Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokoll för låg-överflöd embryonala prover
Summary
Här beskriver vi en kromatin immunoprecipitation (ChIP) och ChIP-seq bibliotek förberedelse-protokollet att generera globala epigenetisk profiler från låg-överflöd kyckling embryonala prover.
Abstract
Kromatin immunoprecipitation (ChIP) är en allmänt använd teknik för att kartlägga lokaliseringen av post-translationally modifierade histoner, Histon varianter, transkriptionsfaktorer eller kromatin-ändra enzymer vid en viss locus eller genome-wide skala. Kombinationen av ChIP analyser med nästa generations sekvensering (dvs ChIP-Seq) är en kraftfull metod att globalt avslöja gen regleringsnät och förbättra funktionella annotering av genomen, speciellt hos icke-kodande reglerande sekvenser. ChIP protokoll kräver normalt stora mängder cellulära material, utgör således hinder tillämpligheten av denna metod att undersöka sällsynta celltyper eller små vävnadsbiopsier. För att göra ChIP analysen förenlig med mängden biologiskt material som kan vanligtvis erhållas i vivo under tidiga ryggradsdjur embryogenes, beskriver vi här en förenklad ChIP protokoll där antalet steg krävs för att slutföra den assay förminskades för att minimera prov förlust. Detta ChIP protokoll har framgångsrikt använts för att undersöka olika Histon ändringar i olika embryonala kyckling och vuxen mus vävnader med låg till medelhög cell nummer (5 x 104 – 5 x 105 celler). Allt detta protokoll är kompatibel med ChIP-seq teknik använda standardbiblioteket beredningsmetoder, vilket ger global epigenetisk kartor i högrelevant embryonala vävnader.
Introduction
Histon post-translationella modifieringar är direkt involverade i olika kromatin-beroende processer, inklusive transkription, replikering och DNA reparation1,2,3. Dessutom olika Histon ändringar visar positiva (t.ex. H3K4me3 och H3K27ac) eller negativt (t.ex. H3K9me3 och H3K27me3) korrelationer med genuttryck och kan definieras brett som aktiverande eller repressiva Histon markerar, respektive2,3. Följaktligen, globala Histon modifiering kartor, även kallad epigenetisk kartor, har dykt upp som kraftfulla och universella verktyg att funktionellt kommentera ryggradsdjur genomen4,5. Till exempel distala reglerande sekvenser såsom förstärkare kan identifieras baserat på förekomsten av specifika kromatin signaturer (t.ex. aktiv förstärkare: H3K4me1 och H3K27ac), som skilja dem från proximala arrangören regioner (t.ex. aktiva initiativtagare: H3K4me3)6,7,8. Å andra finns gener med stora cell identitet tillsynsuppdrag normalt med bred kromatin domäner markerats med H3K4me3 eller H3K27me3, beroende på de underliggande generna, transcriptionally aktiv eller inaktiv status respektive9 ,10. Likaså verkar uttrycket av stora cell identitet gener kontrolleras ofta av flera och rumsligt klustrade Smakförstärkare (dvs Super smakförstärkare), som kan identifieras som bred H3K27ac-märkta domäner11.
För närvarande, genereras Histon modifiering kartor med hjälp av ChIP-seq-teknologi, som i jämförelse med föregående metoder såsom ChIP-chip (ChIP kopplat till microarrays) ger högre upplösning, färre artefakter, mindre buller, bättre täckning och lägre kostar12. Generering av epigenetisk kartor med ChIP-seq teknik har dock dess inneboende begränsningar, främst förknippas med förmåga att framgångsrikt utföra ChIP i prover av intresse. Traditionella ChIP protokoll krävs vanligtvis miljontals celler, som begränsa tillämpligheten av denna metod till in vitro cell linjer eller celler som enkelt kan isolerade i vivo (t.ex. blodkroppar). Under de senaste åren varit ett antal modifierade ChIP protokoll kompatibel med låg cell nummer beskrivs13,14,15,16. Dock dessa protokoll är speciellt konstruerat för att kopplas med nästa generations sekvensering (dvs ChIP-seq) och de vanligtvis använder ad hoc- bibliotek förberedelse metoder13,14, 15 , 16.
Här, vi beskrivit ett ChIP-protokoll som kan användas för att undersöka Histon modifiering profiler med låg till intermediär cell nummer (5 x 104 – 5 x 105 celler) på antingen valda loci (dvs ChIP-qPCR) eller globalt (dvs. ChIP-seq) (figur 1). När kopplat till ChIP-seq teknik, kan våra ChIP-protokollet användas tillsammans med standardbiblioteket beredningsmetoder, vilket gör det i stort sett tillgängliga för många laboratorier10. Detta protokoll har använts för att undersöka flera Histon markerar (t.ex. H3K4me3, H3K27me3 och H3K27ac) i olika kyckling embryonala vävnader (t.ex. spinal neuralrörsdefekter (SNT), frontonasal protuberanser och epiblast). Vi räknar dock med att det bör vara allmänt tillämpliga för andra organismer där biologiskt och/eller kliniskt relevanta prover endast kan erhållas i små mängder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Epigenetisk profilering av Histon modifiering med ChIP-seq kan användas för att förbättra funktionella annotering av vertebrate genomen i olika cellulära sammanhang4,5,18. Dessa epigenetisk profiler kan användas, bland annat för att identifiera enhancer element, att definiera den reglerande delstaten Smakförstärkare (dvs, aktiv, grundmålade eller redo), och att definiera stora cell identitet tillsynsmyndighete…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Jan Appel för hans utmärkta tekniska bistånd under etableringen av detta protokoll. Arbete i Rada-Iglesias laboratoriet stöds av CMMC intramurala finansiering, DFG forskningsanslag (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1 och TE 1007/3-1), UoC avancerade forskaren grupp Grant och CECAD beviljande.
Materials
| Reagent | |||
| BSA powder | Carl Roth | 3737.3 | |
| Phosphate Saline buffer (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Tris-HCL pH8.0 | Sigma Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.2 | |
| Na-Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-24 | |
| N-lauroylsarcosine | Sigma Aldrich | 61743-25G | |
| Hepes | Applichem | A3724,0250 | |
| LiCl | Carl Roth | 3739.2 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I3021-100ml | |
| SDS | Carl Roth | 1833 | |
| Protein G/magnetic beads | Invitrogen | 1004D | |
| 37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-1L | |
| Glycine | |||
| RNase | Peqlab | 12-RA-03 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 46.35 E | |
| Na-butyrate | Sigma Aldrich | SLB2659V | |
| Proteinase inhibitor | Roche | 5892791001 | |
| SYBRgreen Mix | biozym | 617004 | |
| dH2O | Sigma Aldrich | W4502 | |
| 1Kb ladder | Thermofisher | SM1333 | |
| Orange G | Sigma Alrich | 03756-25 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-072 | |
| Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100) | Roth | 3051.4 | |
| DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) | Gibco | 31331-028 | |
| Gel loading tips Multiflex | A.Hartenstein | GS21 | |
| qPCR Plates | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 384 well | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 1.5 mL tubes | Sarstedt | 72,706 | |
| 100-1000µl Filter tips | Sarstedt | 70,762,211 | |
| 2-20µl Filter tips | Sarstedt | 70,760,213 | |
| 2-200µl Filter tips | Sarstedt | 70,760,211 | |
| 0.5-10µl Filter tips | Sarstedt | 701,116,210 | |
| H3K27me3 antibody | Active Motif | 39155 | |
| H3K27ac antibody | Active Motif | 39133 | |
| H3K4me3 antibody | Active Motif | 39159 | |
| H3K4me2 antibody | Active Motif | 39141 | |
| End Repair Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Paramagnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Resuspension buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| A-Tailing Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Ligation Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| RNA Adapter Indexes | Illumina | RS-122-2101 | |
| Stop Ligation Buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| PCR Primer Cocktail | Illumina | FC-121-4001 | |
| Enhanced PCR Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Genomic DNA ladder | Agilent | 5067-5582 | |
| Elution Buffer | Agilent | 19086 | |
| Sample Buffer | Agilent | 5067-5582 | |
| Library Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4835 – 07960204001 | |
| Fertile chicken white eggs | LSL Rhein Main | KN: 15968 | |
| Needle (Neoject) | A.Hartenstein | 10001 | |
| Syringe (Ecoject 10ml) | Dispomed witt oHG | 21010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Hermle | Z 216 MK | |
| Thermoshaker | ITABIS | MKR13 | |
| Sonicator | Active Motive | EpiShear probe sonicator | |
| Sonicator | Diagenode | Bioruptor Plus | |
| Rotator | Stuart | SB3 | |
| Variable volume (5–1,000 μl) pipettes | Eppendorf | N/A | |
| Timer | Sigma | N/A | |
| Magnetic holder | Thermo Fisher | DynaMag-2 12321D | |
| Table spinner | Heathrow Scientific | Sprout | |
| Mixer | LMS | VTX 3000L | |
| Real-Time PCR Cycler | Roche | Light Cycler; Serial Nr.5662 | |
| PCR Cycler | Applied Biosystems | Gene Amp PCR System 9700 | |
| DNA and RNA quality control system | Agilent | Agilent 4200 TapeStation System | |
| Forceps | Dumont | 5-Inox-H | |
| Perforated spoon | World precision instruments | 501997 |
References
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K. Characterization of human epigenomes. Curr Opin. Genet Dev. 19 (2), 127-134 (2009).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Benayoun, B. A., et al. H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency. Cell. 158 (3), 673-688 (2014).
- Rehimi, R., et al. Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations. Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).
- Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
- Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).
- Ho, J. W. K., et al. Comparative analysis of metazoan chromatin organization. Nature. 512 (7515), 449-452 (2014).
- Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why?. Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
- Spitz, F., Furlong, E. E. M. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
