Summary
Эффективный скрининг протокол представлен для идентификации малых молекул, которые способствуют астроглиальных дифференцировки стволовых клеток глиобластомы (GSCs). Assay основан на которой выражение расширенной GFP (eGFP) управляется человека промоутер СВМС репортер дифференцировки стволовых клеток.
Abstract
Глиобластома (GBM) является наиболее распространенным и наиболее смертоносных первичного мозга опухоль в взрослых, вызывая примерно 14 000 смертей каждый год в США в одиночку. Медиана выживаемости после диагностики находится менее чем в 15 месяцев с максимальной хирургической резекции, радиации и Темозоламид химиотерапии. Проблемы, присущие в разработке более эффективных методов лечения GBM стали все более очевидными и включить его непоколебимой инвазивность, его устойчивость к стандартной процедуры, ее генетических сложности и молекулярных адаптируемость и субпопуляций GBM клетки с фенотипические сходство с обычной стволовых клеток, далее именуемая глиобластома стволовых клеток (GSCs). Потому что GSCs необходимы для роста опухоли и прогрессии, на основе дифференциации терапия представляет механизм эффективным методом лечения для этих неизлечимой новообразования.
Следующий протокол описывает коллекцию процедур установить высокую пропускную способность, скрининг платформы, направленные на выявление малых молекул, которые способствуют GSC астроглиальных дифференцировки. Ядром системы является конструкцией репортер дифференциация глиальных фибриллово кислой белка (СВМС). Протокол содержит следующие общие процедуры: (1) создание РКГ дифференциация репортер линии; (2) тестирование/Проверка актуальности репортер GSC self обновление/колониеобразования емкости; и (3) высокой емкости цитометрии наркотиков скрининг.
Скрининг платформа обеспечивает простой и недорогой подход для выявления малые молекулы, которые способствуют GSCs дифференцировки. Кроме того использование библиотек FDA утвержденных препаратов имеет потенциал для идентификации агентов, которые можно многократно использовать более быстрыми темпами. Кроме того методы лечения, которые способствуют дифференцировки стволовых клеток рака, как ожидается, синергетически работать с текущей «стандарт медицинской помощи» терапии, которые показали и ликвидации прежде всего более дифференцированной раковые клетки.
Introduction
Недавние исследования показали, что опухоли содержат небольшой численностью населения клеток, Рак стволовых клеток (ПОК) или инициирование опухоли клетки, которые отвечают за прогрессии опухоли, метастазы и устойчивость к химио - и радио терапии 1, 2. наличие раковых стволовых клеток и их более дифференцированной потомков в опухоли считается важным фактором содействия внутриопухолевых неоднородность и таким образом является главным препятствием в лечении рака3. Опухоли клеток иерархии, представленной теории стволовых клеток рака, вдохновило развитие новых стратегий для лечения рака 4. Один из подходов для ориентации Рак стволовых клеток заключается в выявлении и подавляют сигнальных путей, которые известны как требуется во время эмбрионального развития пораженного органа. Действительно мы и другие ранее опубликовали несколько документов, описывающих текущие требования нервные стволовых клеток соответствующие сигнальные пути Еж Соник и паз, глиобластома5,6,7. Эта работа помогла застывающих обоснование несколько GBM клинических испытаний. Второй подход для ориентации Рак стволовых клеток заключается в содействии их дифференциация. Этот подход получил много поддержки из-за благоприятные результаты доклинических и клинических исследований в лечении острого promyelocytic лейкоза с ретиноевой кислоты (ATRA, аналог витамина А). Здесь был найден ATRA удалить блок созревания и поощрять дифференциацию клеток рака8. Совсем недавно Пикирилло и коллеги элегантно показали, что BMP-4 вызывает дифференцировку РКГ в астроциты с значительным анти GBM эффекты in vitro и in vivo9.
