500) et Fas2 (01:20). Cerveaux ont été incubées avec l’anticorps secondaires fluorescent étiquetés et visualisée par microscopie confocale. Dans cet exemple de donnée d’un génotype « control », GFP positive cellules générées à l’aide de MARCM sont sauvage et au lieu de contenir deux allèlesmut , contiennent deux allèlesWT . Lobes β de corps aux champignons (visualisées à l’aide d’anticorps reconnaissant Fas2) résilier avant d’atteindre la ligne médiane du cerveau ; Les neurones de lobe α sont également présents. Pour afficher plus en détail, un zoom au vu d’un seul hémisphère est montré dans la rangée du bas des images. Partie C a été adaptée avec la permission de référence34. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Axones photoréceptrices peuvent également être visualisées. Adulte brains exprimant sa β-galactosidase dans les photorécepteurs R7 (à gauche, à l’aide de Rh4-LacZ) ou R8 photorécepteurs (à droite, à l’aide de Rh6-LacZ) ont été disséqués, fixe et incubées avec l’anticorps reconnaissant la β-galactosidase ou chaoptin. Cerveaux ont été incubées avec l’anticorps secondaires fluorescent étiquetés et visualisée par microscopie confocale à balayage laser. Simple optique sont indiqués dans chaque cerveau. Sur la gauche, plusieurs axones de photorécepteur R7 (flèches) peuvent être vu, se terminant par la couche plus profonde de M6 du bulbe rachidien (indiquée par la ligne en pointillé jaune). Sur la droite, les axones de photorécepteur R8 (flèches) se terminent par la couche externe de la M3 du bulbe rachidien (indiqué par la ligne pointillée verte). Puisque les photorécepteurs R7 expriment soit Rh3 ou photorécepteurs Rh4 et R8 expriment Rh5 ou Rh663, tous les photorécepteurs R7 ou R8 ne peuvent être visualisés à l’aide d’un seul gène de journaliste LacZ . Barreaux de l’échelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
La méthode de dissection et visualisation décrite ci-dessus peut être utilisée dans une grande variété d’immunomarquage et vivre des applications d’imagerie. Nous ont esquissé un protocole général immunostaining et ont mis en évidence dans lequel MARCM peut être utilisé pour visualiser la morphologie axone des neurones individuels du corps aux champignons. En outre, ces procédures générales peuvent également être utilisés pour l’imagerie des autres régions du cerveau en fixe ou adulte fraîchement disséqué brains48,65. L’imagerie Live peut fournir une approche plus efficace lors de l’analyse des profils d’expression des pièges d’enhancer, gènes rapporteurs ou imitateur lignes66, par exemple. Pour prévenir la capture d’artefacts de la mort cellulaire en imagerie live de GFP dans les tissus non fixées, cerveau doit être disséqué en 1 x Saline tamponnée au Phosphate (PBS) ou HL3 médias48, montés sur des glissières de pont en 1 x PBS (ou HL3) et imagés dans moins de 15-20 min de soins devraient également être prises pour éliminer autant trachée possible du cerveau disséqué avant l’imagerie, puisqu’il peut interférer avec la visualisation de la fluorescence de la GFP.
Alors que les conditions de coloration pour l’évaluation de la morphologie des champignons neurones corps et photorécepteurs sont relativement bien établi24,61,67, la localisation d’une protéine spécifique d’intérêt dans ces cellules types peuvent exiger une vaste dépannage et optimisation. En particulier, plusieurs étapes critiques, y compris la dilution des anticorps, concentration de l’élément tampon bloquant et fixation, doivent être optimisés pour générer des résultats plus fiables et reproductibles. Tout d’abord, la concentration optimale d’anticorps primaire doit être déterminée. Bien que les anticorps disponibles dans le commerce ont souvent une dilution suggérée (et souvent au départ, nous commençons à l’aide de cette concentration), ces valeurs sont rarement déterminées empiriquement sur des tissus de drosophile . Par conséquent, à l’essai une série de dilutions de l’anticorps primaire qui gamme au-dessus et au-dessous de suggestion de départ du fabricant souvent se traduit par une coloration plus spécifiques. Alors que la dilution de l’anticorps primaire peut avoir un effet significatif sur la coloration de précision et doit être déterminée avec précision, les cerveaux de temps sont incubés dans l’anticorps primaire contenant les solutions peuvent varier considérablement avec peu d’effet sur le résultat global. Par exemple, nous avons observé des résultats similaires lors de l’incubation disséqué de cerveau avec l’anticorps primaire d’anticorps Fas2 pour deux, trois ou même quatre jours à 4 ° C. Bien que nous recommandions d’au moins deux nuits, nous avons également incubés cerveaux dans la solution d’anticorps primaire pour une seule nuit et obtenu une coloration reproductible. Ce qui est important, limitant la quantité de temps de cerveaux est incubés dans l’anticorps secondaire à 3 h à température ambiante (ou une nuit à 4 ° C) aide limite non-spécifiques d’anticorps secondaires aux tissus du cerveau.
