Det här protokollet beskriver den dissektion och immunfärgning av vuxen Drosophila melanogaster hjärnans vävnader. Specifikt, belyser detta protokoll användningen av Drosophila svamp kropp och ljusmätare nervceller som exempel neuronala delmängder som exakt kan användas till att avslöja de allmänna principerna för många aspekter av neuronal utveckling.
Nervsystemet utveckling innebär en sekventiell serie händelser som samordnas av flera signalvägar och regleringsnät. Många av proteinerna som är involverade i dessa vägar är evolutionärt bevarade mellan däggdjur och andra Eukaryoter, såsom bananflugan Drosophila melanogaster, vilket tyder på att liknande organiserande principer finns under utvecklingen av dessa organismer. Ännu viktigare, har Drosophila använts i stor utsträckning att identifiera cellulära och molekylära mekanismer som reglerar processer som krävs i däggdjur inklusive neurogenes, differentiering, axonal vägledning och synaptogenes. Flugor har även använts framgångsrikt att modellera en mängd mänskliga nervsystemets sjukdomar. Här beskriver vi ett protokoll för den stegvisa lokalt, fixering och Immunofluorescerande lokalisering av proteiner inom den vuxna Drosophila -hjärnan. Detta protokoll fokuserar på två exempel neuronala populationer, svamp kroppens nervceller och näthinnans fotoreceptorer och innehåller valfria steg för att spåra enskilda svamp organ nervceller med hjälp av Mosaic analys med en Repressible Cell markör (MARCM)-teknik. Exempeldata från både vildtyp och muterade hjärnor visas tillsammans med en kort beskrivning av en poängkriterier för axonal vägledning defekter. Medan detta protokoll belyser två väletablerade antikroppar för att utreda morfologi av svamp kropp och ljusmätare nervceller, andra Drosophila hjärnregioner och lokalisering av proteiner inom andra områden i hjärnan kan också vara undersökt använder detta protokoll.
Även om Drosophila nervsystemet är mindre än hos människa och gnagare, ger dess komplexitet en kraftfull, lättillgänglig modell för att bättre förstå dess ryggradsdjur motsvarigheter. I många fall koda genomen hos ryggradsdjur och flyger mycket liknande proteiner som dikterar mekanismerna i nervsystemet utveckling. I själva verket krävs många av generna som för neuronal utveckling hos ryggradsdjur har orthologs i flugor, inklusive de inblandade i signalvägar som kontroll mallning, neurogenes och axonal vägledning1,2,3 ,4,5. Netrin är exempelvis en ligand som krävs för axonal vägledning hos däggdjur och D. melanogaster6,7,8. Medan netrin isolerades ursprungligen från embryonala chick hjärnans vävnad6, har efterföljande studier visat att netrin en roll bevarade under utvecklingen av embryonala centrala nervsystemet (CNS) i Drosophila8. Andra studier har använt genetiska skärmar i den embryonala Drosophila CNS för att identifiera bevarade ligander och receptorer som krävs för pathfinding i både Drosophila och ryggradsdjur9.
Medan embryonala flugan CNS har använts flitigt i förflutnan för att identifiera ligander, receptorer och Intracellulär signalering proteiner krävs för axonal vägledning8,9, har senaste arbete undersökt sätt på vilket många av dessa proteiner styr också pathfinding beslut under senare stadier av utveckling. Specifikt, har utredning av svamp kropp (MB) och retinal ljusmätare neuron utveckling (figur 1) gett insikt om mekanismerna som kontroll pathfinding, synaps bildas, axon beskärning och flera andra aspekter av neuronala utveckling10,11,12,13,14,15,16,17. Ljusmätare nervceller ansluta flyga näthinnan till regioner i den vuxna hjärnan kallas lamina och medulla och är kritiska för återutläggning visuell information till hjärnan (Recenserad av18,19), medan svamp kropp nervceller är centralt beläget i flyga hjärnan och krävs för inlärning och minne20,21. Både ljusmätare nervceller och de inneboende nervcellerna svamp organ, kallas Kenyon celler, utnyttja evolutionärt bevarade diffusible och kontakt-beroende axonal vägledning mekanismer för att hitta sina efter synaptic mål. Förutom att vara synliga i vuxna flugor, kan ljusmätare och MB nervceller också direkt visualiseras i larver och puppor med antikroppar eller reporter gener22,23,24,25. Möjligheten att enkelt visualisera dessa två uppsättningar av nervceller vid olika utvecklande tidpunkter har främjat deras användning som fantastiskt modeller för många aspekter av neuronal utveckling.
