Summary
Aquí, describimos una inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y el protocolo de preparación de biblioteca de ChIP-seq para generar perfiles de epigenómica global de muestras embrionarias de pollo baja abundancia.
Abstract
Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es una técnica ampliamente utilizada para el mapeo de la localización de modificación postraduccional de las histonas, variantes de las histonas, factores de transcripción o enzimas modificadores de la cromatina en un locus determinado o en una escala genoma-ancha. La combinación de ensayos de ChIP con secuenciación de próxima generación (es decir, ChIP-Seq) es un enfoque poderoso para descubrir todo el mundo redes reguladoras del gene y para mejorar la anotación funcional del genoma, especialmente de secuencias reguladoras no codificantes. Protocolos de chIP normalmente requieren grandes cantidades de material celular, así que la aplicabilidad de este método a la investigación de tipos raros de la célula o biopsias de tejido pequeño. Para hacer el ensayo de ChIP compatible con la cantidad de material biológico que se puede obtener normalmente en vivo durante la embriogénesis temprana de vertebrados, se describe aquí un protocolo simplificado de ChIP en el que el número de pasos necesarios para completar la ensayo fueron reducidas para minimizar la pérdida de muestra. Este protocolo de ChIP se ha utilizado con éxito para investigar modificaciones de las histonas diferentes en varios embrionario pollo y ratón adulto tejidos utilizando baja a un número medio de células (5 x 104 - 5 x 105 células). Lo importante, este protocolo es compatible con la tecnología ChIP-seq con métodos de preparación de la biblioteca estándar, proporcionando epigenómica global mapas en tejidos embrionarios muy relevantes.
Introduction
Modificaciones post-traduccionales de las histonas están directamente involucradas en diversos procesos dependiente de la cromatina, incluyendo transcripción, replicación y reparación de ADN1,2,3. Además, modificaciones de las histonas diferentes muestran positivos (por ejemplo, H3K4me3 y H3K27ac) o negativo (por ejemplo, H3K9me3 y H3K27me3) correlaciones con la expresión de genes y puede ser definido ampliamente como marcas de activación o represión de la histona, respectivamente2,3. En consecuencia, los mapas de modificación global de la histona, también conocidos como mapas epigenómicos, han surgido como herramientas poderosas y universales para funcionalmente anotar genomas vertebrados4,5. Por ejemplo, secuencias reguladoras distales como potenciadores pueden ser identificados basan en la presencia de firmas de cromatina específicos (por ejemplo, activos potenciadores: H3K4me1 y H3K27ac), que distinguen de las regiones del promotor proximal (por ejemplo, promotores activos: H3K4me3)6,7,8. Por otra parte, los genes con funciones reguladoras de la identidad de células grandes suelen encontrarse con dominios de cromatina amplio marcados con H3K4me3 o H3K27me3, dependiendo del estado transcripcionalmente activo o inactivo de los genes subyacentes, respectivamente9 ,10. Del mismo modo, la expresión de los genes de identidad principales de la célula parece ser controlados con frecuencia por múltiples y espacialmente agrupados potenciadores (es decir, súper potenciadores), que pueden ser identificados como amplios dominios marcados H3K27ac11.
En la actualidad, histona modificación mapas son generados usando la tecnología de ChIP-seq, que en comparación con los anteriores enfoques como ChIP-chip (ChIP juntada a microarrays) proporciona mayor resolución, menos artefactos, menos ruido, mayor cobertura y menor cuesta12. Sin embargo, la generación de los mapas epigenómicos utilizando la tecnología de ChIP-seq tiene sus limitaciones inherentes, sobre todo asociadas a la capacidad para realizar con éxito el ChIP en las muestras de interés. Protocolos de ChIP tradicionales típicamente requieren millones de células, que limitan la aplicabilidad de este método a celular in vitro de líneas o células que puede ser fácilmente aisladas en vivo (por ejemplo, las células de sangre). En los últimos años, un número de protocolos modificados de ChIP compatibles con un número bajo de células ha sido descritas13,14,15,16. Sin embargo, estos protocolos están diseñados para acoplarse con secuenciación de próxima generación (es decir, ChIP-seq), y por lo general utilizan ad hoc biblioteca preparación métodos13,14, 15 , 16.