Основания для нынешнего исследования основана на подходе «обратный инжиниринг» для ориентации GSCs. Учитывая огромные неоднородность, присутствующие в GBM и с плохой дифференциацией, будучи одним из отличительных признаков рака, мы спросили, если мы могли бы содействовать более благоприятные фенотип - дифференциация в экзоцитоз подобное состояние. Здесь мы не имеют предварительных знаний о сигнальных путей, которые поддерживать GSCs в данной опухоли образец, но скорее стремимся достичь желаемого фенотип (например СВМС позитивности).
В настоящем докладе описываются процедуры, используемые для установления GSC дифференциация репортер линии от трансдукции GSC-обогащенный культур GSC клонового отбора. Глиобластома нейросферы линии, используемые были созданы в лаборатории профессора Анджело Вескови от пациентов с диагнозом первичной глиобластомы в госпитале San Raffaele - Милан, Италия. Эти линии были широко изучены в ряде публикаций 6,10,11,12,13,14. Настоятельно рекомендуется, что люди, которые заинтересованы в осуществлении этих методов в их лаборатории определяют актуальность репортер способность самообновления Рак стволовых клеток в клетки, они планируют изучать (это верно для любого репортер). Подробный протокол для одного в vitro колониеобразования анализов в поле предоставляется для достижения этого15,16. Наконец подробный протокол описания использования дифференциация репортер линий на экране наркотиков цитометрии основе предоставляется в конце. Следует отметить аналогично системе дифференциации астроглиальных, описанных здесь, мы успешно создали и проверены линии репортер GSC интеграции репортер (нейрональных дифференциации) MAP2:GFP. Таким образом, методологии описывают в этом бумаги могут быть применены для изучения клеточной дифференцировке в различные ячейки.
Некоторые из фигур в настоящем докладе можно найти в недавней публикации: «атракурия бесилат других нервно блокирующих агентов астроглиальных дифференциация и содействия разрушающим стволовых клеток глиобластомы18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Астроглиальных и нейрональных человека репортер систем были приобретены как расфасованных, концентрированные лентивирусные препаратов. Базовые знания потока цитометрии техники не требуется. Кроме того для полного использования этого протокола пользователю необходим доступ к проточный цитометр с высокой пропускной способностью (принимает 96-луночных пластины как источника выборки).
1. лентивирусные Transcriptional репортер системы
Примечание: В всех анализов гранулярных потока, используйте для создания базовых флуоресценции родителей, не преобразованы, ячейки или преобразованы вектор (не люминесцентные). Кроме того Обратите внимание, что на всех этапах, где механические Тритурация вызывается, быть нежным. Суровые Тритурация может убить значительное количество хрупкие GSCs и влияние потока цитометрии результаты.
- Пластина 1 x 106 клеток в 2 мл среднего роста полного нервных стволовых клеток в пластине 6-multiwell.
- Передают клетки путем добавления человека репортер на разносторонности инфекции (МВД) равен 5.
- 2 мкл Полибрен для окончательного концентрации 8 мкг/мл.
- Инкубируйте клетки при 37 ° C и 5% CO2 на ночь.
- Следующий день, замените роста средних удалить несвязанные вирус. Поместите пластины обратно в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2 и инкубировать в течение 24 ч.
- Урожай 0,5 мл общего объема; спин вниз клетки на 360 x g 5 мин при комнатной температуре в 15 мл Конические трубки и удалить супернатант путем аспирации. Добавить 0,5 мл свежего нервных стволовых клеток роста средних в остальные ячейки и возвращение пластину в инкубатор для дальнейшего расширения.
- Добавить 200 мкл Реагента диссоциации и инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C.
- Разбить ячейки, нежно закупорить вверх и вниз.
Примечание: Жестковатый Тритурация может привести к значительным убийство GSCs, полной диссоциации обычно достигается через 20 - 30 раз. - Чтобы свести к минимуму клеток вложение или агрегирования, мкл 800 из Хэнка сбалансированный соли раствора (HBSS) для заключительного тома 1 мл.
- Трансфер 200 мкл каждого суспензию клеток хорошо 96-multiwell пластины.