Förutom som används som en modell för att förstå mekanismerna bakom normala nervsystemet utveckling, har nyligen genomförda studier visat att flugor kan också fungera som korrekta modeller av en mängd olika sjukdomar, inklusive bräckliga X syndrom (FXS)26 , Intellektuella funktionshinder (ID)27,28,29,30,31, och andra32. Exempelvis för att studera den molekylära funktionen av ZC3H14, en gen som nyligen kopplade till människors intellektuella funktionshinder, vi skapade en flyga modell av ID med en null-allelen av flugan ZC3H14 ortholog, kallas Nab230. Flugor som saknar Nab2 har svår minne nedskrivningar och utökade poly(A) svansar, går igenom vad observeras hos patienter eller patienten härrör cell linjer33,34. Ännu viktigare, Visa flugor som saknar Nab2 också svår hjärnans morfologi defekter i deras vuxna svamp organ34, liknar vad som observerats i flugor som saknar genen syndrom FXS, FMR135. Flugor kan således tjäna som ett viktigt modellerar organism att studera både hjärnans normala utveckling och sjukdomar som stör den.
Slutligen, tillgängligheten till hög genomströmning metoder för att övervaka beteendet, kombinerat med det stora utbud av tillgängliga genetiska verktyg, se Drosophila modellorganism i valet för att identifiera de områden i hjärnan som styr komplexa beteenden, såsom lärande och minne, sömn, uppvaktning, törst och andra36,37,38,39. Ett särskilt användbart verktyg som är i mitten av en flyga genetikers ”verktygslåda” är GAL4/UAS systemet (figur 2). Detta system40,41 använder vävnad specifika uttryck för Gal4 transkriptionell aktivator för att öka uttrycket av gener eller transgener nedströms av en uppströms aktivera sekvens (UAS). Ändringar av detta system har gjort det möjligt för forskare att, till exempel kontrollera exakt retbarhet av specifika nervceller42,43, overexpress eller knock-down specifika gener av intresse44, 45, analysera i realtid kalcium dynamics i vivo46och express reporter gener att markera neuronala härstamningar41. Kombinationen av GAL4/UAS systemet med mitotisk rekombination också möjliggjorde skapandet av mosaik analysen med en Repressible Cell markör (MARCM) systemet12,47. MARCM har använts flitigt i enda neuron spårning för att identifiera de cellulära signalering komponenter som krävs för axonal vägledning12,47. Även om dessa och andra tekniker har lämnat ett antal värdefulla insikter om de cellulära mekanismer som krävs för nervsystemets funktion, kräver de flesta att Drosophila hjärnan först vara dissekeras; noggrann borttagning av hjärnan krävs att behålla rätt hjärnans morfologi och anslutning mönster mellan regioner i hjärnan. Följande protokoll använder svamp kropp och ljusmätare nervceller somexempel neuronala populationer som guidar dig genom dissektion och Immunofluorescerande färgning av vuxen Drosophila brains.