Aquí, hemos descrito un protocolo de ChIP que puede utilizarse para investigar perfiles de modificación de histonas mediante un número bajo a intermedio de células (5 x 104 - 5 x 105 células) en cualquiera de los dos loci seleccionados (es decir, ChIP-qPCR) o global (, es decir, ChIP-seq) (figura 1). Cuando se acopla a la tecnología ChIP-seq, nuestro protocolo de ChIP puede utilizarse junto con métodos de preparación de la biblioteca estándar, por lo que es ampliamente accesible a muchos laboratorios10. Este protocolo se ha utilizado para investigar varias marcas de histona (p. ej., H3K4me3, H3K27me3 y H3K27ac) en los tejidos embrionarios de pollo diferentes (p. ej., tubo neural espinal (SNT), prominencias frontonasal y epiblasto). Sin embargo, esperamos que sea ampliamente aplicable a otros organismos en que biológicamente o clínicamente relevantes muestras pueden obtenerse solamente en cantidades bajas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
según las pautas de cuidado de los animales alemana, ninguna aprobación institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) era necesaria para llevar a cabo los experimentos de embrión de pollo. Según las directrices locales, sólo los experimentos con embriones de pollo HH44 (18 días) y mayores requieren la aprobación del IACUC. Sin embargo, los embriones utilizados en este estudio estaban en etapas tempranas del desarrollo embrionario (es decir, HH19 (72 h)).
Nota: el propósito de este protocolo es proporcionar una descripción detallada del ensayo ChIP por lo que puede ser efectivamente combinado con qPCR o secuenciación de próxima generación (es decir, ChIP-seq) para investigar modificaciones de las histonas en muestras embrionarias baja abundancia (que van desde 5 x 10 4-5 x 10 5 células para cada reacción de ChIP) y tipos de tejido diferentes ( figura 1). El Protocolo debería ser aplicable a investigar los perfiles de unión de factores de transcripción activadores Co (por ejemplo, p300). Sin embargo, debido a la menor abundancia de estas proteínas reguladoras, mayor número de células es probable que sean necesarios (5 x 10 5 - 5 x 10 6 células de cada reacción de viruta).
1. preparación de huevos y microdisección de las SNT de pollo
Nota: el procedimiento para micro-disecciones difiere técnicamente de tejido a tejido y del modelo animal al modelo animal. Esta sección describe en detalle el protocolo de disección se utiliza para obtener secciones SNT braquiales de etapa HH19 embriones de pollo como ejemplo.
- Incubar huevos de gallina fértiles leghorn blanca, obtenidas de un criador local, en una orientación horizontal a 37 ° C y 80% de humedad durante 3 días para etapa HH19 embriones de pollo.
- Determinar las etapas según la Hamburger y Hamilton pollo sistema provisional del desarrollo embrionario 17.
- Realizar micro-disecciones todos bajo condiciones de frío, de lo contrario, puede verse comprometida la integridad de la cromatina.
- Aislar los embriones HH19.
- Para hacer que los embriones sean accesibles, extraer 3 mL de albúmina utilizando una jeringa de 10 mL con una aguja (0.90 x 40 mm) para bajar el blastoderm.
- Hacer una pequeña abertura en el huevo con unas tijeras finas y añadir 1 mL de solución de Locke (véase los Materiales suplementarios para la receta) para facilitar la eliminación de las membranas extra embrionarias.
- Inyectar solución de indio negro tinta/Locke 10% utilizando una jeringa de 1 mL con una aguja (0,55 x 25 mm 2) bajo el blastoderm para facilitar la visualización de los embriones.
- Cortar la membrana extra embrionaria que rodea el embrión de uso médicos quirúrgicos tijeras finas y pinzas.
- Use una cuchara perforada para transferir el embrión a una placa de Petri con 20 mL de solución de PBS 1 x de 4,5 cm.
- a diseccionar el amnios y las partes restantes de membrana extra embrionaria mediante tijeras finas y pinzas bajo un estereomicroscopio.