- Для выполнения этой процедуры используйте проточный цитометр benchtop с возможностью 96-луночных пластины с голубой лазер для возбуждения и с возможностью обнаружения Зеленый флуоресцирующий белок. Анализ потока гранулярных с по крайней мере 10 000 жизнеспособным клетки для каждого приобретения.
- Определите процент GFP-положительных клеток проточной цитометрии.
2. subclone отбора, расширение и проверки
- Плита клетки в 100 мкл среды нервных стволовых клеток на плотность 0.7 клеток на хорошо 96-multiwell пластины.
- Культура клоны 11 дней при 37 ° C и 5% CO2. Этот шаг является весьма зависит от типа ячейки и скорее всего потребует корректировки, основанные на линии клеток. Как общее правило сфере диаметр ≥ 100 мкм является хорошим свидетельством присутствия колониеобразования GSCs в neurospheres.
- С помощью флуоресцентного микроскопа с фильтром FITC, Марк скважин, которые содержат один нейросферы где ~ 1-5% клеток являются GFP-позитивными.
Примечание: Определение точный процент GFP-положительных клеток не слишком критически настроен на данный момент. Каждый из subclones позднее будет оцениваться проточной цитометрии. Этот шаг выполняется для снижения общее количество клонов анализируемым с упором на neurospheres, которые происходят, недифференцированный, СВМС отрицательно, GSC. - Разверните узел выбранного репортер клоны до тех пор, пока существует достаточное количество клеток для анализа проточной цитометрии. Югу вырожденная хорошо 6-multiwell плиты, содержащего ≤ 1.5x105 клеток/мл следует обеспечить достаточное количество клеток.
Примечание: Подробная процедура для изоляции и расширение GSCs является наличие 17.
3. определение выражения GFAP:GFP подачей Cytometry
- Урожай Алиготе клеток (0,5 мл) от каждого репортера клон и элементы управления, не преобразованы, чтобы определить точный процент GFP-положительных клеток. Учитывая репортер клоны, которые содержат ~ 1-5% GFP-положительных клеток.
- Спина клетки на 360 x g 5 мин при комнатной температуре и удалить супернатант путем аспирации.
- Для каждой гранулы 200 мкл Реагента диссоциации клеток и инкубировать трубы на водяной бане, равным 37 ° C.
- Нарезанных клетки осторожно, чтобы достичь одну ячейку подвеска (обычно от 20 до 30 раз).
- Для сведения к минимуму клеток вложение или агрегирования, добавьте 800 мкл HBSS окончательный объем 1 мл.
- Трансфер 200 мкл на хорошо 96-multiwell плиты из каждой ячейки подвеска.
- Для выполнения этой процедуры используйте проточный цитометр benchtop с возможностью 96-луночных пластины. Анализ потока гранулярных с по крайней мере 10 000 жизнеспособным клетки для каждого приобретения.
4. ЭЛЬДА самообновлению Assay оценить способность колониеобразования
Примечание: Для элементов управления, как родителей, не преобразованы, так GFP-выражая преобразованы человека клетки, должны использоваться для определения относительной колониеобразования потенциал линии репортер дифференциация GSC к оригинальной GSC культур, из которых они были производные.
- Отделить subclones дифференциация репортер в сингл клеточных суспензий, как описано выше.
- Плита клетки в 96-multiwell пластины в 100 мкл полного нервных стволовых клеток роста средств массовой информации в ячейки плотность колеблется от 5 до 500 клеток на хорошо.
- Инкубации клеток для 9-11 дней при 37 ° C и 5% CO2.
- Оценка положительных скважин по прямой визуализации neurospheres под микроскопом света. Также следует рассматривать «позитивные», если он содержит по крайней мере один большой нейросферы.
- Подключите данные: всего скважин проанализированы и количество положительных скважин с использованием ЭЛЬДА онлайн интерфейса доступны на http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html.