Dissektion och visualisering metoden som beskrivs ovan kan användas i en mängd olika immunfärgning och leva bildhanteringsprogram. Vi har skisserat ett allmänt immunfärgning protokoll och har belyst ett sätt där MARCM kan användas för att visualisera axonal morfologi av enskilda svamp organ nervceller. Dessutom, dessa allmänna förfaranden kan också användas för imaging andra regioner i hjärnan i fasta eller nymalen dissekerade vuxen brains48,65. Levande imaging kan ge en effektivare strategi när man analyserar uttrycksmönster enhancer fällor, reporter gener eller härma linjer66, t.ex. Att förhindra att fånga artefakter från celldöd under levande avbildning av GFP i ofixerad vävnad, hjärnor bör dissekeras i 1 x fosfat buffrad saltlösning (PBS) eller HL3 media48, monterad på bron diabilder i 1 x PBS (eller HL3) och avbildas i mindre än 15-20 min. vård bör också tas bort så mycket luft som möjligt från dissekerade hjärnan före imaging, eftersom det kan störa visualisering av GFP fluorescens.
Medan färgning villkor vid bedömningen av morfologi av svamp kropp och ljusmätare nervceller är förhållandevis väletablerade24,61,67, lokalisering av ett specifikt protein av intresse i dessa cell typer kan kräva omfattande felsökning och optimering. I synnerhet bör flera kritiska steg, inklusive antikropp utspädning, blockerande buffert komponent koncentration och fixering, optimeras för att generera de mest reproducerbara och pålitliga resultat. Först, den optimala koncentrationen av primär antikropp bör fastställas. Även om kommersiellt tillgängliga antikroppar har ofta en föreslagna utspädning (och vi startar ofta initialt med att koncentration), är dessa värden sällan utifrån empiriskt Drosophila vävnader. Därför testning av en serie av primär antikropp utspädningar som utbud över och under tillverkarens start förslag ofta resulterar i mer specifik färgning. Medan primär antikropp utspädning kan ha en betydande inverkan på färgning noggrannhet och bör fastställas exakt, tid hjärnor inkuberas i primär antikropp innehållande kan lösningar variera avsevärt med liten effekt på det totala resultatet. Exempelvis har vi observerat liknande resultat när ruvning dissekerade hjärnor med Fas2 antikropp primära antikroppen för två, tre eller ännu fyra dagar vid 4 ° C. Även om vi rekommenderar minst två nätter, har vi också inkuberas hjärnor i primär antikropp lösning för en enda natt och erhålls reproducerbara färgning. Ännu viktigare, att begränsa mängden tid hjärnor inkuberas i den sekundära antikroppen i 3 timmar vid rumstemperatur (eller en natt vid 4 ° C) bidrar till gräns icke-specifik bindning av sekundära antikroppar att hjärnvävnaden.
Andra, kan det vara nödvändigt att använda ytterligare ”blockering” reagenser för att eliminera oönskad bakgrund signal. Alternativ inkluderar öka koncentrationen av NGS ~ 10%, att lägga till 1-10% bovint serumalbumin (BSA) den blockerande och primär/sekundär antikropp lösningar, eller före adsorption av primära antikroppar övernattning på 4 ° C med Drosophila embryon (se referera till68, avsnitt 2.9, steg 3).
Medan vi har skrivit det ovanstående protokoll använder PTN som det föreslagna buffert för alla fixering, kan tvätta, och antikropp inkubationsstegen, vävnad fixering i andra buffertar (såsom PLP och PEM, i Material tabell) leda till djupgående skillnader i signalstyrka. Till exempel har tidigare studier visat att cyklin E är omätbara i larval imaginal skivor när vävnader är i traditionella 4% PARAFORMALDEHYD utspätt i PBS, men syns tydligt när vävnader är i PLP buffert (Ken Moberg, personliga kommunikation och referens69). Förutom förändringar i buffert komponenter, ändring av tid och temperatur för vävnaden fixering kan också påverka Immunofluorescerande färgning och empiriskt kan bestämmas om det behövs. Generellt fixering tid bör vara tillräckligt lång för att möjliggöra tillräcklig crosslinking av cellulära komponenter och långsiktigt underhåll av övergripande cellulära morfologi samtidigt begränsas tillräckligt för att förhindra över-crosslinking och ”begrava” av protein epitoper. Därför när du initialt optimerar färgning villkor för en nyförvärvade primär antikropp, vi brukar begränsa fixering tid till ca 20 min och kommer ofta fixa vävnader vid kallare temperaturer.