- Cortar el segmento transversal de SNT a nivel braquial del embrión, que se extiende caudalmente hacia la región torácica para aislar el SNT ( figura 2).
- Eliminar los tejidos que rodean lateralmente/ventralmente el SNT (p. ej., placa lateral mesodermo, ectodermo, notocordio y aorta) con unas pinzas ( figura 2).
- Sumerja cada segmento SNT pollo disecado en un 3,5 cm plato de Petri que contiene 5 mL de tripsina caliente (37 ° C) (tripsina/EDTA solución 1: 250).
- Detener el tratamiento de la tripsina cuando el aflojamiento de los tejidos no neuronales en el SNT se detecta bajo un estereomicroscopio.
Nota: El tiempo de la tripsinización debe ser bien controlado para evitar la digestión excesiva y dispersión del tejido neural y para conservar la integridad estructural de la SNT. - Después del tratamiento de la tripsina, eliminar el tejido mesenquimal y ectodérmico restante manualmente para preparar la sección limpia de SNT.
- Transferencia de la sección SNT a un tubo de 1,5 mL y flash-freeze lo en nitrógeno líquido. Una vez suficientes secciones SNT están acumulado (piscina del SNT secciones de ~ 30 embriones de pollo para una reacción de la viruta), tienda a -80 ° C.
Nota: Si suficiente tejido embrionario (es decir, 5 x 10 5-5 x 10 6 células) puede ser disecado de un solo o unos pocos embriones de pollo, luego congelación no es necesaria y es posible proceder directamente a los siguientes pasos. Por favor, consulte la guía de solución de problemas en la tabla 1.
Nota: PRECAUCIÓN! Nitrógeno líquido tiene una temperatura extremadamente baja, use protección adecuada.
2. Reticulación de proteínas a ADN: día 1
Nota: realizar todos los pasos en el hielo a menos que se indique lo contrario.
- Añadir 500 μl de DMEM con 10% FBS y 10 μl de 1 M Na-butirato directamente a los tejidos congelados o, alternativamente, inmediatamente en el tejido recién disecado. Homogeneizar las células por volver a suspender suavemente con una pipeta de 1 mL.
Nota: La adición de butirato de Na es opcional pero se recomienda si investigando la acetilación de las histonas. En lugar de DMEM - 10% FBS, las muestras pueden se resuspendió en PBS 1 x con 0.1% de BSA. La adición de FBS o BSA es opcional, pero facilita la granulación de las muestras en los pasos de centrifugación posterior. - Añadir 13,5 μl de formaldehído al 37% (1% formaldehído final) y se coloca sobre un agitador durante 15 min a temperatura ambiente.
Nota: PRECAUCIÓN! El formaldehído es tóxico. - Añadir 25 μl de 2.5 M glicina al tubo y se coloca sobre un agitador durante 10 min a temperatura ambiente para saciar el formaldehído.
- Girar el tubo a 850 x g durante 5 min a 4 ° C en una centrífuga de mesa. Descarte el sobrenadante.
- Lavar el precipitado una vez con 500 μl de frío recién lavado tampón (véase los Materiales suplementarios para la receta), centrifugar a 850 x g y 4 ° C por 5 min y descarte el sobrenadante.
3. Lisis y sonicación
- lisis completa preparación buffer (LB) (véase los Materiales suplementarios para la receta) y relajarse en el hielo. Para 1 mL, usar 950 μl de LB, 40 μl del concentrado del inhibidor de proteasa (25 x) y 10 μl del 100% PMSF.
- Resuspender el precipitado en 300 μL de LB completa mediante pipeteo y coloque sobre una plataforma oscilante durante 10 min a 4 ° C.
- Someter a ultrasonidos las muestras con la siguiente configuración: Temp = 4 ° C, tiempo Total = 7 minutos, “ en ” intervalo = 30 s, “ de ” intervalo = 30 s, amplitud = 25%
Nota: Condiciones de sonicación deben optimizarse para cada tejido y variarán según el sonicador utilizado. Se recomienda utilizar la configuración más baja de sonicación que ADN esquilado desde 200 hasta 600 bp en tamaño. Corte varía grandemente dependiendo del tipo de tejido, quantiTy, sonicación volumen, condiciones de reticulación y equipo. Por favor, consulte la guía de solución de problemas en la tabla 1. - Centrifugado la muestra sonicada a 16.000 x g por 10 min a 4 ° C para que sedimenten los desechos celular.
