Summary
효율적인 심사 프로토콜 astroglial 분화 세포종 줄기 세포 (GSCs)에 홍보 하는 작은 분자의 식별을 위해 제공 됩니다. 분석 결과 줄기 세포 감 별 법 기자에 의하여 향상 된 GFP (eGFP)의 식을 인간의 GFAP 발기인에 의해 구동 됩니다 기반으로 합니다.
Abstract
세포종 (GBM)은 미국 에서만 매년 약 14000 죽음을 일으키는 원인이 되는 성인에서 가장 일반적이 고 가장 치명적인 기본 뇌 종양. 메디아 생존 진단 다음 최대한 외과 절제술, 방사선 및 temozolomide 요법으로 15 개월 미만 이다. 더 효과적인 GBM 치료법 개발에 도전 점점 더 분명 되 고 등의 탄력성이 침입, 표준 치료에 그것의 저항, 그것의 복잡 한 유전 및 분자 적응성, GBM의 모집단 정상 줄기 세포, phenotypic 유사성과 셀 본 세포종 줄기 세포 (GSCs) 라고. GSCs 종양 성장 및 진행을 위해 필요 하기 때문에 차별화에 기초를 둔 치료가 불 치의 신생에 대 한 가능한 치료 양식 적임을 나타냅니다.
다음 프로토콜 플랫폼 GSC astroglial 차별화를 홍보 하는 작은 분자의 식별 목적으로 상영 높은 처리량을 설정 하는 절차의 컬렉션을 설명 합니다. 시스템의 핵심에는 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP) 차별화 기자-구문입니다. 다음과 같은 일반적인 절차를 포함 하는 프로토콜: (1) 설립 GSC 차별화 기자 라인; (2) 테스트/유효성 검사 GSC 자체-갱신/clonogenic 용량; 기자의 관련성 그리고 (3) 높은-용량 cytometry 마약 검사를 기반으로.
심사 플랫폼 GSCs 차별화를 홍보 하는 작은 분자를 식별 하는 간단 하 고 저렴 한 접근을 제공 합니다. 또한, FDA 승인 약품의 라이브러리의 활용 더 급속 하 게 내리거나 수 에이전트의 식별에 대 한 가능성을 보유 하고있다. 또한, 암 줄기 세포 분화를 촉진 하는 치료 대상 및 주로 더 차별화 된 암 세포를 제거 하기 위해 표시 되었습니다 현재 "표준 치료" 치료 공동 성으로 작동 하도록 예상 된다.
Introduction
최근 연구는 작은 인구를 포함 하는 종양 세포, 암 줄기 세포 (CSCs) 또는 시작 하는 종양 세포 나의 종양 진행, 전이, 그리고 항 암 치료 및 라디오 치료 1, 저항에 대 한 책임은 2. 암 줄기 세포 및 종양 내의 그들의 분화 progenies intratumoral이 추진 하는 중요 한 요소를 간주 하 고 따라서 암3치료에 주요 장애물을 나타냅니다. 종양 세포 계층, 암 줄기 세포 이론에 의해 제공 된 치료 암 4새로운 전략의 개발 영감 하고있다. 암 줄기 세포를 대상으로 하는 한 가지 방법은 식별 하 고 영향을 받는 장기의 배아 발달 동안에 필요한 것으로 알려져 있습니다 신호 경로 억제 하는 것입니다. 사실, 우리와 다른 사람 신경 줄기 세포 관련 신호 경로 소닉 고슴도치와 노치 세포종5,,67에 대 한 지속적인 요구를 설명 하는 여러 논문을 출판 이전 했습니다. 이 작품은 여러 GBM 임상 시험에 대 한 근거를 응고에 도움이 되었습니다. 암 줄기 세포를 대상으로 두 번째 방법은 그들의 차별화 홍보 하는 것입니다. 이 방법은 retinoic 산 (ATRA, 비타민 A 아날로그)와 급성 promyelocytic 백혈병 치료에 전 임상 및 임상 연구에서 유리한 결과로 인해 지원 많이 받았습니다. 여기 ATRA 성숙 블록을 제거 하 고 암 세포 감 별 법8촉진 발견 됐다. 더 최근에, Piccirillo와 동료 우아하게 나타났습니다 BMP-4 중요 한 안티-GBM 효과 생체 외에서 그리고 vivo에서9이다에 GSC 차별화를 촉진.