Flera kontroller bör ingå i någon immunofluorescens-experiment för att undersöka specificiteten av primära och sekundära antikroppar samt effekten av transgener/genetiska bakgrunden på den observerade fenotypen. För att få klarhet i huruvida den primär antikropp används specifikt känner igen proteinet av intresse bör vävnad från flugor saknar detta protein och/eller vävnad överuttryck av proteinet inkluderas som kontroller. Tillägg av överskjutande renat antigen protein kan också ingå för att avgöra om den primär antikroppen känner igen andra epitoper i flyga hjärnan. Slutligen representerar någon närvarande när primära antikroppar utelämnas fluorescerande signal nivån på icke-specifik bindning av de valda sekundära antikropparna.
Flera viktiga kontroller bör också ingå för att utvärdera bidraget av genetisk bakgrund eller förekomsten av transgener till färgning intensitet eller neuronala morfologi. De flugor som används i MARCM experimentet i figur 5 innehåller exempelvis flera transgener (hsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, bubbelpool > GAL80 och OK107-GAL4), som alla bör analyseras separat för effekter på svamp kropp morfologi. På ett minimum, svamp kropp morfologi av flugor bör som innehåller både OK107-GAL4 och UAS-CD8-GFP analyseras. Det kan också vara nödvändig för att bedöma effekten av värme chock och Flp recombinase produktion på svamp kropp utveckling genom att analysera flugor som innehåller både hsFLP och FRT82B. Även om MARCM kan ge betydande insikt om ett visst protein autonomt styr axonal vägledning, kan antalet kontroller som krävs för att korrekt göra denna slutsats vara en mindre begränsning av denna teknik. I mindre komplicerade experiment är liknande kontroller också tillämpliga. Ta till exempel ett experiment där GAL4/UAS systemet används i kombination med en RNAi transgenens knockdown uttryck av ett protein av intresse för alla nervceller. I detta experiment, minst två transgener kommer att närvara: en pan-neuronal GAL4 förare, såsom elav-GAL4, och den UAS-RNAi transgenens. Morfologi av svamp kropp nervceller i flugor som innehåller var och en av dessa transgener ensam bör utredas förutom det experimentella villkor där flugor harbor båda transgener i samma fluga.
Slutligen, för att avgöra huruvida proteinet av intresse uttrycks i svamp kropp nervceller är det oftast nödvändigt att samtidig fläcken hjärnor med antikroppar mot Fas2. Alternativt kan fluorescerande proteiner som GFP, RFP eller membranet bunden CD8-GFP också uttryckas med hjälp av GAL4/UAS -systemet och används i kombination med antikroppar som känner igen proteinet av intresse. Eftersom Fas2 erkänner bara fasciculated axoner som bildar svamp kropp α och β loberna, har användning av GAL4-driven, membran-bundna CD8-GFP varit särskilt användbar för märkning svamp kroppens nervceller.
Defekter i axonal vägledning ofta inte är 100% penetrant och även hjärnor av samma genotyp kan visa vissa variabilitet. Därför, när analysera nyligen genererade muterade alleler för defekter i svamp kropp eller ljusmätare pathfinding, en kombination av olika alleler och metoder bör användas. De flesta studier i litteraturen använder flera olika metoder för att undersöka huruvida ett protein har en cell-självständiga roll i kontrollen av axonal vägledning: jag) analys av pathfinding defekter i homozygot null flugor (helst med olika null alleler), ii) analys av pathfinding defekter i flugor som saknar proteinet av intresse endast i nervceller (oftast via RNAi), iii) MARCM analys av pathfinding defekter, och iv) rädda experiment där genen är åter uttryckt i nervceller i homozygot null flugor. Helst bör flera dussin hjärnor per genotyp analyseras för fel i neuronala morfologi.