En second lieu, il peut être nécessaire d’utiliser des réactifs de « blocage » supplémentaires afin d’éliminer le signal de fond indésirables. Options consistent à accroître la concentration de NGS à environ 10 %, en ajoutant 1 à 10 % Bovine Serum Albumin (BSA) au blocage ou primaire/secondaire solutions d’anticorps ou adsorption préalable des anticorps primaires pendant la nuit à 4 ° C avec des embryons de drosophile (voir référence68, section 2.9, étape 3).
Alors que nous avons écrit le protocole ci-dessus en utilisant PTN comme tampon suggérée pour la fixation de tous, lavage et les étapes d’incubation anticorps, fixation du tissu dans les autres tampons (par exemple, PLP et PEM, répertoriées dans le Tableau des matériaux) peut entraîner des différences profondes dans force du signal. Par exemple, des études antérieures ont démontré que la cycline E est indétectable dans les disques imaginaux larvaires quand les tissus sont fixés à traditionnel 4 % paraformaldéhyde, dilué dans du PBS, mais est bien visible lorsque les tissus sont fixés dans un tampon PLP (Ken Moberg, personnels communication et référence69). En plus des modifications dans la mémoire tampon composants, modifier l’heure et la température pour la fixation du tissu peut affecter aussi significativement par immunofluorescence souillant et peut être déterminées empiriquement si nécessaire. En règle générale, temps de fixation doit être suffisamment long pour permettre une réticulation suffisante des composants cellulaires, et le maintien à long terme de la morphologie cellulaire dans l’ensemble tout en étant limité assez pour l’empêcher de trop-réticulation et « enterrer » des épitopes des protéines. Par conséquent, quand initialement optimisation des conditions de coloration pour un anticorps primaire nouvellement acquise, nous généralement limiter le temps de fixation à environ 20 min et fixera souvent des tissus à des températures plus froides.
Plusieurs contrôles devraient figurer dans toute expérience d’immunofluorescence pour étudier la spécificité des anticorps primaires et secondaires ainsi que l’effet des transgènes/génétique sur le phénotype observé. Pour vérifier si l’anticorps primaire utilisé spécifiquement reconnaît la protéine d’intérêt, tissu de mouches manque cette protéine et/ou tissus surexprimant la protéine devrait figurer comme témoins. L’ajout de protéine purifiée excès peut également être incluse pour déterminer si l’anticorps primaire reconnaît autres épitopes dans le cerveau de mouche. Enfin, n’importe quel signal fluorescent présent lorsque les anticorps primaires sont omises représente le niveau de liaisons non spécifiques par les anticorps secondaires sélectionnés.
Plusieurs commandes importantes devraient également figurer afin d’évaluer la contribution du bagage génétique ou la présence de transgènes à intensité de coloration ou de la morphologie neuronale. Par exemple, les mouches utilisées pour l’expérience MARCM dans la Figure 5 contient plusieurs transgènes (hsFLP, SAMU-CD8-GFP, FRT82B, cuve > GAL80 et OK107-GAL4), chacune d'entre elles doit être analysée séparément pour les effets sur la morphologie du corps aux champignons. À une morphologie corps très minimale, champignon des mouches contenant OK107-GAL4 et SAMU-CD8-GFP doit être analysée. Il peut également être nécessaire d’évaluer l’effet du choc thermique et production recombinase Flp sur le développement de champignons corps en analysant les mouches contenant hsFLP et FRT82B. Bien que MARCM peut fournir la perspicacité significative dans la question de savoir si une protéine donnée contrôle autonome guidage axonal, le nombre de contrôles devra effectuer avec précision cette conclusion peut être une limitation mineure de cette technique. Dans les expériences moins compliquées, contrôles similaires sont également applicables. Par exemple, prenons une expérience où le système de GAL4/UAS est utilisé en combinaison avec un transgène ARNi à coup de masse expression d’une protéine d’intérêt dans tous les neurones. Dans cette expérience, au moins deux transgènes seront présents : un pilote de GAL4 pan-neuronale, comme Elav-GAL4 et le transgène SAMU-Arni . La morphologie des neurones corps aux champignons chez les mouches contenant chacune de ces transgènes seuls devrait être étudiée en plus de la condition expérimentale où les mouches abritent les deux transgènes chez la mouche même.
Enfin, pour déterminer si la protéine d’intérêt est exprimée dans les neurones du corps aux champignons c’est généralement nécessaire de cerveaux co tache avec anticorps anti-Fas2. Par ailleurs, des protéines fluorescentes comme GFP, DP ou la membrane liée CD8-GFP peuvent aussi être exprimées en utilisant le système de GAL4/UAS et utilisé en combinaison avec des anticorps reconnaissant la protéine d’intérêt. Car Fas2 ne reconnaît que les axones fasciculées qui forment les lobes α et β du corps aux champignons, l’utilisation de GAL4 axée sur la, membranaires CD8-GFP a été particulièrement utile pour le marquage des neurones corps aux champignons.