- Transferir el lisado (sobrenadante) a un fresco tubo de 1,5 mL.
Nota: Si el material de partida se considera suficiente para los dos experimentos de ChIP, entonces 300 μL de LB completa pueden agregarse a la cromatina sonicación (es decir, volumen final: 600 μL). - Añadir 30 μl de 10% Octilfenol etoxilado para cada 300 μL de sonicados lisado (concentración final: 1%) y mezclar mediante pipeteo.
Nota: PRECAUCIÓN! Octilfenol etoxilado es toxicidad aguda (oral, cutánea, inhalación).
4. Incubación del anticuerpo
- alícuota el 330 μl de sonicados lisado en dos tubos de 1,5 mL: 300 μL para ChIP y 30 μL como el control de entrada (10% del material de partida). Tienda el " 30 μl de muestra de control de entrada " en -20 ° C.
Nota: Si se realizan dos reacciones del ChIP de la misma muestra, entonces el 660 μl de sonicados lisado puede distribuirse en tres tubos de 1,5 mL (300 μL, 60 μL como control de entrada (20% del material de partida de cada ChIP), ChIP #1 y 300 μL de ChIP #2 ). - Añadir 3-5 μg de anticuerpo a 300 μL de sonicación cromatina alícuota e invertir para mezclar.
Nota: En este estudio, la reacción de cada ChIP se realizó con un anticuerpo específico para la histona H3 triple metilada en el K4 (H3K4me3), histona H3 di metilado en el K4 (H3K4me2), histona H3 triple metilada en K27 (H3K27me3) y la acetilación de histonas H3 tri en K27 (H3K27me3). El éxito de este protocolo es enteramente dependiente de la calidad del anticuerpo usado. El anticuerpo debe ser específico y eficiente en la inmunoprecipitación de una proteína específica. Es importante determinar la cantidad de anticuerpo que se puede utilizar para immunoprecipitate el reticulado proteínas ADN complejo. También, se puede comprobar la especificidad de los anticuerpos por Western blot para asegurar que detecta la proteína correcta. Un anticuerpo que detecta múltiples bandas inespecíficas no se recomienda para ChIP de. - Coloque el tubo en una plataforma oscilante a 4 ° C durante la noche (12-16 h) para los anticuerpos se unen a la cromatina.
Nota: Consulte la guía de solución de problemas en la tabla 1.
5. Preparación de granos magnéticos: día 2
- alícuota 50 - 100 μl de la mezcla de grano proteína G magnético para cada reacción de ChIP en una microcentrífuga de 1.5 mL de tubo de hielo.
- Lavar las bolas magnéticas tres veces con solución fría de bloque (véase los Materiales suplementarios para la receta) (4 ° C). Añadir 500 μl de solución de bloque frío y mezclar por inversión del tubo o sacudiendo. Poner el tubo en un soporte magnético y esperar a que los granos para instalarse en el lado del tubo. Vierta el líquido claro y repita. Después del último lavado, eliminar todo el líquido con una carga de gel punta.
6. Inmunoprecipitación de la cromatina
- añadir 300 μL de anticuerpo cromatina a los granos lavados e invertir para mezclar.
- Gire verticalmente en un tubo de los rotadores a 4 ° C durante al menos 4 h para el anticuerpo se unen a los granos de.
7. Lavar, eluir y revertir las reticulaciones
- Chill RIPA el tampón de lavado (véase los Materiales suplementarios para la receta) en hielo, coloque el baño de agua a 65 ° C y preenfriar la centrifugadora a 4 ° C.
- Lavar los granos de cromatina enlazado cuatro veces en 1 mL de tampón de lavado RIPA frío y mantener en hielo. Para ello, añada 1 mL de frío RIPA Buffer de lavado y mezclar por inversión del tubo o sacudiendo. Coloque el tubo en el soporte magnético y esperar a que los granos para instalarse en el lado del tubo. Vierta el líquido claro y repita.
