Summary

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokoll för låg-överflöd embryonala prover

Published: August 29, 2017
doi:

Summary

Här beskriver vi en kromatin immunoprecipitation (ChIP) och ChIP-seq bibliotek förberedelse-protokollet att generera globala epigenetisk profiler från låg-överflöd kyckling embryonala prover.

Abstract

Kromatin immunoprecipitation (ChIP) är en allmänt använd teknik för att kartlägga lokaliseringen av post-translationally modifierade histoner, Histon varianter, transkriptionsfaktorer eller kromatin-ändra enzymer vid en viss locus eller genome-wide skala. Kombinationen av ChIP analyser med nästa generations sekvensering (dvs ChIP-Seq) är en kraftfull metod att globalt avslöja gen regleringsnät och förbättra funktionella annotering av genomen, speciellt hos icke-kodande reglerande sekvenser. ChIP protokoll kräver normalt stora mängder cellulära material, utgör således hinder tillämpligheten av denna metod att undersöka sällsynta celltyper eller små vävnadsbiopsier. För att göra ChIP analysen förenlig med mängden biologiskt material som kan vanligtvis erhållas i vivo under tidiga ryggradsdjur embryogenes, beskriver vi här en förenklad ChIP protokoll där antalet steg krävs för att slutföra den assay förminskades för att minimera prov förlust. Detta ChIP protokoll har framgångsrikt använts för att undersöka olika Histon ändringar i olika embryonala kyckling och vuxen mus vävnader med låg till medelhög cell nummer (5 x 104 – 5 x 105 celler). Allt detta protokoll är kompatibel med ChIP-seq teknik använda standardbiblioteket beredningsmetoder, vilket ger global epigenetisk kartor i högrelevant embryonala vävnader.

Introduction

Histon post-translationella modifieringar är direkt involverade i olika kromatin-beroende processer, inklusive transkription, replikering och DNA reparation1,2,3. Dessutom olika Histon ändringar visar positiva (t.ex. H3K4me3 och H3K27ac) eller negativt (t.ex. H3K9me3 och H3K27me3) korrelationer med genuttryck och kan definieras brett som aktiverande eller repressiva Histon markerar, respektive2,3. Följaktligen, globala Histon modifiering kartor, även kallad epigenetisk kartor, har dykt upp som kraftfulla och universella verktyg att funktionellt kommentera ryggradsdjur genomen4,5. Till exempel distala reglerande sekvenser såsom förstärkare kan identifieras baserat på förekomsten av specifika kromatin signaturer (t.ex. aktiv förstärkare: H3K4me1 och H3K27ac), som skilja dem från proximala arrangören regioner (t.ex. aktiva initiativtagare: H3K4me3)6,7,8. Å andra finns gener med stora cell identitet tillsynsuppdrag normalt med bred kromatin domäner markerats med H3K4me3 eller H3K27me3, beroende på de underliggande generna, transcriptionally aktiv eller inaktiv status respektive9 ,10. Likaså verkar uttrycket av stora cell identitet gener kontrolleras ofta av flera och rumsligt klustrade Smakförstärkare (dvs Super smakförstärkare), som kan identifieras som bred H3K27ac-märkta domäner11.

För närvarande, genereras Histon modifiering kartor med hjälp av ChIP-seq-teknologi, som i jämförelse med föregående metoder såsom ChIP-chip (ChIP kopplat till microarrays) ger högre upplösning, färre artefakter, mindre buller, bättre täckning och lägre kostar12. Generering av epigenetisk kartor med ChIP-seq teknik har dock dess inneboende begränsningar, främst förknippas med förmåga att framgångsrikt utföra ChIP i prover av intresse. Traditionella ChIP protokoll krävs vanligtvis miljontals celler, som begränsa tillämpligheten av denna metod till in vitro cell linjer eller celler som enkelt kan isolerade i vivo (t.ex. blodkroppar). Under de senaste åren varit ett antal modifierade ChIP protokoll kompatibel med låg cell nummer beskrivs13,14,15,16. Dock dessa protokoll är speciellt konstruerat för att kopplas med nästa generations sekvensering (dvs ChIP-seq) och de vanligtvis använder ad hoc- bibliotek förberedelse metoder13,14, 15 , 16.

Här, vi beskrivit ett ChIP-protokoll som kan användas för att undersöka Histon modifiering profiler med låg till intermediär cell nummer (5 x 104 – 5 x 105 celler) på antingen valda loci (dvs ChIP-qPCR) eller globalt (dvs. ChIP-seq) (figur 1). När kopplat till ChIP-seq teknik, kan våra ChIP-protokollet användas tillsammans med standardbiblioteket beredningsmetoder, vilket gör det i stort sett tillgängliga för många laboratorier10. Detta protokoll har använts för att undersöka flera Histon markerar (t.ex. H3K4me3, H3K27me3 och H3K27ac) i olika kyckling embryonala vävnader (t.ex. spinal neuralrörsdefekter (SNT), frontonasal protuberanser och epiblast). Vi räknar dock med att det bör vara allmänt tillämpliga för andra organismer där biologiskt och/eller kliniskt relevanta prover endast kan erhållas i små mängder.