현재 연구에 대 한 근거 GSCs를 대상으로 "역된 공학" 접근을 기반으로 합니다. GBM와 암의 특징 중 하나 되 고 불 쌍 한 차별화와 광대 한이 감안할 때, 우리는 경우 우리는 호의 베푸는 표현 형-사이토와 같은 상태로 차별화 홍보 수 물었다. 여기, 우리가 특정된 종양 견본에서 GSCs를 유지 하지만 오히려 원하는 표현 형 (예: GFAP 양성) 달성을 목표로 하는 신호 통로의 사전 지식이 필요가 없습니다.
이 보고서는 GSC 차별화 기자-라인 GSC 농축 문화 변환에서 GSC 클론 선택 영역을 설정 하는 데 사용 하는 절차를 설명 합니다. 세포종 neurosphere 라인 사용 병원 산 라파엘 레-밀라노, 이탈리아에서 기본 세포종의 진단 가진 환자에서 교수 안젤로 Vescovi의 실험실에서 설립 되었다. 이 라인은 여러 간행물 6,10,,1112,13,14에서 광범위 하 게 연구 되었습니다. 그들의 실험실에서 이러한 기술을 구현에 관심이 있는 개인 공부를 계획 하는 세포에서 암 줄기 세포 자체 갱신 용량 기자의 관련성 확인 것이 좋습니다 (이 어떤 기자). 생체 외에서 clonogenic 분석 실험은 분야에서 허용 중 하나에 대 한 자세한 프로토콜이15,16을 달성 하기 위해 제공 됩니다. 마지막으로, cytometry 기반 약 스크린에 차별화 기자-라인의 활용을 설명 하는 상세한 프로토콜 끝에 제공 됩니다. 노트, 마찬가지로 astroglial 차별화 시스템 설명, 우리 성공적으로 설립 하 고 GSC 기자 라인 MAP2:GFP (신경 분화) 기자를 통합 검증. 따라서,이 방법론 설명 종이 다양 한 세포 계보에 세포 분화 연구에 적용할 수 있습니다.
이 보고서에 있는 숫자 중 일부는 최근 간행물에서 찾을 수 있습니다: "Atracurium Besylate 다른 신경 근육 차단 에이전트 astroglial 차별화 홍보 및 세포종 줄기 세포18고갈.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
참고: Astroglial 및 신경 lentivirus 기자 시스템 사전 패키지, 집중 lentiviral 준비로 구매 되었다. 교류 cytometry 기술의 기본 지식이 필요 합니다. 또한,이 프로토콜을 사용 하는 전체에 대 한 사용자 흐름 cytometer 높은 처리량 용량 (샘플 소스로 96 잘 접시를 허용)에 대 한 액세스를 해야 합니다.
1. lentiviral Transcriptional 기자 시스템
참고: 모든 흐름 cytometric 분석에 사용 하 여 부모, 비 불리고, 셀 또는 벡터 불리고 (비 형광) 셀 설정 기준 형광. 또한, 유의 하십시오, 기계적 분쇄 이라고 어디 모든 단계에서 부드러운. 가혹한 분쇄 연약한 GSCs의 상당한 수를 죽 일 고 흐름 cytometry 결과 영향을 미칠 수 있습니다.
- 플레이트 1 x 106 셀 6 multiwell 격판덮개에 완전 한 신경 줄기 세포 성장 매체의 2 ml.
- Lentivirus 기자 5 크거나 감염 (moi)의 다양성에 추가 하 여 셀 transduce.
- 8 µ g/mL의 최종 농도 대 한 polybrene의 2 µ L를 추가 합니다.
- 37 ° C, 5% CO2 에서 셀을 밤새 품 어.
- 다음 날, 성장 매체 언바운드 바이러스 제거를 교체 합니다. 37 ° C, 5% CO2 배양 기에 다시 접시를 놓고 24 h에 대 한 품 어.
- 수확 0.5 mL 전체 볼륨; 360 x g 15 mL 원뿔 튜브에 실 온에서 5 분에 셀 아래로 회전 하 고 열망 하 여 상쾌한을 제거 합니다. 나머지 셀에 신선한 신경 줄기 세포 성장 매체의 0.5 mL을 추가 하 고 지속적인된 확장을 위한 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.
- 분리 시 약의 200 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 5 분 동안 품 어
- 부드럽게 위아래로 pipetting으로 세포 분열.
참고: 가혹한 분쇄 GSCs의 중대 한 살해 귀 착될 지도 모른다, 완전 한 분리는 일반적으로 20-30 시간 후 이루어집니다. - 셀 첨부 파일 또는 집계를 최소화 하기 위해 800 µ L의 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 1 mL의 최종 볼륨을 추가 합니다.
- 각 세포 현 탁 액의 200 µ L 96 multiwell 격판덮개의 우물에 전송.
- 이 절차에 대 한 96 잘 접시 기능이 여기 블루 레이저와 녹색 형광 단백질을 검출 하는 능력을 갖추고 있는 벤치탑 교류 cytometer를 사용 합니다. 각 인수에 대 한 적어도 10000 가능한 셀 흐름 cytometric 분석을 수행 합니다.
- Cytometry 여 GFP-긍정적인 세포의 백분율을 결정 합니다.
2. subclone 선택, 확장, 및 유효성 검사
- 96-multiwell 격판덮개의 우물 당 0.7 세포의 밀도에서 신경 줄기 세포 매체의 100 µ L에 플레이트 세포.
- 문화를 37 ° C, 5% CO2에 11 일에 대 한 복제. 이 단계 높은 종속 셀 종류 이며, 셀 라인 사용에 따라 조정 필요 합니다. 일반적으로 구체 직경 ≥ 100 µ m는 neurospheres에서 clonogenic GSCs의 존재의 좋은 표시 이다.
- FITC 필터 장착 형광 현미경을 사용 하 우물 단일 neurosphere 포함 하는 셀의 1 ~ 5% 되 GFP-긍정적인 표시 합니다.
참고: 결정 GFP-긍정적인 세포의 정확한 백분율은이 시점에서 너무 중요 하지 않다. subclones의 각 나중 cytometry에 의해 평가 됩니다. 총을 줄이기 위해이 단계를 수행 하는 수에 의해 시작 되는 neurospheres에 중점을 두고 분석 하는 클론의 undifferentiated, GFAP-부정, GSC. - Cytometry 분석에 대 한 셀의 충분 한 수 있습니다 때까지 선택 된 기자 클론을 확장 합니다. ≤ 1.5x105 셀/mL를 포함 하는 6-multiwell 격판덮개의 하위 confluent 잘 셀의 충분 한 번호를 제공 해야 합니다.
참고: 격리와 GSCs의 확장에 대 한 자세한 절차는 사용할 수 17.
3. Cytometry GFAP:GFP 식의 결정
- 각 기자 복제 및 GFP-긍정적인 세포의 정확한 비율을 결정 하기 위해 비 불리고 컨트롤 셀 (0.5 mL)의 약 수를 수확. 고려 기자 클론 1 ~ 5 %GFP-긍정적인 세포를 포함 하는.
- 실 온에서 5 분 동안 360 x g에서 셀 회전 고 열망 하 여 상쾌한을 제거 합니다.