Nota: El número de lavados con tampón de lavado RIPA puede ser que necesite ser optimizado dependiendo del tipo de muestra, abundancia de muestra y anticuerpo se utiliza. Un aumento en el número de lavados se disminuye el fondo pero también disminuirá la cantidad total de ADN recuperado, que puedan comprometer los posterior análisis de qPCR o ChIP-SEQ - Añada 1 mL de TE/50 mM NaCl al tubo y transferir los granos de cromatina-limite en TE/50 mM NaCl a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL fresco antes de retirar el líquido utilizando el soporte magnético, como se describe arriba.
- Spin los granos a 900 x g durante 3 min a 4 ° C, coloque el tubo en el soporte magnético y quitar todo restante TE con una punta de carga gel.
- Agregar 210 μl de tampón de elución (véase los Materiales suplementarios para la receta) a temperatura ambiente y resuspender por chasquear.
- Elute durante 15 min a 65 ° C en un bloque de calor agitando.
- Spin los granos a 16.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente y coloque el tubo en el soporte magnético.
- Transferir el sobrenadante (~ 200 μL) a un tubo de microcentrífuga fresco una vez que los granos se han asentado.
- Descongelar las muestras de control de entrada (30 μL) de-20 ° C a temperatura ambiente (congelado en el paso 4.1), agregar 3 volúmenes de tampón de elución (90 μl) y mezclar por Vortex brevemente.
- Incubar las muestras control y chip a 65 ° C durante la noche (12-16 h) para invertir las reticulaciones.
8. Síntesis de proteína celular y el ARN: día 3
- 8.1At de la temperatura ambiente, agregar 1 volumen de tampón TE por el tubo (para diluir el SDS) e invertir para mezclar: Añadir 120 μl de TE y 120 μl de la muestra de control 200 μL de TE a 200 μL de la muestra de ChIP.
- Añadir Rnasa A para una concentración final de 0,2 mg/mL e invertir para mezclar: Añadir 2.4 μL de ARNasa A 20 mg/mL a 240 μl de la muestra de control y 4 μL de Rnasa A 20 mg/mL a 400 μL de la muestra de ChIP.
- Incubar los tubos a 37 ° C en un baño de agua durante 2 h a digerir el ARN.
- Añade proteinasa K a una concentración final de 0,2 mg/mL e invertir para mezclar: Añadir 2.4 μL de proteinasa K de 20 mg/mL a 240 μl de la muestra de control y 4 μL de proteinasa K 20 mg/mL a 400 μL de la muestra de ChIP.
- Incubar a 55 ° C en un baño de agua durante 2 h para digerir la proteína y purificar el ADN.
9. ChIP-qPCR
Nota: realizar la extracción de ADN y purificación, como se describe en los Materiales suplementarios.
Nota: verificar la eficiencia de la sonicación como se describe en los Materiales suplementarios, para confirmar que los fragmentos de ADN de 200-500 bp se obtienen ( figura 3).
Nota: es un paso crítico para determinar si el ChIP realmente trabajado. Si conocen sitios de genomic de la Unión para la proteína de interés, cartillas pueden diseñarse para PCR cuantitativa (qPCR) para determinar si los sitios conocidos se enriquecen específicamente en el ChIP de ADN, en comparación con las regiones de control negativo no debe regirse por el candiproteínas de la fecha. Como ejemplo, este trabajo muestra los resultados de ChIP-qPCR obtenidos con ChIPs de H3K4me3 (marca de histonas del promotor activo) y H3K27me3 (marca de histonas del promotor inactivo) en SNT secciones aisladas de embriones HH14 ( Figura 4A ).
- Cada par de la cartilla (adelante y atrás) en el mismo tubo de la mezcla y preparar una concentración stock en 20 μm cada uso dH 2 O (cuadro 2).
Nota: la eficiencia de cada par de cartilla debe ser evaluada antes de análisis de qPCR ChIP. - Utilizar el ChIP y el 20% control entrado ADN obtenido en el paso 8.5 para qPCR optimización.