5. наркотиков библиотека разрежения подготовка
- Удалить библиотеку пластины из хранения при температуре-80 ° C, накрыть алюминиевой фольгой (защита светочувствительных соединений). Оттепель на около 30 минут до часа при комнатной температуре.
- Использование 12-канальный многоканальных дозаторов для разбавления библиотека соединений до 0,2 мм в среде полного нервных стволовых клеток. Разбавляют ДМСО до 10% роста средней
Примечание: Конечная концентрация ДМСО должно быть 0,1% при добавлении к клеткам. Более высокой концентрации ДМСО в культуре может привести к токсичности. По этой причине мы рекомендуем вам проверить чувствительность к ДМСО в клетки линии, до лечения. - Использование ДМСО как управления транспортным средством для лечения клетки обнаружены в левой и правой колонки каждой пластины (колонки 1 и 12; Уэллс А через час).
- Накладки разреженных библиотека с алюминиевой фольгой и вернуть оригинальных пластин библиотека в морозильник-80 ° C для длительного хранения.
6. наркотиков экран
Примечание: ДМСО лечение клетки следует использовать для задания базовых флуоресценции и отрегулировать стробирования.
- Клемная 5 x 103 клеток в 96-multiwell пластины в 99 мкл среднего роста полного нервных стволовых клеток.
- Использование 12-канальный многоканальных дозаторов, лечить клетки с разбавленным библиотека соединений в конечной концентрации 2 мкм (1 мкл препарата 0,2 мм в 99 мкл суспензии клеток) или с ДМСО (управления). Инкубируйте пластины для 72 ч при 37 ° C и 5% CO2.
- С помощью 12-канальный многоканальных дозаторов 150 мкл Реагента диссоциации клеток для каждой скважины и проинкубируйте втечение 20 мин при температуре 37 ° C.
- Разбить ячейки, нежно истирание с 12-канальный многоканальных дозаторов, вплоть до отдельной ячейки подвеска (обычно от 20 до 30 раз). Количество времени, которое требуется отделить neurospheres полностью будет варьироваться между линиями GSC. В то время как реагент диссоциации рекомендованные клеток (см. материалы) является безопасным и инкубации до 45 минут никак не влияет на жизнеспособность в многострочный GSC испытания, проверки на каждой РКГ линии для использования в скрининга.
Примечание: Окончательный объем в каждом хорошо должно быть примерно 250 мкл (100 мкл суспензии клеток + 150 мкл Реагента диссоциации клеток). - Определите процент клеток, выражая репортер GFAP:GFP проточной цитометрии. Используйте стандартные стробирования стратегию. Во-первых сюжет вперед и боковых рассеивает получить общее ощущение размер ячейки и жизнеспособности. Затем поместите ворота на жизнеспособные населения одной ячейки. Это население, для которого будет определяться Зеленая флуоресценция (eGFP). Любые смеси, что приводит к увеличению доли GFP-положительных клеток путем более трех стандартных отклонений контроль над (ДМСО лечение) рассматривается как положительный «хит». Этот порог должен быть скорректирован согласно конкретных приложений и желаемой жесткости.
Примечание: Для высокой пропускной способности экрана рекомендуется с помощью единого subclone репортер GSC. После удара идентификации должно проверяться каждый удар против дополнительных репортер subclones от одной и той же линии GSC. Для повышения доверия для истинной хитов также рекомендуем тестирование соединения против репортера subclones изолированы от различных GSC neurospheres линии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Три независимых пациента производные neurospheres линии были преобразованы с журналистом астроглиальных человека, кодирование для Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) сливается в рама с Zeocin сопротивление кассету и управляется элементом человеческого СВМС промоутер ( Рисунок 1). Следующий индивидуальные клоны были изолированы от обшивки 0.7 ячеек на скважину в 96 хорошо пластины (рис. 2), последовало потока гранулярных определение процентной доли их клеток, выражая GFP (рис. 3). Клоны нейросферы, производные от одной клетки, содержащие ≤5% GFP-положительных клеток называются GL (СВМС низкий) в то время как клоны, содержащих ≥75% GFP позитивные клетки называются GH (СВМС высокий) и считаются быть продифференцированным более по сравнению с GL subclones (рис. 4).
Для идентификации агентов и пути, которые могут управлять астроглиальных дифференциация в GSCs, была выполнена мелкомолекулярных наркотиков экране, с использованием двух клинических коллекции низ библиотек. Клетки были обработаны на 72 часа с 727 Библиотека агентов из коллекции клинических NIH I и II, в концентрации 2 мкм или равным объемом ДМСО как элемент управления. Эффект этих агентов был протестирован на жизнеспособность клеток во всех наших пациентов производный GBM нейросферы линиях в концентрациях от 0,2 мкм до 20 мкм, перед показом наркотиков. Концентрация, используемые в настоящем Протоколе, позволил нам определить соединений, которые смогли побудить астроглиальных дифференциация и в то же время, он свернут потенциально пробить токсические эффекты из-за более высокой концентрации наркотиков.
После инкубации мы определили процент клеток, выражая СВМС-GFP репортер проточной цитометрии. Базовые показатели для жизнеспособности и процент GFP-положительных клеток были определены по крайней мере три скважины для каждой библиотеки пластины, и позитивные хит было определено увеличение доли GFP-положительных клеток трех стандартных отклонений над базовой (ДМСО) и минимального порога 25% GFP позитивных клеток. Мы определили 12 наркотиков, которые достаточно увеличение GFP-позитивной популяции (таблица 1).
Рисунок 1: Астроглиальных дифференциации репортер системы.
Принципиальная схема pGreenZeo GFAP:GFP репортер. GSCs не выразить соответствующую комбинацию факторов транскрипции, необходимо активировать промоутер глиальных фибриллово кислой белка (СВМС) и поэтому не будет выражать GFP (верхняя группа). Однако, когда присутствуют соответствующие транскрипционных факторов (например, когда клетки приобретают астроглиальных судьба - дифференцировать) промоутер СВМС становится активным, и клетки будут выражать GFP репортер (Нижняя панель). (GSC - стволовых клеток глиомы, компоновщик T2A-белка, ЗЭО-R - Zeocin сопротивления гена, TF - фактор транскрипции). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Астроглиальных дифференциация - Subclone выбор.
Представитель фотографии GSC HSR-GBM1 subclones, выражая низкий уровень (GL) или высокий уровень (GH) GFAP:GFP репортер, с помощью микроскопии флуоресцирования (40 кратном показано). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Проточной цитометрии для определения зеленой флуоресценцией.
HSR-GBM1 пациент производные нейросферы линия была преобразованы с GFAP:GFP репортер Лентивирусы и несколько subclones были выбраны основе экспрессия гена GFP в нейросферы инициирование ячейки и подтверждается проточной цитометрии. Эти клоны были названы GL (СВМС низкий) или GH (СВМС высокий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Функциональная характеристика HSR-GBM1 GFAP:GFP subclones.
GL subclones являются более колониеобразования в vitro как указано увеличение частоты РКГ, которые измеряются по крайней ограничения разрежения анализа (ЭЛЬДА). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Имя | Увеличение раза GFP + клетки | Описание | Гематоэнцефалический барьер | Наркотиков банка вероятности |
| Винорелбин | 8.97 | Анти митотическая химиотерапии | - | 0.88 |
| Дифеноксилат | 13.89 | Антидиарейные | + | 0,96 |
| Lomerizine | 10.89 | Блокатор канала кальция / церебральный сосудорасширяющее | NA | NA |
| Phenprobamate | 10.73 | Анксиолитический / мышцы релаксант, действующей в центре города | NA | NA |
| 6-Azauridine | 15.07 | Антиметаболит / противовирусные | NA | NA |
| Иронотекан | 14.14 | Topisomerase я ингибитор | + | 0,63 |
| Атракурия бесилат | 8.16 | Nondepolarizing скелетных мышц отдыха | + | 0.93 |
| Глимепирид | 8,75 | Антидиабетических | + | 0,73 |
| Гексахлорофен | 9.83 | Антисептик | + | 0.92 |
| Дигоксин | 8.23 | Гликозид, кардиотоническое | - | 0,72 |
| Флекаинид | 10 | Агент борьбы аритмии | + | 0,86 |
| Nisoldipine | 5.05 | Блокатор канала кальция | - | 0,95 |
Таблица 1: Малые молекулы, вызывая СВМС-GFP репортер выражение в HSR-GBM1 GL-1
Двенадцать соединений были найдены значительно увеличить процент GFP-выражая клеток (увеличение раз показано) и строгим критериям ≥3 стандартных отклонений, над базовой, ДМСО лечение клетки и с не менее 25% GFP-положительных клеток. Способности и вероятность данного агента пересечь гематоэнцефалический барьер (наркотиков банк (−). Аббревиатура: NA (информация не доступна).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя большинство предыдущих исследований GSCs, сосредоточены главным образом на маркеры, которые определяют их в этом исследовании мы решили взять обратный подход. Мы ориентируемся прежде всего на дифференцированной потомков, порожденных GSCs (например, клетки, выражая астроглиальных и нейрональных маркеры). Здесь мы продемонстрировать использование препарата на основе ячеек высокую пропускную способность, скрининг системы, которая основана на человека СВМС промоутер зависимой выражения гена GFP. Все эксперименты были проведены используя пациента производные нейросферы глиобластома клеточных линий. Подробный протокол описания изоляции и расширение этих линий описан в Галли et al17.
Система не только помогала нам в идентификации малых молекул, которые способны индуцировать клеточной дифференциации GSCs, но также помог нам однозначно определить, что выражение астроглиальных дифференциации маркер СВМС определяет колониеобразования потенциала отдельных клеток GBM путем сравнения частоты GSC. ЭЛЬДА assay был разработан Yifang Ху и Гордон K. Смит. Читателям предлагается прочитать рукопись для углубленного понимания пробирного сильные стороны и ограничения15. Формирования колонии, забив шаг крайне зависимым тип ячейки и скорее всего потребует корректировки, основанные на линии клеток. Кроме того, как правило мы используем сфера диаметром ≥100 мкм хорошим свидетельством того, что нейросферы возникла в колониеобразования GSC.
Кроме того, препарат, скрининг системы мы описываем здесь позволяет для выявления новых путей (специально транспорт ацетилхолина и кальция), которые обязаны поддерживать GSCs в недифференцированном состоянии (см. таблицу 1). Начальная концентрация препарата могут различаться в зависимости от библиотеки и клеток линии используются. Кроме того время, необходимое для клеточной дифференциации могут требовать корректировки. Кроме того онкогенной проверки наркотиков хитов требует посвящения опухоли в vivo пробирного 18.
Потенциально незначительные ограничением этой методики является, что спонтанное дифференциация неизбежно происходит в любой культуре обогащенный стволовыми, и это явление имеет тенденцию к увеличению числа проходов в культуре и различается между отдельными subclones. Действительно мы наблюдали спонтанное дифференциации в нашей subclones как правило после прохождения 15. Таким образом мы ограничили наш анализ дифференциация культур на проход цифры не превышает пяти.
Таким образом, возможно наиболее критической точки в этой методологии должна держать в пробирке пассированый эти GSCs до минимума и при работе в пробирке, чтобы поддерживать культуру плотность ниже 1.5x105 кл/мл. Кроме того настоятельно рекомендуется каждый препарат «хит» проверяется subclones дополнительных репортер из одной и той же линии РКГ, а также, против subclones репортер изолированы от разных пациентов производные GSC neurospheres линии. Это увеличит уверенность, что истинный «хит» под рукой.
Универсальность методологии, описанной в этом надежный протокол укрепляет терапевтическую ценность дифференцировки стволовых клеток наркотиков индуцированного рака и должно помочь в выявлении новых лекарств как потенциальный роман терапевтических стратегий для GBM и другие опухоли. Наконец assay может быть оптимизированы для использования с не неопластические нервные стволовые клетки, другие типы рака и с журналистами различных дифференциации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа частично поддерживается R01CA187780 низ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ESGRO Complete Accutase | EMD Millipore | SF006 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) | SBI (System Biosciences) | SR10015VA-1 | |
| 50 ml sterile disposable reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 96 well plate | Falcon | 353072 | |
| Biolite T25 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biolite T75 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130190 | |
| 15 ml Centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 1.5ml Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 - 20uL | VistaLab Technologies | 1060-0020 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL | VistaLab Technologies | 1060-0250 | |
| Multi 12-channel pipette tips 25 μl | VistaLab Technologies | 4060-1002 | |
| Multi 12-channel pipette tips 250 μl | VistaLab Technologies | 4060-9025 | |
| Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer | EMD Millipore | 0500-4005 | |
| NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries | Evotec | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For the preparation of neural stem cell media (500 mL) | Final concentration | ||
| BSA | GoldBio.com | A-421-250 | 0.20% |
| DMEM/F12 10X | Corning | 90-091-PB | 1X |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3149 | 0.0002% |
| HEPES 1M | Sigma Aldrich | H4036 | 5.4 mM |
| Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) | Life Technologies | 41400-045 | 1X |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | 14.5 mM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X | Gibco | 15140-122 | 1X |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | 16 nM |
| Putrescine | Sigma Aldrich | P5780 | 4.8 µM |
| Basic FGF (FGF2), Human | GoldBio | 1140-02-50 | 10 ng/ml |
| EGF, Human | GoldBio | 1150-04-100 | 20 ng/ml |
| Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind | Corning | 431160 | Use to filter sterlize media |
References
- Maher, E. A., et al. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).
- Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network. Cancer Res. 71 (12), 4055-4060 (2011).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Sul, J., Fine, H. A. Malignant gliomas: new translational therapies. Mt Sinai J Med. 77 (6), 655-666 (2010).
- Bar, E. E., Chaudhry, A., Farah, M. H., Eberhart, C. G. Hedgehog signaling promotes medulloblastoma survival via Bc/II. Am J Pathol. 170 (1), 347-355 (2007).
- Chu, Q., Orr, B. A., Semenkow, S., Bar, E. E., Eberhart, C. G. Prolonged inhibition of glioblastoma xenograft initiation and clonogenic growth following in vivo Notch blockade. Clin Cancer Res. 19 (12), 3224-3233 (2013).
- Schreck, K. C., et al. The Notch target Hes1 directly modulates Gli1 expression and Hedgehog signaling: a potential mechanism of therapeutic resistance. Clin Cancer Res. 16 (24), 6060-6070 (2010).
- Warrell, R. P. Jr, et al. Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin (all-trans-retinoic acid). N Engl J Med. 324 (20), 1385-1393 (1991).
- Piccirillo, S. G., et al. Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444 (7120), 761-765 (2006).
- Bar, E. E., et al. Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma. Stem Cells. 25 (10), 2524-2533 (2007).
- Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres. Am J Pathol. 177 (3), 1491-1502 (2010).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathol. 50 (4), 357-368 (2012).
- Lim, K. S., et al. Inhibition of monocarboxylate transporter-4 depletes stem-like glioblastoma cells and inhibits HIF transcriptional response in a lactate-independent manner. Oncogene. 33 (35), 4433-4441 (2014).
- Kahlert, U. D., et al. ZEB1 Promotes Invasion in Human Fetal Neural Stem Cells and Hypoxic Glioma Neurospheres. Brain Pathol. 25 (6), 724-732 (2014).
- Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
- Meyer, M., et al. Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 851-856 (2015).
- Galli, R., et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64 (19), 7011-7021 (2004).
- Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Atracurium Besylate and other neuromuscular blocking agents promote astroglial differentiation and deplete glioblastoma stem cells. Oncotarget. 7 (1), 459-472 (2016).