- 각 펠 릿 세포 분리 시 약의 200 µ L을 추가 하 고 37 ° c 설정 물 욕조에 튜브를 품 어
- (보통 20 ~ 30 배) 사이의 단일 세포 현 탁 액을 달성 하기 위해 부드럽게 셀 triturate
- 셀 첨부 파일 또는 집계를 최소화 하기 위해 800 µ L HBSS 1 mL의 최종 볼륨을 추가 합니다.
- 각 세포 현 탁 액에서 96 multiwell 격판덮개의 우물 당 200 µ L를 전송 합니다.
- 이 절차에 대 한 96 잘 접시 기능이 있는 벤치탑 교류 cytometer를 사용 합니다. 각 인수에 대 한 적어도 10000 가능한 셀 흐름 cytometric 분석을 수행 합니다.
4. 엘 다 자기 갱신 분석 결과 Clonogenic 용량을 평가 하
참고: 컨트롤에 대 한 모두 부모의 비 불리고, 뿐 아니라, GFP 표현 lentivirus 불리고 셀 사용 해야 원래 GSC 문화는 그들이에 GSC 차별화 기자 라인의 상대 clonogenic 잠재력을 결정 하 파생.
- 위에서 설명한 대로 차별화 기자 subclones 단일 셀 정지로 해리.
- 플레이트 셀 셀 밀도 잘 당 5, 500 세포 사이에서 완전 한 신경 줄기 세포 성장 매체의 100 µ L에서 96 multiwell 격판덮개에.
- 37 ° C, 5% CO2에서 9 ~ 11 일에 대 한 셀을 품 어.
- Neurospheres는 가벼운 현미경의 직접 시각화 하 여 긍정적인 웰 스 점수. 잘 "긍정적인" 적어도 하나의 큰 neurosphere 포함 하는 경우 고려 되어야 한다.
- 데이터 연결: 웰 스 분석 및 http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html에서 사용할 수 있는 엘 다 온라인 인터페이스를 사용 하 여 양수 우물의 수.
5. 약물 라이브러리 희석 준비
- -80 ° C에 저장에서 라이브러리 번호판을 제거, 알루미늄 호 일 커버 (빛에 민감한 화합물 보호). 실 온에서 1 시간 30 분 약 thaw.
- 12 채널 멀티 채널 pipettor를 사용 하 여 완전 한 신경 줄기 세포 매체에 0.2 m m를 라이브러리 화합물을 희석. 성장 매체에서 10 %DMSO 희석
참고: DMSO의 최종 농도 0.1% 셀에 추가 해야 합니다. 문화에 있는 DMSO의 높은 농도 독성에 발생할 수 있습니다. 이러한 이유로, 치료 전에 사용 세포 선에서 DMSO에 감도 테스트 하는 것이 좋습니다. - 차량 제어로 DMSO를 사용 하 여 셀 (열 1, 12; 각 판의 왼쪽 및 오른쪽 열에서 발견 치료 웰 스 A H 통해)입니다.
- 커버 알루미늄 호 일로 희석된 라이브러리 접시 하 고 장기 저장을 위한-80 ° C 냉장고를 원래 라이브러리 접시를 반환 합니다.
6. 약 스크린
참고: DMSO 치료 셀 설정 기준 형광 게이팅 조정 하는 사용 되어야 한다.
- 5 x 103 셀 완전 한 신경 줄기 세포 성장 매체의 99 µ L에서 96 multiwell 격판덮개에 격판덮개.
- 12 채널 멀티 채널 pipettor를 사용 하 여 셀 2 µ M (세포 현 탁 액의 99 µ L에 0.2 m m 약 1 µ L)의 최종 농도에 희석된 라이브러리 화합물 또는 DMSO (제어) 취급 합니다. 37 ° C, 5% CO2에서 72 h에 대 한 번호판을 품 어.