Även om protokollet beskrivs här främst fokuserar på Immunofluorescerande lokalisering av proteiner inom fasta vävnad, utvecklas flera framtida tillämpningar av denna teknik till bild levande hjärnvävnad. När hjärnan är dissekerade (vanligen i cell kultur media), kan de sedan vara odlade i flera dagar vid 25 ° C. Dessa ex vivo culturing metoder utvecklas för att undersöka en mängd biologiska processer, såsom protein-aktivitet som främjar axon regeneration efter skador70,71, intracellulära signalering dynamics72, och neuronal utveckling73.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Changhui Pak och Alysia Vrailas Mortimer för initialt undervisning SMK hjärnan dissektion tekniken. Vi tackar också medlemmar i Ken Mobergs lab gruppen, särskilt Chris rundor, för att kritiskt läsa manuskriptet. Antikroppar som erkänner Fas2 (1 d 4) och chaoptin (24B10) erhölls från utvecklande studier Hybridomteknik banken. Antikropp 24B10 sattes till DSHB av Seymour Benzer och Nansi Colley24,60,61, antikropp 1 d 4 deponerades till DSHB av Corey Goodman 22,23,56. Flyga bestånd erhölls från Bloomington lager Center. Vi vill också tacka Ohio jordbruksforskning och utveckling Center (OARDC) MCIC Imaging Center för användning av mikroskopet confocal till bild hjärnor i figur 4A och B. SMK stöds av ett bidrag från NICHD (1 R15 HD084241-01A1).
Microdissection forceps/tweezers | Ted Pella | 505-NM | |
Sylgard dishes | Living Systems Instrumentation | DD-50-S-BLK | Available from amazon.com |
Fas2 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 | |
Chaoptin Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 24B10 | |
GFP Antibody | Aves Lab | GFP-1010 | |
Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody | ThermoFisher | A-11039 | |
Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody | ThermoFisher | A-21236 | |
20% paraformaldehyde | Electron Microscope Services | RT15713 | |
VectaShield | Vector Labs | H-1000 | |
SuperFrost Plus Slides | ThermoFisher | 99-910-01 | |
Coverslips | ThermoFisher | 12-553-454 | |
Na Phosphate Buffer monobasic | Sigma | S3139 | |
Na phosphate Buffer dibasic | Sigma | S3264 | |
Triton X 100 | Sigma | X100-100ml | |
fingernail polish | Electron Microscope Services (EMS) | 72180 | |
stereomicroscope | Leica S6D with KL300 LED light source | ||
9-well dish (spot plate) | VWR | 89090-482 | |
nutator/rocker | Fisher | 22-363-152 or 88-861-041 | |
35mm dish | Genesee Scientific | 32-103 | |
Sylgard | Fisher | 50-366-794 | |
Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Potential Fixation Buffers | |||
PTN Buffer | 0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed | ||
PLP buffer | 2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O | ||
PEM buffer | 0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fly Stocks available from Bloomington | |||
elav (c155)-GAL4 | BL458 | Pan-neuronal GAL4 driver | |
w*;;;OK107-GAL4 | BL 854 | GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome) | |
y(1), w(67c23); c739-GAL4 | BL 7362 | GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome) | |
y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP | BL 64305 | GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP | |
w*; 201Y-GAL4 | BL 4440 | GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome) | |
y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP | BL 64296 | GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP | |
w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub>Gal80/CyO | BL 5145 | MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome | |
w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP | BL5146 | MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome | |
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub>GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4 | BL 44408 | MARCM stock for flipping 3rd chromosome | |
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub>GAL80;OK107-GAL4 | BL44406 | MARCM stock for flipping 2nd chromosome | |
w*, hsFLP, tub>GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4 | BL 44407 | MARCM stock for flipping X chromosome | |
y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO | BL 5137 | GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein) | |
y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP | BL 5139 | MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome | |
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO | BL 28832 | MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome | |
w*; FRTG13, Tub>GAL80 | BL 5140 | MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome | |
y(1), w*;; FRT82B, Tub>GAL80 | BL 5135 | MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome |