Summary
Qui, descriviamo un'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) e il protocollo di preparazione libreria ChIP-seq per generare profili epigenomic globale da campioni di embrionali di pollo di basso-abbondanza.
Abstract
Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è una tecnica ampiamente utilizzata per il mapping la localizzazione di istoni traduzionalmente modificati, varianti dell'istone, fattori di trascrizione o enzimi modificanti la cromatina a un dato locus o su una scala di genoma. La combinazione di analisi di ChIP con sequenziamento di nuova generazione (cioè, ChIP-Seq) è un approccio potente per scoprire globalmente reti di regolazione genica e migliorare l'annotazione funzionale di genomi, soprattutto di non-codificazione di sequenze regolatrici. Protocolli di chIP normalmente richiedono grandi quantità di materiale cellulare, così precludendo l'applicabilità di questo metodo a investigare di tipi di cellule rare o le biopsie del tessuto piccolo. Al fine di rendere l'analisi del ChIP compatibile con la quantità di materiale biologico che in genere possa essere ottenuto in vivo durante l'embriogenesi dei vertebrati precoce, descriviamo qui un protocollo semplificato di ChIP in cui il numero di passaggi necessari per completare la analisi sono state ridotte per minimizzare la perdita di campione. Questo protocollo di ChIP è stato usato con successo per studiare le modificazioni istoniche differenti in vari pollo embrionale e tessuti di topo adulto utilizzando bassa ai numeri delle cellule medie (5 x 104 - 5 x 105 cellule). D'importanza, questo protocollo è compatibile con la tecnologia ChIP-seq utilizzando metodi di preparazione di libreria standard, fornendo così globale epigenomic mappe in tessuti embrionali altamente pertinenti.
Introduction
Modificazioni post-traduzionali degli istoni sono direttamente coinvolti nei vari processi di cromatina-dipendenti, compreso trascrizione, replicazione e DNA riparazione1,2,3. Inoltre, modificazioni istoniche differenti mostrano positivi (ad es., H3K4me3 e H3K27ac) o negativo (ad es., H3K9me3 e H3K27me3) correlazioni con espressione genica e possono essere definiti largamente come attivante o repressivo dell'istone segna, rispettivamente di2,3. Di conseguenza, mappe di modifica globale dell'istone, noto anche come epigenomic mappe, sono emersi come strumenti potenti e universali per annotare funzionalmente i genomi di vertebrati4,5. Ad esempio, sequenze regolatrici distale come rinforzatori possono essere identificati in base la presenza di firme di cromatina specifici (ad es., esaltatori di attivo: H3K4me1 e H3K27ac), che li distinguono dalle regioni promotore prossimale (per esempio, promotori attivi: H3K4me3)6,7,8. D'altra parte, i geni con funzioni di regolamentazione di identità delle cellule principali si trovano tipicamente con domini di cromatina ampio contrassegnati con H3K4me3 o H3K27me3, a seconda dello stato trascrizionalmente attivo o inattivo dei geni sottostanti, rispettivamente9 ,10. Allo stesso modo, l'espressione di geni di identità delle cellule principali sembra essere controllato frequentemente dal multiplo e spazialmente cluster rinforzatori (cioè, Super-rinforzatori), che possono essere identificati come vasto H3K27ac-contrassegnato domini11.
Attualmente, istone modifica mappe vengono generate utilizzando la tecnologia ChIP-seq, che rispetto alle precedenti approcci come ChIP-chip (ChIP accoppiato ai microarray) fornisce maggiore risoluzione, meno artefatti, meno rumore, copertura superiore e inferiore Costa12. Tuttavia, la generazione di mappe di epigenomic utilizzando la tecnologia ChIP-seq ha i suoi limiti intrinseci, principalmente connesse con la capacità di eseguire correttamente il ChIP nei campioni di interesse. Protocolli di ChIP tradizionali in genere necessari milioni di cellule, che limitano l'applicabilità di questo metodo al cellulare in vitro linee o cellule che può essere facilmente isolato in vivo (ad esempio, cellule del sangue). Negli ultimi anni, un numero di protocolli di ChIP modificate compatibile con numeri di cellulare bassa è stati descritti13,14,15,16. Tuttavia, questi protocolli sono progettati specificamente per essere accoppiato con sequenziamento di nuova generazione (cioè, ChIP-seq) e che in genere utilizzano hoc biblioteca preparazione metodi13,14, 15 , 16.
Qui, abbiamo descritto un protocollo di ChIP che può essere utilizzato per analizzare i profili di modifica dell'istone utilizzando numeri di basso a intermedio delle cellule (5 x 104 - 5 x 105 cellule) sia selezionato loci (cioè, ChIP-qPCR) o a livello globale (cioè, ChIP-seq) (Figura 1). Quando accoppiato alla tecnologia ChIP-seq, il nostro protocollo di ChIP può essere utilizzato insieme ai metodi di preparazione della libreria standard, rendendo così largamente accessibile a molti laboratori10. Questo protocollo è stato utilizzato per indagare parecchi contrassegni istone (ad es., H3K4me3, H3K27me3 e H3K27ac) in tessuti embrionali di pollo diversi (ad es., tubo neurale spinale (SNT), frontonasale protuberanze ed epiblasto). Tuttavia, possiamo anticipare che dovrebbe essere ampiamente applicabile ad altri organismi in cui biologicamente e/o clinicamente rilevanti campioni possono essere ottenuti solo in basse quantità.
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Protocol
secondo linee guida tedesca di cura degli animali, approvazione istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) non era necessario per eseguire gli esperimenti di embrione di pollo. Secondo le linee guida locali, solo esperimenti con embrioni di pollo HH44 (18 giorni) e più anziani richiedono approvazione IACUC. Tuttavia, gli embrioni utilizzati in questo studio erano tutti nelle prime fasi dello sviluppo embrionale (cioè, HH19 (72 h)).