Protocol

enligt tyska djurvård riktlinjer, inga djur institutionsvård och användning kommittén (IACUC) godkännande var nödvändigt att utföra chicken embryo experimenten. Enligt lokala riktlinjer kräver endast experiment med kyckling HH44 (18 dagar) embryon och äldre IACUC godkännande. De embryon som används i denna studie var dock alla i tidigare stadier av embryonal utveckling (dvs. HH19 (72 h)). Obs: Syftet med detta protokoll är att ge en detaljerad beskrivning av ChIP analys…

Representative Results

För att illustrera prestanda för våra ChIP protokoll, utfört vi ChIP-seq experiment med poolade SNT sektioner från HH19 kyckling embryon, maxillary protuberanser av HH22 kyckling embryon, och scenen-HH3 kyckling embryon att undersöka bindande profiler olika Histon ändringar (dvs. H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 och H3K27me3). När ChIP DNAs erhölls, utvärderades ultraljudsbehandling effektiviteten av agaros gelelektrofores av de motsvarande ingående DNAs (<strong class="xfig"…

Discussion

Epigenetisk profilering av Histon modifiering med ChIP-seq kan användas för att förbättra funktionella annotering av vertebrate genomen i olika cellulära sammanhang4,5,18. Dessa epigenetisk profiler kan användas, bland annat för att identifiera enhancer element, att definiera den reglerande delstaten Smakförstärkare (dvs, aktiv, grundmålade eller redo), och att definiera stora cell identitet tillsynsmyndighete…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna vill tacka Jan Appel för hans utmärkta tekniska bistånd under etableringen av detta protokoll. Arbete i Rada-Iglesias laboratoriet stöds av CMMC intramurala finansiering, DFG forskningsanslag (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1 och TE 1007/3-1), UoC avancerade forskaren grupp Grant och CECAD beviljande.

Materials

Reagent
BSA powder Carl Roth 3737.3
Phosphate Saline buffer (PBS) Sigma Aldrich D8537
Tris-HCL pH8.0 Sigma Aldrich T1503
NaCl Carl Roth 3957.2
EDTA Carl Roth 8043.2
EGTA Carl Roth 3054.2
Na-Deoxycholate Sigma Aldrich D6750-24
N-lauroylsarcosine Sigma Aldrich 61743-25G
Hepes Applichem A3724,0250
LiCl Carl Roth 3739.2
NP-40 Sigma Aldrich I3021-100ml
SDS Carl Roth 1833
Protein G/magnetic beads Invitrogen 1004D
37% Formaldehyde Sigma Aldrich 252549-1L
Glycine
RNase Peqlab 12-RA-03
Proteinase K Sigma Aldrich 46.35 E
Na-butyrate Sigma Aldrich SLB2659V
Proteinase inhibitor Roche 5892791001
SYBRgreen Mix biozym 617004
dH2O Sigma Aldrich W4502
1Kb ladder Thermofisher SM1333
Orange G Sigma Alrich 03756-25
Agarose Invitrogen 16500-500
0.25% Trypsin-EDTA (1X) Gibco 25200-072
Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100) Roth 3051.4
DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) Gibco 31331-028
Gel loading tips Multiflex A.Hartenstein GS21
qPCR Plates Sarstedt 721,985,202
384 well Sarstedt 721,985,202
1.5 mL tubes Sarstedt 72,706
100-1000µl Filter tips Sarstedt 70,762,211
2-20µl Filter tips Sarstedt 70,760,213
2-200µl Filter tips Sarstedt 70,760,211
0.5-10µl Filter tips Sarstedt 701,116,210
H3K27me3 antibody Active Motif 39155
H3K27ac antibody Active Motif 39133
H3K4me3 antibody Active Motif 39159
H3K4me2 antibody Active Motif 39141
End Repair Mix Illumina FC-121-4001
Paramagnetic beads Beckman Coulter A63881
Resuspension buffer Illumina FC-121-4001
A-Tailing Mix Illumina FC-121-4001
Ligation Mix Illumina FC-121-4001
RNA Adapter Indexes Illumina RS-122-2101
Stop Ligation Buffer Illumina FC-121-4001
PCR Primer Cocktail Illumina FC-121-4001
Enhanced PCR Mix Illumina FC-121-4001
Genomic DNA ladder Agilent 5067-5582
Elution Buffer Agilent 19086
Sample Buffer Agilent 5067-5582
Library Quantification Kit Kapa Biosystems KK4835 – 07960204001
Fertile chicken white eggs LSL Rhein Main KN: 15968
Needle (Neoject) A.Hartenstein 10001
Syringe (Ecoject 10ml) Dispomed witt oHG 21010
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Centrifuge Hermle Z 216 MK
Thermoshaker ITABIS MKR13
Sonicator Active Motive EpiShear probe sonicator
Sonicator Diagenode Bioruptor Plus
Rotator Stuart SB3
Variable volume (5–1,000 μl) pipettes Eppendorf N/A
Timer Sigma N/A
Magnetic holder Thermo Fisher DynaMag-2 12321D
Table spinner Heathrow Scientific Sprout
Mixer LMS VTX 3000L
Real-Time PCR Cycler Roche Light Cycler; Serial Nr.5662
PCR Cycler Applied Biosystems Gene Amp PCR System 9700
DNA and RNA quality control system Agilent Agilent 4200 TapeStation System
Forceps Dumont 5-Inox-H
Perforated spoon World precision instruments 501997

References

  1. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
  2. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  3. Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K. Characterization of human epigenomes. Curr Opin. Genet Dev. 19 (2), 127-134 (2009).
  4. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  5. Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  6. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  7. Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  8. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  9. Benayoun, B. A., et al. H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency. Cell. 158 (3), 673-688 (2014).
  10. Rehimi, R., et al. Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations. Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).
  11. Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  12. Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).
  13. Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
  14. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  15. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
  16. Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
  17. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).
  18. Ho, J. W. K., et al. Comparative analysis of metazoan chromatin organization. Nature. 512 (7515), 449-452 (2014).
  19. Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why?. Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
  20. Spitz, F., Furlong, E. E. M. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).

Play Video

Cite This Article
Rehimi, R., Bartusel, M., Solinas, F., Altmüller, J., Rada-Iglesias, A. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples. J. Vis. Exp. (126), e56186, doi:10.3791/56186 (2017).

View Video