Défauts dans le guidage axonal ne sont souvent pas 100 % ressuage et même cerveau de même génotype peut montrer une variabilité. Par conséquent, lors de l’analyse nouvellement généré des allèles mutants pour déceler les défauts dans corps du champignon ou pathfinding photorécepteur, une combinaison d’allèles différents et des approches devrait être utilisée. La plupart des études dans la littérature utilisent plusieurs approches différentes pour étudier si une protéine joue un rôle autonome cellule dans le contrôle de guidage axonal : J’ai) analyse de pathfinding défauts chez les homozygotes mouches null (préférence en utilisant les différent nuallèles ll), ii) analyse de pathfinding défauts chez les mouches manque la protéine d’intérêt que dans les neurones (généralement par l’intermédiaire d’Arni), iii) analyse MARCM des défauts de pathfinding et iv) expériences où le gène est ré-exprimé dans les neurones null homozygotes de sauvetage mouches. Idéalement, plusieurs douzaines cerveaux par génotype devrait être analysés pour déceler les défauts dans la morphologie neuronale.
Bien que le protocole décrit ici est principalement axé sur la localisation par immunofluorescence des protéines dans le tissu fixe, plusieurs futures applications de cette technique sont développées aux tissus du cerveau live image. Une fois que les cerveaux est disséqués (généralement dans les milieux de culture cellulaire), ils peuvent être ensuite cultivées pendant plusieurs jours à 25 ° C. Ces méthodes de culture ex vivo sont développés afin d’enquêter sur une grande variété de processus biologiques, tels que l’activité de la protéine qui favorise la régénération axonale après blessure70,71, intracellulaire signalisation dynamique72et73de la développement neuronal.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Changhui Pak et Alysia Vrailas Mortimer pour initialement enseigner SMK la technique de dissection du cerveau. Nous remercions également les membres du groupe de laboratoire de Ken Moberg, en particulier les tours de Chris, pour la lecture critique du manuscrit. Anticorps reconnaissant Fas2 (1, 4) et chaoptin (24B10) ont été extraites de la Banque d’hybridome études du développement. Anticorps 24B10 a été déposé à la DSHB par Seymour Benzer et Nansi Colley24,60,61, anticorps 1 4 a été déposé à la DSHB par Corey Goodman 22,23,56. Stocks de mouches ont été obtenues depuis le centre de Stock de Bloomington. Nous tenons également à remercier l’Ohio Agricultural Research et Development Center (OARDC) MCIC Imaging Center pour l’utilisation du microscope confocal à l’image du cerveau dans la Figure 4 a et B. SMK est soutenu par une subvention du NICHD (1 R15 HD084241-01 a 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microdissection forceps/tweezers | Ted Pella | 505-NM | |
| Sylgard dishes | Living Systems Instrumentation | DD-50-S-BLK | Available from amazon.com |
| Fas2 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 | |
| Chaoptin Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 24B10 | |
| GFP Antibody | Aves Lab | GFP-1010 | |
| Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
| Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody | ThermoFisher | A-11039 | |
| Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody | ThermoFisher | A-21236 | |
| 20% paraformaldehyde | Electron Microscope Services | RT15713 | |
| VectaShield | Vector Labs | H-1000 | |
| SuperFrost Plus Slides | ThermoFisher | 99-910-01 | |
| Coverslips | ThermoFisher | 12-553-454 | |
| Na Phosphate Buffer monobasic | Sigma | S3139 | |
| Na phosphate Buffer dibasic | Sigma | S3264 | |
| Triton X 100 | Sigma | X100-100ml | |
| fingernail polish | Electron Microscope Services (EMS) | 72180 | |
| stereomicroscope | Leica S6D with KL300 LED light source | ||
| 9-well dish (spot plate) | VWR | 89090-482 | |
| nutator/rocker | Fisher | 22-363-152 or 88-861-041 | |
| 35mm dish | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Sylgard | Fisher | 50-366-794 | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potential Fixation Buffers | |||
| PTN Buffer | 0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed | ||
| PLP buffer | 2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O | ||
| PEM buffer | 0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Stocks available from Bloomington | |||
| elav (c155)-GAL4 | BL458 | Pan-neuronal GAL4 driver | |
| w*;;;OK107-GAL4 | BL 854 | GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome) | |
| y(1), w(67c23); c739-GAL4 | BL 7362 | GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome) | |
| y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP | BL 64305 | GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP | |
| w*; 201Y-GAL4 | BL 4440 | GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome) | |
| y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP | BL 64296 | GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP | |
| w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub>Gal80/CyO | BL 5145 | MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome | |
| w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP | BL5146 | MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome | |
| y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub>GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4 | BL 44408 | MARCM stock for flipping 3rd chromosome | |
| y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub>GAL80;OK107-GAL4 | BL44406 | MARCM stock for flipping 2nd chromosome | |
| w*, hsFLP, tub>GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4 | BL 44407 | MARCM stock for flipping X chromosome | |
| y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO | BL 5137 | GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein) | |
| y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP | BL 5139 | MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome | |
| y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO | BL 28832 | MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome | |
| w*; FRTG13, Tub>GAL80 | BL 5140 | MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome | |
| y(1), w*;; FRT82B, Tub>GAL80 | BL 5135 | MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome |
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