Nota: lo scopo del presente protocollo è quello di fornire una descrizione dettagliata del test ChIP, quindi può essere efficacemente combinato con qPCR o sequenziamento di nuova generazione (cioè, ChIP-seq) per studiare le modificazioni istoniche basso-abbondanza embrionali campioni (che vanno da 5 x 10 4-5 x 10 5 celle per ogni reazione di ChIP) e diversi tipi di tessuto ( Figura 1). Il protocollo dovrebbe essere applicabile ad investigare i profili di associazione di fattori di trascrizione e co-attivatori (ad es., p300). Tuttavia, a causa dell'abbondanza bassa di queste proteine regolatorie, grandi numeri di cell rischiano di essere richiesto (5 x 10 5 - 5 x 10 6 cellule per ogni reazione di ChIP).
1. preparazione di uova e Microdissection del pollo SNT
Nota: la procedura per microdissections tecnicamente varia da tessuto a tessuto e dal modello animale al modello animale. Questa sezione descrive in dettaglio il protocollo di dissezione utilizzato per ottenere brachiale SNT sezioni da fase-HH19 embrioni di pollo ad esempio.
- Incubare le uova di gallina livornese bianco fertile, ottenute da un allevatore locale, in orientamento orizzontale a 37 ° C e 80% di umidità per 3 giorni per ottenere fase-HH19 embrioni di pollo.
- Determinare le fasi secondo l'Hamburger e Hamilton pollo gestione temporanea dello sviluppo embrionale sistema 17.
- Eseguire tutti i microdissections in condizioni di freddo; in caso contrario, potrebbe essere compromessa l'integrità della cromatina.
- Isolare gli embrioni HH19.
- Per rendere accessibili gli embrioni, estrarre 3 mL di albumina usando una siringa da 10 mL con un ago (0,90 x 40 mm) per abbassare il blastoderm.
- Fare una piccola apertura nell'uovo utilizzando forbici bene e aggiungere 1 mL di soluzione di Locke (vedere i Materiali supplementari per la ricetta) per facilitare la rimozione delle membrane extra-embrionali.
- Iniettare 10% indiano nero inchiostro/Locke soluzione utilizzando una siringa da 1 mL con ago (0,55 x 25 mm 2) sotto il blastoderm per rendere più facile la visualizzazione degli embrioni.
- Tagliare la membrana extra-embrionale che circonda l'embrione utilizzando forbice chirurgica medica e forcipe.
- Utilizzare un mestolo forato per trasferire l'embrione di Petri contenente 20 mL di soluzione di PBS 1X di 4,5 cm.
- Distanza sezionare l'amnios e le restanti parti della membrana extra-embrionale utilizzando bene forbici e pinze sotto un microscopio stereoscopico.
- Tagliare il segmento SNT trasversa a livello brachiale dell'embrione, che si estende caudalmente nella regione toracica per isolare il SNT ( Figura 2).
- Rimuovere i tessuti che circondano lateralmente/ventralmente il SNT (ad es., placca laterale mesoderma, ectoderma, notocorda e aorta) usando il forcipe ( Figura 2).
- Immergere ogni segmento SNT pollo sezionato in una capsula di Petri contenente 5 mL di tripsina tiepida (37 ° C) (tripsina/EDTA soluzione 1: 250) di 3,5 cm.
- Interrompere il trattamento di tripsina quando allentamento dei tessuti non neurali intorno la SNT viene rilevato sotto uno stereomicroscopio.
Nota: Il tempo di trypsinization deve essere strettamente controllato per evitare il sovra-digestione e dispersione del tessuto neurale e per mantenere l'integrità strutturale della SNT. - Dopo il trattamento di tripsina, rimuovere i rimanenti tessuti mesenchimali ed ectodermici manualmente per preparare la parte pulita di SNT.
- Trasferire la sezione SNT una provetta da 1,5 mL e flash-congelamento in azoto liquido. Una volta sufficiente SNT sezioni sono accumulato (piscina la SNT sezioni da ~ 30 embrioni di pollo per una reazione di ChIP), conservare a -80 ° C.
Nota: Se sufficiente tessuto embrionale (cioè, 5 x 10 5-5 x 10 6 cellule) può essere sezionata da un singolo o pochi embrioni di pollo, poi congelamento non è necessaria ed è possibile procedere direttamente alla procedura successiva. Fare riferimento alla guida alla risoluzione dei problemi nella tabella 1.
Nota: attenzione! Azoto liquido ha una temperatura estremamente bassa, indossare una protezione appropriata.
2. Reticolazione proteine a DNA: giorno 1
Nota: eseguire tutti i passaggi su ghiaccio, salvo diversa indicazione.
- Aggiungere 500 µ l di DMEM con 10% FBS e 10 µ l di 1 M Na-butirrato direttamente al tessuto congelato o, in alternativa, immediatamente al tessuto appena dissecato. Omogeneizzare le cellule sospendendo ri-delicatamente con una pipetta da 1 mL.
Nota: L'aggiunta di Na-butirrato è facoltativo, ma consigliato se indagando acetilazione dell'istone. Invece di DMEM - 10% FBS, i campioni possono essere risospesi in 1X PBS con 0,1% BSA. L'aggiunta di FBS o BSA è facoltativo, ma esso facilita i campioni nei passaggi successivi centrifugazione di cubettatura. - 13,5 µ l di formaldeide al 37% (1% formaldeide finale) e posizionarlo in un rotatore per 15 min a temperatura ambiente.
Nota: attenzione! La formaldeide è tossica. - Aggiungere 25 µ l di 2,5 M glicina al tubo e collocarlo in un rotatore per 10 min a temperatura ambiente per placare la formaldeide.
- Spin il tubo a 850 x g per 5 min a 4 ° C in una centrifuga di tavolo. Scartare il surnatante.
- Lavare la pallina una volta con 500 µ l di fredda preparata wash buffer (Vedi i Materiali supplementari per la ricetta), centrifuga a 850 x g e a 4 ° C per 5 min e scartare il surnatante.
3. Lisi e sonicazione
- lisi completa preparazione buffer (LB) (vedere i Materiali supplementari per la ricetta) e chill sul ghiaccio. Per 1 mL, utilizzare 950 µ l di LB, 40 µ l di concentrato dell'inibitore della proteasi (25x) e 10 µ l di 100% PMSF.
- Risospendere il pellet in 300 µ l di LB completo pipettando e posto su una piattaforma a dondolo per 10 min a 4 ° C.
- Trattare con ultrasuoni i campioni utilizzando le seguenti impostazioni: Temp = 4 ° C, tempo totale = 7 minuti, “ il ” intervallo = 30 s, “ i ” intervallo = 30 s, ampiezza = 25%
Nota: Condizioni di sonicazione devono essere ottimizzate per ogni tessuto e variano a seconda il sonicatore utilizzato. Si raccomanda di utilizzare le impostazioni di sonicazione più basse che si traducono in DNA tranciato da 200 a 600 bp in dimensione. Tosatura varia notevolmente a seconda del tipo di tessuto, quantiTy, volume di sonicazione, condizioni di reticolazione e attrezzature. Fare riferimento alla guida alla risoluzione dei problemi nella tabella 1. - Spin il campione lisati mediante a 16.000 x g per 10 min a 4 ° C per appallottolare i detriti cellulari.
- Trasferire il lisato (surnatante) in una nuova provetta da 1,5 mL.
Nota: Se il materiale di partenza è considerato sufficiente per due esperimenti di ChIP, quindi 300 µ l di LB completo può essere aggiunto per la cromatina lisati mediante (cioè, volume finale: 600 µ l). - Aggiungere 30 µ l di 10% Ottilfenolo etossilato per ogni 300 µ l di sonicato lisato (concentrazione finale: 1%) e Miscelare pipettando.
Nota: attenzione! Ottilfenolo etossilato è una tossicità acuta (orale, cutanea, per inalazione).
4. Incubazione dell'anticorpo
- aliquota di 330 µ l di sonicato lisato in due provette da 1,5 mL: 300 µ l per ChIP e 30 µ l come il controllo di input (10% del materiale di partenza). Archivio la " 30 µ l di campione di controllo di input " a -20 ° C.
Nota: Se due reazioni di ChIP vengono eseguite dallo stesso campione, allora il 660 µ l di sonicato lisato può essere distribuite in tre provette da 1,5 mL (300 µ l per ChIP n. 1, 300 µ l per ChIP #2 e 60 µ l come controllo di input (20% del materiale di partenza di ogni ChIP) ). - Aggiungere 3-5 µ g di anticorpo per il 300 µ l di lisati mediante cromatina aliquota e Inverti per mescolare.
Nota: In questo studio, ogni reazione di ChIP è stato effettuato con un anticorpo specifico per tri dell'istone H3 metilato al K4 (H3K4me3), di istone H3 metilato al K4 (H3K4me2), tri dell'istone H3 metilato presso K27 (H3K27me3) e l'acetilazione dell'istone H3 tri presso K27 (H3K27me3). Il successo di questo protocollo è interamente dipendente dalla qualità dell'anticorpo utilizzato. L'anticorpo deve essere specifico ed efficiente presso l'immunoprecipitazione di una proteina specifica. È importante determinare la quantità di anticorpo che può essere utilizzato a immunoprecipitate il reticolato della proteina-DNA complesso. Inoltre, la specificità dell'anticorpo può essere controllata mediante Western blot per garantire che rileva una proteina corretta. Un anticorpo che rileva più bande non specifici non è raccomandato per ChIP. - Inserire il tubo su una piattaforma a dondolo a 4 ° C durante la notte (12-16 h) per legare l'anticorpo per la cromatina.
Nota: Fare riferimento alla guida alla risoluzione dei problemi nella tabella 1.
5. Preparazione di biglie magnetiche: giorno 2
- Aliquot 50 - 100 µ l di proteina G/magnetico liquami perlina per ciascuna reazione di ChIP in un microfuge 1,5 mL tube sul ghiaccio.
- Lavare i branelli magnetici tre volte con soluzione fredda blocco (vedere i Materiali supplementari per la ricetta) (4 ° C). Aggiungere 500 µ l di soluzione di blocco freddo e mescolare capovolgendo o sfogliando. Mettere il tubo in un supporto magnetico e attendere che le perline per stabilirsi sul lato del tubo. Versare il liquido chiaro e ripetere. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere tutto il liquido con una punta di gel-caricamento.
6. Immunoprecipitazione della cromatina
- aggiungere il 300 µ l di cromatina legata all'anticorpo ai talloni lavati e invertire per mescolare.
- Ruotare verticalmente in un rotatore tubo a 4 ° C per almeno 4 h per legare l'anticorpo ai talloni.
7. Lavare, eluire e invertire le reticolazioni
- Chill RIPA tampone di lavaggio (Vedi i Materiali supplementari per la ricetta) sul ghiaccio, impostare il bagno di acqua a 65 ° C e preraffreddare la centrifuga a 4 ° C.
- Lavare le perle di cromatina associato quattro volte in 1 mL di tampone di lavaggio freddo RIPA e tenere sul ghiaccio. A tale scopo, aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio di RIPA freddo e mescolare capovolgendo o sfogliando. Inserire il tubo nel supporto magnetico e attendere che le perline per stabilirsi sul lato del tubo. Versare il liquido chiaro e ripetere.
Nota: Il numero di lavaggi con tampone di lavaggio di RIPA potrebbe essere necessario essere ottimizzato a seconda del tipo di campione, campione abbondanza e anticorpo utilizzato. Un aumento del numero di lavaggi sarà diminuire lo sfondo ma sarà anche diminuire la quantità totale di DNA recuperato, che può compromettere l'analisi a valle di qPCR o ChIP-seq. - Aggiungere 1 mL di TE/50 mM NaCl al tubo e trasferire le perline di cromatina associato a TE/50 mM NaCl in una provetta di fresco 1,5 mL microfuge prima di rimuovere il liquido utilizzando il supporto magnetico, come descritto in precedenza.
- Spin le perline a 900 x g per 3 min a 4 ° C, inserire nuovamente il tubo del supporto magnetico e rimuovere tutte le restanti TE con una punta di gel-caricamento.
- Aggiungere 210 µ l di tampone di eluizione (vedere i Materiali supplementari per la ricetta) a temperatura ambiente e risospendere scorrendo.
- Elute per 15 min a 65 ° C in un blocco di calore mentre agitando.
- Spin le perline a 16.000 x g per 1 min a temperatura ambiente e inserire il tubo nel supporto magnetico.
- Trasferire il surnatante (~ 200 µ l) in una provetta di microfuge fresco una volta che si sono insediati i branelli.
- Scongelare i campioni di controllo di input (30 µ l) da-20 ° C a temperatura ambiente (congelato al punto 4.1), aggiungere 3 volumi di tampone di eluizione (90 µ l) e mescolare brevemente nel Vortex.
- Incubare i campioni chip e controllo a 65 ° C durante la notte (12-16 h) per invertire le reticolazioni.
8. RNA e proteina cellulare digest: giorno 3
- 8.1At temperatura ambiente, aggiungere 1 volume di buffer di TE per tubo (per diluire la SDS) e capovolgere per mescolare: aggiungere 120 µ l di TE a 120 µ l di campione di controllo e 200 µ l di TE a 200 µ l del campione ChIP.
- Aggiungere RNasi A una concentrazione finale di 0,2 mg/mL e Inverti per mescolare: µ l 2,4 di 20 mg/mL RNasi A 240 µ l di campione di controllo e 4 µ l di 20 mg/mL RNasi A 400 µ l del campione ChIP.
- Incubare le provette a 37 ° C in un bagno d'acqua per 2 h digerire il RNA.
- Aggiungere proteinasi K a una concentrazione finale di 0,2 mg/mL e Inverti per mescolare: aggiungere 2,4 µ l di proteinasi K 20 mg/mL a 240 µ l di campione di controllo e 4 µ l di proteinasi K 20 mg/mL a 400 µ l del campione ChIP.
- Incubare a 55 ° C a bagnomaria per 2 h per digerire le proteine e purificare il DNA.
9. ChIP-qPCR
Nota: eseguire DNA estrazione e purificazione, come descritto nei Materiali integrativi.
Nota: verificare l'efficienza di sonicazione come descritto nei Materiali supplementari, per confermare che i frammenti di DNA di 200-500 bp sono ottenuti ( Figura 3).
Nota: un passo fondamentale è quello di determinare se il ChIP è effettivamente lavorate. Se ci sono noti siti di genomica legame per la proteina di interesse, gli iniettori possono essere progettati per PCR quantitativa (qPCR) per determinare se i siti noti sono specificamente arricchiti nel DNA ChIP, rispetto alle regioni di controllo negativo non dovute essere vincolato il candiproteine di data. Ad esempio, questo lavoro Mostra i risultati di ChIP-qPCR ottenuti con chip eseguita per H3K4me3 (contrassegno dell'istone attivo promotore) e H3K27me3 (contrassegno dell'istone promotore inattivo) nelle sezioni SNT isolati da embrioni di pulcino HH14 ( Figura 4A ).
- Mescolare ogni coppia di primer (avanti e indietro) nello stesso tubo e preparare una concentrazione stock a 20 µM a ogni utilizzo dH 2 O (tabella 2).
Nota: l'efficienza di ogni coppia di primer deve essere valutato prima analisi ChIP-qPCR. - Utilizzare il controllo di input ChIP e il 20% del DNA ottenuto nel passaggio 8,5 per ottimizzazione qPCR.
Nota: Il DNA è in genere l'input diluito 20x (all'1% del materiale di partenza utilizzato nelle reazioni ChIP) per analisi qPCR. - Per ogni 10 µ l di PCR, miscelare i componenti seguenti in una provetta PCR: per DNA mastermix, aggiungere 2 µ l di dH2O, 2,5 µ l di miscela SYBR green e 1 µ l di DNA (da 1% ingresso o ChIP); per mastermix con primer , aggiungere 2,375 µ l di dH2O, 2,5 µ l di miscela SYBR green e 0.125 µ l di miscela primer forward e reverse.
- Mescolare i campioni nel Vortex per 2 s e brevemente centrifuga a 900 x g per 1 min.
- Eseguire PCR in tempo reale (un esempio di primers e ciclismo condizioni usate qui può essere trovato nella tabella 2 e tabella 3, rispettivamente).
Nota: Analisi dei dati ChIP-qPCR: segnali di ChIP sono calcolati come percentuale dell'input. Brevemente, una volta per ogni reazione qPCR, un fattore di diluizione di 100 o 6.644 cicli vengono ottenuti i valori Ct (log2 100) viene applicato per i valori di Ct ottenuti per le reazioni di DNA inpue. Quindi, per una data regione di interesse (cioè, coppia di primer), i segnali di ChIP sono calcolati come segue:
regolato ingresso = Ct (Input) - 6.644
segnale di ChIP = 100 x POWER(2;average of adjusted Input-Ct value ChIP sample)
10. chIP-seq libreria preparazione; Riparazione di fine: Giorno 4
- diluire fino a 100 ng di DNA-ChIP in 60 µ l di tampone di eluizione (Vedi materiali tavolo).
- Add 40 μL di fine mix di riparazione e pipettare delicatamente 10 volte.
- Incubare a 30 ° C per 30 min in un termociclatore.
- Vortice magnetico perline ed aggiungere 160 µ l nella provetta contenente il mix di riparazione di fine. Mescolare accuratamente pipettando 10 volte. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Posizionare il tubo nel supporto magnetico e attendere per le perline a stabilirsi sul lato del tubo...
- Versare il liquido chiaro.
- , Mantenendo il tubo su supporto magnetico, aggiungere 200 μL di preparati 80% EtOH.
- Incubare a temperatura ambiente per 30 s e scartare il surnatante. Ripetere una volta...
- Tenere il tubo per 15 min sul supporto magnetico a temperatura ambiente. Una volta che la pallina è asciutta, rimuovere il tubo dal supporto magnetico.
- Risospendere il pellet in 20 μL di tampone di risospensione. Pipettare delicatamente 10 volte per mescolare.
- Incubare per 2 min a temperatura ambiente.
- Inserire il tubo nel supporto magnetico e attendere che le perline per stabilirsi sul lato del tubo. Trasferire 17,5 μL del surnatante in una nuova provetta.
11. ChIP-seq libreria preparazione; 3 dell'adenilato ' finisce
- aggiungere 12.5 μL di miscela di A-tailing al nuovo tubo e mescolare accuratamente pipettando delicatamente su e giù per 10 volte. Collocare la provetta su un termociclatore e incubare secondo il seguente programma: 37 ° C per 30 min, 70 ° C per 5 min e permanenza a 4 ° C
12. ChIP-seq libreria preparazione; Lega i adattatori
- aggiungere 2,5 µ l di risospensione buffer, 2,5 µ l di miscela di legatura e 2,5 μL dell'indice di adattatore appropriato di RNA. Mix accuratamente pipettando delicatamente su e giù per 10 volte.
- Incubare su un termociclatore per 10 min a 30 °.
- Aggiungere 5 μL di buffer di legatura di fermata e mescolare accuratamente pipettando 10 volte.
- Vortice magnetico perline e aggiungere 42,5 μL di campione. Mescolare accuratamente pipettando 10 volte. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Inserire il tubo nel supporto magnetico e attendere per le perline per stabilirsi sul lato del tubo e versare il liquido chiaro
- , Mantenendo il tubo su supporto magnetico, aggiungere 200 μL di preparati 80% EtOH.
- Incubare a temperatura ambiente per 30 s e scartare il surnatante. Ripetere un' volta.
- Tenere il tubo sul supporto magnetico e, lasciate che il campione asciugare all'aria per 15 min.
- Rimuovere il tubo dal supporto magnetico e risospendere il pellet in 52,5 μL di tampone di risospensione. Mescolare accuratamente pipettando 10 volte. Incubare a temperatura ambiente per 2 min, inserire il tubo nel supporto magnetico e attendere per le perline per stabilirsi sul lato del tubo. Trasferire 50 μL del surnatante chiaro ad un nuovo tubo.
- Vortice magnetico perline e aggiungere 50 µ l di campione. Mescolare accuratamente pipettando 10 volte. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Inserire il tubo nel supporto magnetico e attendere che le perline per stabilirsi sul lato del tubo e versare il liquido chiaro.
- , Mantenendo il tubo su supporto magnetico, aggiungere 200 μL di preparati 80% EtOH.
- Incubare a temperatura ambiente per 30 s e scartare il surnatante. Ripetere un' volta.
- Tenere il tubo su supporto magnetico e, lasciare che l'aria di campione a secco per 15 min.
- Rimuovere il tubo dal supporto magnetico e risospendere il pellet in 27,5 μL di tampone di risospensione. Mix accuratamente pipettando 10 volte.
- Incubare a temperatura ambiente per 2 minuti, inserire il tubo nel supporto magnetico e attendere che le perline per stabilirsi sul lato del tubo. Trasferire 25 μL del surnatante chiaro ad un nuovo tubo.
13. ChIP-seq libreria preparazione; Amplificazione dei frammenti del DNA
- posto 12,5 µ l del modello in un 0,2 mL PCR tubo. Aggiungere 2,5 µ l di primer PCR cocktail, 10 μL di avanzata PCR mix. Mix accuratamente pipettando su e giù per 10 volte. Collocare la provetta su un termociclatore e utilizzare le condizioni designate nella tabella 4.
- Vortice magnetico perline e aggiungere 25 µ l di campione. Mescolare accuratamente pipettando 10 volte. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Inserire il tubo nel supporto magnetico, attendere che le perline per stabilirsi sul lato del tubo e versare il liquido chiaro.
- , Mantenendo il tubo su supporto magnetico, aggiungere 200 μL di preparati 80% EtOH. Incubare a temperatura ambiente per 30 s e scartare il surnatante. Ripetere un' volta.
- Tenere il tubo sul supporto magnetico e, lasciate che il campione aria asciugare per 15 minuti rimuovere il tubo dal supporto magnetico e risospendere il pellet in 32,5 μL di tampone di risospensione. Mix accuratamente pipettando 10 volte.
- Incubare la PCR tubo/piastra per 2 min a temperatura ambiente. Posizionare il tubo/piastra PCR sul cavalletto magnetica a temperatura ambiente, attendere che le perline per stabilirsi sul lato del tubo e trasferire 30 μL del surnatante in una nuova provetta.
14. ChIP-seq libreria preparazione; Convalida di biblioteca
Nota: la convalida della libreria viene eseguita utilizzando un sistema di controllo di qualità di DNA e RNA. Preparazione della scaletta: aliquota 1 µ l di genomic DNA Ladder nel primo tubo/bene e aggiungere 3 µ l di sample buffer.
- Preparazione del campione: mescolare 1 µ l di campione biblioteca (10-100 ng / µ l) con 3 µ l di tampone del campione in una provetta. Lo spin down e poi vortice su velocità massima per 5 s. Spin giù per collocare l'esempio nella parte inferiore del tubo.
- Caricare i campioni nel sistema di controllo di qualità.
- Una volta che viene completata, l'esecuzione analizzare i risultati impostando il contrasto al valore massimo per assicurarsi che nessun dimeri sono presenti nel campione ( Figura 5); dimeri dell'iniettore dovrebbe corrispondere a una band intorno 135 bp. Se anche una debole banda è presente, procedere ad una seconda pulitura con l'aggiunta di tampone di eluizione (Vedi Materiali tavolo) fino a un volume di 50 µ l e µ l 47,5 dei branelli magnetici misti. Se la concentrazione del campione è troppo bassa (< 2 nM), procedere per eseguire la PCR (passo 13.1), utilizzando 18 cicli invece di 15, con il volume di 12.5-µ l di campione lasciato dal passaggio 12,16.
- Quantificare singolarmente le librerie di qPCR usando i kit disponibili in commercio.
Nota: Piscine di librerie possono essere sequenziate utilizzando un sequencer con una singolo-lettura del protocollo nt 1 x 50 mirando alle letture/campione di 30 M.
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Representative Results
Per illustrare le prestazioni del nostro protocollo di ChIP, abbiamo effettuato esperimenti utilizzando pool SNT sezioni da embrioni di pollo HH19, protuberanze maxillary della HH22 pollo embrioni ed embrioni di pollo di fase-HH3 per indagare i profili di associazione di ChIP-seq varie modifiche dell'istone (cioè, H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 e H3K27me3). Una volta che sono stati ottenuti ChIP "DNAS", l'efficienza di sonicazione è stata valutata tramite l'elettroforesi del gel dell'agarosi del DNAs ingresso corrispondente (Figura 3). Quindi, il ChIP e il DNAs input sono stati utilizzati per l'analisi di ChIP-qPCR per misurare gli arricchimenti a loci dovuti essere essere associato o non associato tramite le modifiche dell'istone indagate (Figura 4A). Nell'esempio riportato in Figura 4A, H3K27me3 e H3K4me3 arricchimento livelli nelle sezioni HH19 SNT sono stati valutati da ChIP-qPCR attorno alle regioni promotore di SOX17 e SOX2, due geni che sono inattivo e attivo in SNT, rispettivamente. Come previsto, il promotore di SOX2 è stato fortemente segnato da H3K4me3 ma non da H3K27me3, mentre il promotore di SOX17 ha mostrato il modello opposto (Figura 4A). Valutando alcuni loci, è possibile stimare la qualità del ChIP senza perdere molto materiale di DNA per analisi di ChIP-seq a valle. Una volta che è stata confermata la qualità dei chip, ChIP-seq librerie sono state preparate e sequenziate. Rappresentante loci sono indicati per ogni dei tessuti embrionali pollo indagato: (i) profili per H3K27me3 e H3K4me3 negli embrioni di pulcino SNT di HH19 intorno PAX7 (Figura 4B); (ii) i profili per H3K4me2 e H3K27ac nelle protuberanze maxillary di embrioni di pollo HH22 intorno a SNAI1 (Figura 4); e (iii) il profilo per H3K27me3 in embrioni di pollo HH3-fase intorno il locus TBX3/TBX5 (Figura 4). Questi esperimenti di ChIP-seq illustrano chiaramente che il nostro protocollo di ChIP può essere utilizzato per generare profili epigenomic da limitate quantità di materiale biologico in una vasta gamma di tessuti embrionali.
Figura 1: Panoramica schematica del protocollo del ChIP per campioni embrionali di basso-abbondanza isolato da embrioni di pollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: breve panoramica del protocollo Microdissection SNT. Il segmento SNT trasversa è tagliato a livello brachiale di un embrione di pollo HH19. Dopo il trattamento di tripsina, il tessuto non neurali è rimosso meccanicamente con il forcipe. Non, notocorda; SNT, tubo neurale spinale; e così, somite. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: esempio di ottimale sonicazione. Un campione di pollo HH19 SNT è stato sonicato per 11 cicli, con 30 s ON e 45 s OFF impulsi ad ampiezza "alta" utilizzando un sonicatore. I legami incrociati sono stati invertiti e il DNA purificato è stato risolto su un gel di agarosio al 1.5%. La dimensione del frammento ottimale è osservata dopo 11 cicli, che vanno da 200-500 BP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: rappresentante esempi di analisi di ChIP ChIP-qPCR o ChIP-seq. H3K27me3 (A) (a sinistra) e H3K4me3 (a destra) livelli alle regioni indicati sono stati misurati dall'analisi di ChIP-qPCR eseguita utilizzando sezioni SNT isolati da embrioni di pulcino HH19. Regione del promotore di SOX2 è attiva nella SNT e così è contrassegnata da H3K4me3 ma non da H3K27me3; regione del promotore di SOX17 è inattiva durante la SNT e pertanto si arricchisce in H3K27me3 ma non in H3K4me3; Chr6 Neg rappresenta una regione intergenica nel cromosoma di pollo 6 e serve come controllo negativo. Barre di errore rappresentano la deviazione standard da tre replicati tecnici. (B) ChIP-seq (H3K27me3 a magenta, H3K4me3 in blu e ingresso in rosso) profili dagli embrioni di pulcino SNTs di HH14 sono mostrati intorno il locus PAX7. (C) ChIP-seq (H3K4me2 in arancione, H3K27ac in verde e ingresso in rosso) profili dalle protuberanze maxillary di embrioni di pulcino HH22 sono mostrati intorno il locus SNAI1. (D) ChIP-seq profili (H3K27me3 in magenta) e ingresso in rosso da embrioni di pulcino HH3 sono mostrati intorno il locus TBX3/TBX5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: esempio di ChIP-seq libreria di convalida utilizzando il sistema di controllo di qualità di RNA automatizzato. Le stesse librerie di ChIP-seq sono state analizzate con il sistema automatizzato di controllo di qualità di RNA prima (A) e dopo la pulitura di dimero primer (B). Dimeri dell'iniettore può essere visto come una debole banda di bp ~ 135 in (A). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Passaggi | Problema | Motivo possibile | Soluzione |
| 1,2,3,4 5 e 11 | Segnale basso ChIP per i rapporti di rumore secondo ChIP-qPCR e/o ChIP-seq | Compromessa la qualità del tessuto. | Eseguire micro-dissezioni in condizioni di freddo; in caso contrario potrebbe essere compromessa l'integrità della cromatina. |
| Perdita del campione dopo la centrifugazione dei campioni di reticolato. | Usare mezzo DMEM con 10-20% siero o centrifugazione ripetere e aumentare il tempo a 10 min. | ||
| Cross-linking durata. | Ottimizzare i tempi di reticolazione. Tempi di reticolazione aumentata possono facilitare l'individuazione di alcune proteine, come co-attivatori e co-repressori che non legano direttamente al DNA. | ||
| Perdita di campione a causa di diversi lavaggi in PBS. | Ridurre il numero di lavaggi; passaggi di centrifugazione possono essere ripetute a 1.500 x g. | ||
| Sonicazione suboptimale conseguente dimensioni del DNA sia troppo lungo o troppo corte. | Eseguire un esperimento di corso di tempo per ottimizzare le condizioni di sonicazione. Dimensioni ottimali frammento che vanno da 200 a 500 bp | ||
| Anticorpo non adatto per ChIP. | Utilizzare un diverso anticorpo contro la proteina endogena o un anticorpo contro un tag aggiunto a un esogenicamente espresse proteine (es. bandiera, HA). | ||
| 12 | Basso o nessun segnale in qPCR, anche per l'ingresso del DNA | Iniettori non ottimali | Controllare l'efficienza di primer e specificità; progettazione nuovi primer. |
| Insufficiente quantità di DNA | Non abbastanza materiale di partenza. Aumentare la quantità di DNA utilizzato per qPCR reazione. |
| Primer | Sequenza |
| SOX2-F | CCTTGCTGGGAGTACGACAT |
| SOX2-R | GCCCTGCAGTACAACTCCAT |
| SOX17-F | CCCTGAACTGTCATGTGTGG |
| SOX17-R | CAAACAGTTGCCTTTGAGCA |
| Chr6-neg-F | CCGTCAATCTCTGCTTGTGA |
| Chr6-neg-R | TGGAATCTGCTTGTCACTGC |
Tabella 2: Sequenze Primer per ChIP-qPCR.
| Preincubazione | ||
| Temperatura | Tempo | |
| 95 ° C | 5 min | |
| Amplificazione | ||
| Temperatura | Tempo | |
| 95 ° C | 10 s | |
| 60 ° C | 10 s | 45 |
| 72 ° C | 10 s | Cicli |
| Curva di melting | ||
| Temperatura | Tempo | |
| 95 ° C | 5 s | |
| 65 ° C | 1 min | |
| Di raffreddamento | ||
| 40 ° C | 30 s | |
Tabella 3: Condizioni di PCR per ChIP-qPCR.
| Denaturazione iniziale | ||
| Temperatura | Tempo | |
| 95 ° C | 3 min | |
| Amplificazione | ||
| Temperatura | Tempo | |
| 98 ° C | 20 s | |
| 60 ° C | 15 s | 15 |
| 72 ° C | 30 s | Cicli |
| Estensione finale | ||
| Temperatura | Tempo | |
| 72 ° C | 5 s | |
| Di raffreddamento | ||
| 4 ° C | tenere premuto | |
Tabella 4: Condizioni di PCR per l'amplificazione dei frammenti del DNA durante la preparazione della biblioteca di ChIP-seq.
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Discussion
Epigenomic profilatura di modifica dell'istone utilizzando ChIP-seq può essere utilizzato per migliorare l'annotazione funzionale dei genomi di vertebrati in diversi contesti cellulari4,5,18. Questi profili di epigenomic possono essere utilizzati, tra le altre cose, per identificare gli elementi enhancer, per definire lo stato normativo di esaltatori di (cioè, attivo, innescato, o in bilico) e per definire regolatori di identità principali delle cellule biologiche differenti o contesti patologici (ad es., ampio H3K4me3 promotore domini e super-rinforzatori)6,7,9,10,11,19. Tuttavia, a causa della limitazione inerente l'analisi del ChIP, che in genere richiede milioni di cellule, la maggior parte delle modifiche dell'istone profili sono stati generati in vitro di linee cellulari e cell tipi che possono essere ordinati in vivo in grandi quantità 4. più di recente, sono stati descritti diversi ChIP-seq protocolli compatibili con numeri di cellulare estremamente basso, notevolmente ampliando così la gamma di tipi di cellule e tessuti in cui epigenomic profili possono, in linea di principio, essere generato13 ,14,15,16. Questi nuovi protocolli ChIP-seq si basano su metodi di preparazione specifica ad hoc biblioteca che, almeno in alcuni casi, richiedono attrezzature non standard e/o reagenti14,15,16.
Qui, descriviamo un protocollo di ChIP che funziona con basso numero di cellule intermedie (5 x 104 - 5 x 105 cellule) ottenuto in vivo da diversi tessuti embrionali10. Per aumentare la sensibilità dei nostri saggi di ChIP, abbiamo eliminato diversi passaggi normalmente utilizzati nei ChIP, come cellula sequenza e Lisi nucleare, che possono provocare una progressiva perdita di materiale prezioso. Così, dopo reticolazione, i campioni sono trattati con un tampone di lisi singolo e sono successivamente sonicati per minimizzare la perdita di campione. D'importanza, il nostro protocollo di ChIP è compatibile con analisi qPCR, consentendo in tal modo l'analisi di epigenomic di loci selezionati di interesse. Inoltre, il nostro protocollo di ChIP combinabile con metodi standard ChIP-seq libreria preparazione, essendo così potenzialmente utili alla maggior parte dei laboratori con accesso alla tecnologia di sequenziamento di nuova generazione.
ChIP e ChIP-seq protocolli possono essere utilizzati non solo per studiare i profili di associazione delle modificazioni istoniche, ma anche per scoprire i siti di legame di altri importanti regolatori trascrizionali, quali fattori di trascrizione e co-attivatori (ad es., P300 e CBP)20. In genere, patatine (e ChIP-seq) per fattori di trascrizione e co-attivatori, che non sono così abbondanti come gli istoni, richiedono considerevolmente più iniziale materiale di chip per i contrassegni dell'istone. Di conseguenza, il protocollo descritto potrebbe non necessariamente lavorare per la maggior parte dei fattori di trascrizione o co-attivatori a meno che il numero di partenza cellule è notevolmente aumentato (per esempio, 5 x 105 - 5 x 106 cellule) e/o altamente specifico e sono disponibili anticorpi efficienti. Tuttavia, con un'ulteriore ottimizzazione e i metodi di preparazione costante miglioramento di biblioteca, possiamo anticipare che ChIP-seq da limitato materiale cellulare diventerà fattibile per la maggior parte delle proteine regolatrici.
Anche se i nostri protocolli di ChIP e ChIP-seq ampiamente validati per una varietà di modificazioni istoniche e tessuti embrionali, vorremmo evidenziare alcuni passaggi critici che riteniamo essenziale per la generazione di profili di alta qualità epigenomic. In primo luogo, i campioni embrionali necessario appena essere isolato in condizioni tali da non compromettere l'integrità della cromatina. Questi includono l'effettuazione le dissezioni in condizioni di fredde o flash-congelamento campioni riuniti fino a quando non viene accumulato sufficiente materiale. Un altro punto critico è sonicazione, che deve essere accuratamente ottimizzato per eseguire chip di alta qualità. Condizioni ottimali di sonicazione variano frequentemente, a seconda del tipo di tessuto, la quantità di tessuto, o il sonicatore utilizzato. Ultimo ma non meno importante, un ChIP di successo in definitiva si basa sulla disponibilità di specifiche e ChIP compatibile con anticorpi contro le proteine di interesse.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcun interesse finanziari concorrenti per essere comunicati.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Jan Appel per la sua eccellente assistenza tecnica durante l'istituzione del presente protocollo. Lavoro in laboratorio Rada-Iglesias è supportato da CMMC intramurale finanziamenti, sovvenzioni di ricerca DFG (2547/1-1 RA, RA 2547/2-1 e TE 1007/3-1), il ricercatore avanzato UoC gruppo Grant e la concessione di CECAD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| BSA powder | Carl Roth | 3737.3 | |
| Phosphate Saline buffer (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Tris-HCL pH 8.0 | Sigma Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.2 | |
| Na-Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-24 | |
| N-lauroylsarcosine | Sigma Aldrich | 61743-25G | |
| Hepes | Applichem | A3724,0250 | |
| LiCl | Carl Roth | 3739.2 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I3021-100ml | |
| SDS | Carl Roth | 1833 | |
| Protein G/magnetic beads | Invitrogen | 1004D | |
| 37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-1L | |
| Glycine | |||
| RNase | Peqlab | 12-RA-03 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 46.35 E | |
| Na-butyrate | Sigma Aldrich | SLB2659V | |
| Proteinase inhibitor | Roche | 5892791001 | |
| SYBRgreen Mix | biozym | 617004 | |
| dH2O | Sigma Aldrich | W4502 | |
| 1 Kb ladder | Thermofisher | SM1333 | |
| Orange G | Sigma Alrich | 03756-25 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-072 | |
| Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100) | Roth | 3051.4 | |
| DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) | Gibco | 31331-028 | |
| Gel loading tips Multiflex | A.Hartenstein | GS21 | |
| qPCR Plates | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 384 well | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 1.5 mL tubes | Sarstedt | 72,706 | |
| 100 - 1,000 µL Filter tips | Sarstedt | 70,762,211 | |
| 2 - 20 µL Filter tips | Sarstedt | 70,760,213 | |
| 2 - 200 µL Filter tips | Sarstedt | 70,760,211 | |
| 0.5 - 10 µL Filter tips | Sarstedt | 701,116,210 | |
| H3K27me3 antibody | Active Motif | 39155 | |
| H3K27ac antibody | Active Motif | 39133 | |
| H3K4me3 antibody | Active Motif | 39159 | |
| H3K4me2 antibody | Active Motif | 39141 | |
| End Repair Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Paramagnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Resuspension buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| A-Tailing Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Ligation Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| RNA Adapter Indexes | Illumina | RS-122-2101 | |
| Stop Ligation Buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| PCR Primer Cocktail | Illumina | FC-121-4001 | |
| Enhanced PCR Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Genomic DNA ladder | Agilent | 5067-5582 | |
| Elution Buffer | Agilent | 19086 | |
| Sample Buffer | Agilent | 5067-5582 | |
| Library Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4835 – 07960204001 | |
| Fertile chicken white eggs | LSL Rhein Main | KN: 15968 | |
| Needle (Neoject) | A.Hartenstein | 10001 | |
| Syringe (Ecoject 10 mL) | Dispomed witt oHG | 21010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Hermle | Z 216 MK | |
| Thermoshaker | ITABIS | MKR13 | |
| Sonicator | Active Motive | EpiShear probe sonicator | |
| Sonicator | Diagenode | Bioruptor Plus | |
| Rotator | Stuart | SB3 | |
| Variable volume (5 –1,000 μL) pipettes | Eppendorf | N/A | |
| Timer | Sigma | N/A | |
| Magnetic holder | Thermo Fisher | DynaMag-2 12321D | |
| Table spinner | Heathrow Scientific | Sprout | |
| Mixer | LMS | VTX 3000L | |
| Real-Time PCR Cycler | Roche | Light Cycler; Serial Nr.5662 | |
| PCR Cycler | Applied Biosystems | Gene Amp PCR System 9700 | |
| DNA and RNA quality control system | Agilent | Agilent 4200 TapeStation System | |
| Forceps | Dumont | 5-Inox-H | |
| Perforated spoon | World precision instruments | 501997 |
References
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