- 12 채널 멀티 채널 pipettor를 사용 하 여 각 잘 하 셀 분리 시 약의 150 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 20 분 동안 품 어
- 단일 셀 서 스 펜 션 (20 ~ 30 번) 사이 보통 달성 될 때까지 부드럽게 12 채널 멀티 채널 pipettor 함께 분쇄 하 여 세포를 분리. Neurospheres를 완전히 분리 하는 데 필요한 시간의 양을 GSC 라인 사이 달라질 수 있습니다. 권장된 셀 분리 시 안전은 (자료 참조) 최대 45 분간 인큐베이션 했다 생존 능력에 영향을 주지 않습니다 여러 GSC 라인 테스트 하는 동안 심사에 사용 될 각 GSC 라인에 대 한 확인 합니다.
참고: 각 최종 볼륨 잘 이어야 한다 대략 250 µ L (세포 현 탁 액의 100 µ L +의 세포 분리 시 약 150 µ L). - GFAP:GFP 기자 cytometry로 표현 하는 세포의 백분율을 결정 합니다. 표준 제어 전략을 사용 합니다. 먼저, 셀 크기와 생존의 일반적인 감각을 얻을 하 고 측면 없앤다 플롯. 다음 가능한 단일 세포 인구에 게이트를 놓습니다. 이것은 인구 녹색 형광 (eGFP) 결정 됩니다. "히트" 긍정적으로 간주 됩니다 (DMSO 처리) 어떤 화합물 GFP-긍정적인의 비율에 있는 증가 세포 3 표준 편차에 의해 제어 이 임계값에 따라 특정 응용 프로그램 및 원하는 엄중 조정 되어야 한다.
참고: 높은 처리량에 대 한 스크린은 권장 단일 GSC 기자 subclone를 사용 하 여. 히트 식별 다음 각 히트 같은 GSC 선에서 추가 기자 subclones에 대 한 확인 되어야 합니다. 사실 조회에 대 한 신뢰도 증가 하는 또한 것이 좋습니다 라인 다른 GSC neurospheres에서 격리 화합물 기자 subclones에 대 한 테스트.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3 개의 독립적인 환자 파생 neurospheres 라인 Zeocin 저항 카세트 녹색 형광 단백질 (GFP) 융합에 프레임에 대 한 인코딩 lentivirus astroglial 기자와 불리고 되었고 인간의 GFAP 발기인 요소 ( 에 의해 구동 그림 1). 다음 개별 클론 96 잘 접시 (그림 2)에 잘 당 0.7 셀을 도금 하 여 고립 되었다,이 GFP (그림 3)를 표현 하는 세포의 백분율의 흐름 cytometric 결정에 의해 그 뒤를 이었다. Neurosphere 클론, ≤ 5 %GFP-긍정적인 세포를 포함 하는 단일 셀에서 파생 이라고 GL (GFAP 낮은) ≥75 %GFP 긍정적인 세포를 포함 하는 클론 GH (GFAP 높은) 라고 하 고는 GL에 비해 더 분화 될 것으로 간주 됩니다. subclones (그림 4)입니다.
에이전트와 GSCs에 astroglial 차별화를 제어할 수 있는 경로 식별 하기 위해 작은 분자 약물 화면 두 NIH 임상 컬렉션 라이브러리를 사용 하 여 수행 되었다. NIH 임상 컬렉션에서 727 라이브러리 에이전트와 72 시간 I 및 II, 2 µ M의 농도 또는 컨트롤로 DMSO의 동일한 볼륨에 설정에 대 한 세포 치료. 이러한 에이전트의 효과 모든 환자에서 파생 된 GBM neurosphere 라인 0.2 µ M에서 마약 검사 전에 20 µ M에 배열 하는 농도 세포 생존 능력에 시험 되었다. 농도 astroglial 차별화를 유도 할 수 있던 화합물을 식별 하는이 프로토콜에서 사용 하는 동시에, 그것은 더 높은 약물 농도로 인해 대상에서 잠재적으로 독성 효과 최소화.
부 화, 다음 우리는 cytometry에 의해 GFAP GFP 기자를 표현 하는 세포의 비율 결정. 생존 및 GFP-긍정적인 세포의 비율에 대 한 기준을 각 라이브러리 플레이트에 대 한 적어도 3 개의 우물에 결정 했다 고 긍정적인 히트 기준선 (DMSO)를 통해 3 개의 표준 편차의 GFP-긍정적인 세포의 비율의 증가로 결정 했다 그리고 25 %GFP 긍정적인 세포의 최소 임계값. GFP-긍정적인 인구 (표 1)에 충분 한 증가 유발 하는 12 약물 파악.
그림 1: Astroglial 차별화 기자 시스템입니다.
PGreenZeo GFAP:GFP 기자의 회로도입니다. GSCs 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP) 발기인을 활성화 하는 데 필요한 녹음 방송 요인의 적절 한 결합을 표현 하지 않습니다 하 고 따라서 GFP (상단 패널)을 표현 하지 않습니다. 그러나, 적절 한 전사 인자는 존재 (셀 astroglial 운명-을 취득 하는 경우 예: 차별화) GFAP 발기인 활성화 되 고 셀 GFP 기자 (하단 패널)를 표현 합니다. (GSC-Glioma 줄기 세포, T2A 단백질 링커, Zeo-R-Zeocin 저항 유전자, TF-녹음 방송 요인). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: Astroglial 차별화-Subclone 선택입니다.
낮은 수준 (GL) 또는 높은 수준의 (GH) 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 GFAP:GFP 기자를 표현 하는 HSR GBM1 GSC subclones의 대표 사진 (40 X 확대 표시 됩니다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Cytometry 녹색 형광의 결정에 대 한.
HSR GBM1 환자 파생 neurosphere 라인 GFAP:GFP 기자 lentivirus로 불리고는 그리고 여러 subclones GFP neurosphere 시작 셀에 식에 따라 고 cytometry에 의해 확인 된 선정 됐다. 이러한 GL (GFAP 낮은) 또는 GH (GFAP 높은) 선정 됐다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: HSR GBM1 GFAP:GFP의 기능 특성 subclones.
GL subclones는 더 clonogenic에서 시험관에 의해는 극단적인 제한 희석 분석 (ELDA) 측정는 GSC 주파수 증가에 표시 된 대로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 이름 | GFP + 셀 배 증가 | 설명 | 혈액 뇌 장벽 | 마약 은행 확률 |
| Vinorelbine | 8.97 | 반대로 mitotic 화학 요법 | - | 0.88 |
| Diphenoxylate | 13.89 | Antidiarrheal | + | 0.96 |
| Lomerizine | 10.89 | 칼슘 채널 차단제 / 대뇌 vasodilator | NA | NA |
| Phenprobamate | 10.73 | 완화 / 근육 이완, 중앙 행동 | NA | NA |
| 6-Azauridine | 15.07 | Antimetabolite / 항 바이러스 | NA | NA |
| Irinotecan | 14.14 | Topisomerase 나 억제제 | + | 0.63 |
| Atracurium Besylate | 8.16 | Nondepolarizing 골격 근육 완화 제 | + | 0.93 |
| Glimepiride | 8.75 | 당뇨 | + | 0.73 |
| Hexachlorophene | 9.83 | 살 균 | + | 0.92 |
| Digoxin | 8.23 | Cardiotonic glycoside | - | 0.72 |
| Flecainide | 10 | 항 부정맥 제 | + | 0.86 |
| Nisoldipine | 5.05 | 칼슘 채널 차단제 | - | 0.95 |
표 1: 작은 분자 GFAP GFP 기자 식 HSR GBM1 GL-1 유도
12 화합물 GFP 표현 세포의 비율을 크게 증가 하는 것을 발견 했다 (배 증가 표시) 및 기준선, DMSO 치료 세포 이상과 미만 25 %GFP-긍정적인 세포 ≥3 표준 편차의 엄격한 기준을 충족. 능력과 주어진된 대리인의 확률 교차 하는 혈액 두뇌 방 벽 (마약 은행 (−). 약어: 없음 (사용할 수 없는 정보)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
그들을 정의 하는 표식에 주로 집중 하는 GSCs의 이전 연구의 대부분,이 연구에서 우리가 결정 역 접근 하는 것. 우리는 GSCs (예를 들어, 셀 astroglial와 신경 마커)에 의해 생성 된 차별화 된 progenies에 주로 집중 한다. 여기 우리 인간의 GFAP 발기인 종속 식을 GFP의 기반 시스템 심사 높은 처리량 셀 기반 약물의 사용을 보여 줍니다. 모든 실험 환자 파생 neurosphere 세포종 세포 라인을 활용 하 여 수행 했다. 분리와이 라인의 확장을 설명 하는 상세한 프로토콜 Galli 외17에 설명 되어 있습니다.
시스템 뿐만 아니라 GSCs의 세포 분화를 유도 할 수 있다 그러나 또한 도움이 우리가 astroglial 분화 마커 GFAP 표현 결정 명백 하 게 결정 하는 작은 분자의 식별에 우리를 원조는 GSC 주파수를 비교 하 여 개별 GBM 셀의 clonogenic 용량. ELDA 분석 결과 Yifang Hu와 고 든 K. 스미스에 의해 개발 되었다. 독자는 분석 결과 장점과 한계15의 충분히 이해에 대 한 원고를 읽을 것을 권장. 단계 점수 식민지 형성은 매우 셀 종속 및 사용 셀 라인에 따라 조정 필요 합니다. 또한, 일반적으로 우리는 neurosphere GSC clonogenic에 의해 유래 했다 좋은 표시로 구체 직경 ≥100 µ m를 사용 합니다.
또한, 우리가 여기에 대해 설명 하는 시스템을 심사 하는 약물 GSCs 미 분화 상태에서를 유지 하는 데 필요한 새로운 경로 (특히 아 세 틸 콜린과 칼슘 전송)의 식별에 대 한 수 있습니다 (표 1 참조). 시작 약물 농도 사용 라이브러리 및 셀 라인에 따라 달라질 수 있습니다. 또한, 세포 분화에 필요한 시간은 조정을 할 수 있습니다. 또한, 마약 안타의 tumorigenic 유효성 검사 vivo에서 종양 개시 시험 18필요 합니다.
잠재적으로이 기술의 마이너 한계가 이다 자발적인 차별화 필연적으로 어떤 줄기 세포 농축 문화에서 발생 하 고이 현상을 문화에서 통로의 수와 함께 증가 하는 경향 및 개별 subclones 사이 다릅니다. 사실, 우리 자연 차별화 우리의 subclones에서 일반적으로 후 관찰 통로 15. 따라서, 우리는 우리의 차별화 분석 통로 숫자 5를 초과 하지 않는 문화에 제한.
따라서, 아마도이 방법론에서 가장 중요 한 포인트에서 일 생체 외에서를 최소 하 고 이러한 GSCs의 생체 외에서 뿌리고 유지 하는 1.5x105 셀/mL 아래 문화 밀도 유지. 또한, 각 약물 같은 GSC 선에서 추가 기자 subclones에 대 한 뿐만 아니라, 기자 subclones에 대 한 유효성 검사는 "히트" 다른 환자 파생 GSC neurospheres에서 라인 격리 하는 것이 좋습니다. 이것은 진정한 "히트"가 자신감 증가.
이 강력한 프로토콜에서 설명 하는 방법론의 다양성 약물 유발 암 줄기 세포 분화의 치료 가치를 강화 하 고 GBM 및 다른 종양에 대 한 잠재적인 새로운 치료 전략으로 신약을 식별에 도움이 될. 마지막으로, 분석 결과 비 종양 약 신경 줄기 세포, 다른 암 종류와 다른 차별화 기자 데 최적화 될 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH R01CA187780에 의해 부분적으로 지원 되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ESGRO Complete Accutase | EMD Millipore | SF006 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) | SBI (System Biosciences) | SR10015VA-1 | |
| 50 ml sterile disposable reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 96 well plate | Falcon | 353072 | |
| Biolite T25 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biolite T75 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130190 | |
| 15 ml Centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 1.5ml Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 - 20uL | VistaLab Technologies | 1060-0020 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL | VistaLab Technologies | 1060-0250 | |
| Multi 12-channel pipette tips 25 μl | VistaLab Technologies | 4060-1002 | |
| Multi 12-channel pipette tips 250 μl | VistaLab Technologies | 4060-9025 | |
| Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer | EMD Millipore | 0500-4005 | |
| NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries | Evotec | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For the preparation of neural stem cell media (500 mL) | Final concentration | ||
| BSA | GoldBio.com | A-421-250 | 0.20% |
| DMEM/F12 10X | Corning | 90-091-PB | 1X |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3149 | 0.0002% |
| HEPES 1M | Sigma Aldrich | H4036 | 5.4 mM |
| Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) | Life Technologies | 41400-045 | 1X |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | 14.5 mM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X | Gibco | 15140-122 | 1X |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | 16 nM |
| Putrescine | Sigma Aldrich | P5780 | 4.8 µM |
| Basic FGF (FGF2), Human | GoldBio | 1140-02-50 | 10 ng/ml |
| EGF, Human | GoldBio | 1150-04-100 | 20 ng/ml |
| Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind | Corning | 431160 | Use to filter sterlize media |
References
- Maher, E. A., et al. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).
- Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network. Cancer Res. 71 (12), 4055-4060 (2011).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Sul, J., Fine, H. A. Malignant gliomas: new translational therapies. Mt Sinai J Med. 77 (6), 655-666 (2010).
- Bar, E. E., Chaudhry, A., Farah, M. H., Eberhart, C. G. Hedgehog signaling promotes medulloblastoma survival via Bc/II. Am J Pathol. 170 (1), 347-355 (2007).
- Chu, Q., Orr, B. A., Semenkow, S., Bar, E. E., Eberhart, C. G. Prolonged inhibition of glioblastoma xenograft initiation and clonogenic growth following in vivo Notch blockade. Clin Cancer Res. 19 (12), 3224-3233 (2013).
- Schreck, K. C., et al. The Notch target Hes1 directly modulates Gli1 expression and Hedgehog signaling: a potential mechanism of therapeutic resistance. Clin Cancer Res. 16 (24), 6060-6070 (2010).
- Warrell, R. P. Jr, et al. Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin (all-trans-retinoic acid). N Engl J Med. 324 (20), 1385-1393 (1991).
- Piccirillo, S. G., et al. Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444 (7120), 761-765 (2006).
- Bar, E. E., et al. Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma. Stem Cells. 25 (10), 2524-2533 (2007).
- Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres. Am J Pathol. 177 (3), 1491-1502 (2010).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathol. 50 (4), 357-368 (2012).
- Lim, K. S., et al. Inhibition of monocarboxylate transporter-4 depletes stem-like glioblastoma cells and inhibits HIF transcriptional response in a lactate-independent manner. Oncogene. 33 (35), 4433-4441 (2014).
- Kahlert, U. D., et al. ZEB1 Promotes Invasion in Human Fetal Neural Stem Cells and Hypoxic Glioma Neurospheres. Brain Pathol. 25 (6), 724-732 (2014).
- Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
- Meyer, M., et al. Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 851-856 (2015).
- Galli, R., et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64 (19), 7011-7021 (2004).
- Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Atracurium Besylate and other neuromuscular blocking agents promote astroglial differentiation and deplete glioblastoma stem cells. Oncotarget. 7 (1), 459-472 (2016).