Nota: La entrada suele ser ADN diluido x 20 (al 1% del material de partida utilizado en las reacciones de ChIP) para el análisis de qPCR. - Para cada 10 μl de PCR, mezcle los siguientes componentes en un tubo PCR: para ADN mastermix, añadir 2 μl de dH2O, 2.5 μl de la mezcla de verde de SYBR y 1 μl de ADN (de ChIP o entrada de 1%); para mastermix con cebadores , añadir 2.375 μl de dH2O, 2.5 μl de la mezcla de verde de SYBR y 0.125 μl de la mezcla del primer avance y retroceso.
- Mezclar las muestras con un vórtex durante 2 s y centrifugar brevemente a 900 x g durante 1 minuto
- Realizar PCR en tiempo real (un ejemplo de cebadores y condiciones ciclismo usadas aquí puede encontrarse en la tabla 2 y tabla 3, respectivamente).
Nota: Análisis de los datos ChIP qPCR: señales de ChIP se calculan como el porcentaje de la entrada. Brevemente, una vez se obtienen valores de Ct para cada reacción de qPCR, un factor de dilución de 100 ciclos 6.644 (log2 de 100) se aplica a los valores de Ct obtenidos para las reacciones de ADN entradas. Entonces, para una región determinada de interés (es decir, par de la cartilla), las señales de ChIP se calculan como sigue:
ajustado entrada = Ct (entrada) - 6.644
señal de ChIP = 100 x POWER(2;average of adjusted Input-Ct value ChIP sample)
10. preparación de la biblioteca de chIP-seq; Reparación final: Día 4
- diluir hasta 100 ng de ADN ChIP en 60 μL de tampón de elución (ver materiales de tabla).
- Agregar 40 μL de final mezcla de reparación y pipetee suavemente 10 veces.
- Incubar a 30 ° C durante 30 minutos en un termociclador.
- Vórtice magnético granos y agregue 160 μL al tubo que contiene la mezcla de reparación final. Mezclar bien mediante pipeteo 10 veces. Incubar 15 min a temperatura ambiente.
- Coloque el tubo en el soporte magnético y esperar a que los granos para instalarse en el lado del tubo...
- Verter el líquido claro.
- Manteniendo el tubo en el soporte magnético, añadir 200 μL de recién preparado 80% EtOH.
- Incubar a temperatura ambiente durante 30 s y descartar el sobrenadante. Repetir una vez...
- Mantenga el tubo por 15 min en el soporte magnético a temperatura ambiente. Una vez seco el precipitado, retire el tubo del soporte magnético.
- Resuspender el precipitado en 20 μL de buffer de resuspensión. Pipetee suavemente 10 veces para mezclar bien.
- Incubar por 2 min a temperatura ambiente.
- Coloque el tubo en el soporte magnético y esperar a que los granos para instalarse en el lado del tubo. Transferencia de 17.5 μL del sobrenadante a un tubo nuevo.
11. Preparación de la biblioteca de chIP-seq; 3 adenilato ' termina
- Agregar 12,5 μL de mezcla de relave al nuevo tubo y mezcla bien transfiriendo suavemente arriba y abajo 10 veces. Coloque el tubo en un termociclador e incubar según el siguiente programa: 37 ° C durante 30 min, 70 º C durante 5 min y mantenga a 4 º C
12. Preparación de la biblioteca de chIP-seq; Ligan adaptadores
- añadir 2.5 μL de resuspensión buffer, 2.5 μL de mezcla de ligadura y 2.5 μL del índice de adaptador apropiado de RNA. Mezcla bien transfiriendo suavemente arriba y abajo 10 veces.
- Incubar en un termociclador durante 10 min a 30 °.
- Añadir 5 μL de Tope amortizante de ligadura y mezclar cuidadosamente mediante pipeteo 10 veces. Granos
- vórtice magnético y añadir μL 42.5 a la muestra. Mezclar bien mediante pipeteo 10 veces. Incubar 15 min a temperatura ambiente.
- Coloque el tubo en el soporte magnético y esperar a que los granos se asiente en el lado del tubo y vierta el líquido claro
- Manteniendo el tubo en el soporte magnético, añadir 200 μL de recién preparado 80% EtOH.
- Incubar a temperatura ambiente durante 30 s y descartar el sobrenadante. Repetir una vez.
- Mantenga el tubo en el soporte magnético y, dejar la muestra secar al aire durante 15 minutos.
- Retire el tubo del soporte magnético y resuspender el precipitado en 52.5 μL de buffer de resuspensión. Mezclar bien mediante pipeteo 10 veces. Incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos, coloque el tubo en el soporte magnético y esperar a que los granos para instalarse en el lado del tubo. Transferir 50 μL del sobrenadante transparente a un tubo nuevo. Granos
- vórtice magnético y añadir 50 μL de la muestra. Mezclar bien mediante pipeteo 10 veces. Incubar 15 min a temperatura ambiente.
- Coloque el tubo en el soporte magnético y esperar a que los granos se asiente en el lado del tubo y vierta el líquido claro.
- Manteniendo el tubo en el soporte magnético, añadir 200 μL de recién preparado 80% EtOH.
- Incubar a temperatura ambiente durante 30 s y descartar el sobrenadante. Repetir una vez.
- Mantenga el tubo en el soporte magnético y, dejar que el aire de la muestra secar durante 15 minutos
- Retire el tubo del soporte magnético y resuspender el precipitado en 27,5 μL de buffer de resuspensión. Mezclar bien mediante pipeteo 10 veces.
- Incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos, coloque el tubo en el soporte magnético y esperar a que los granos para instalarse en el lado del tubo. Transferencia 25 μL del sobrenadante a un tubo nuevo.
13. Preparación de la biblioteca de chIP-seq; Amplificación de fragmentos de ADN
tubo- lugar 12,5 μl de la plantilla en una PCR de 0,2 mL. Agregue 2.5 μL de primer PCR cóctel, 10 μL de la mezcla PCR mayor. mezcla bien mediante pipeteo arriba y abajo 10 veces. Coloque el tubo en un termociclador y utilizar las condiciones descritas en el cuadro 4. Granos
- vórtice magnético y añadir 25 μL de la muestra. Mezclar bien mediante pipeteo 10 veces. Incubar 15 min a temperatura ambiente.
- Coloque el tubo en el soporte magnético, esperar a que los granos se asiente en el lado del tubo y vierta el líquido claro.
- Manteniendo el tubo en el soporte magnético, añadir 200 μL de recién preparado 80% EtOH. Incubar a temperatura ambiente durante 30 s y descartar el sobrenadante. Repetir una vez.
- Mantenga el tubo en el soporte magnético y, dejar que el aire de la muestra seca durante 15 minutos, retire el tubo del soporte magnético y resuspender el precipitado en 32,5 μL de buffer de resuspensión. Mezclar bien mediante pipeteo 10 veces.
- Incubar la polimerización en cadena/de la placa durante 2 min a temperatura ambiente. Lugar la polimerización en cadena/de la placa en el soporte magnético a temperatura ambiente, espere a que los granos se asiente en el lado del tubo y transferir 30 μL del sobrenadante a un tubo nuevo.
14. Preparación de la biblioteca de chIP-seq; Validación de biblioteca
Nota: la validación de la biblioteca se realiza utilizando un sistema de control de calidad de ADN y ARN. Preparación de la escalera: alícuota 1 μl de escalera de ADN genómico en el primer tubo/bien y agregar 3 μl de sample buffer.
- Preparación de la muestra: mezclar 1 μl de la muestra de la biblioteca (10-100 ng/μL) con 3 μl de tampón en un tubo. Giro y luego vórtice en velocidad máxima 5 s. vuelta hacia abajo para colocar la muestra en la parte inferior del tubo de.
- Cargar las muestras en el sistema de control de calidad.
- Una vez el plazo, analizar los resultados estableciendo el contraste en el valor máximo para asegurarse de que no están presentes en la muestra ( figura 5) dímeros de primer; dímeros de primer deben corresponder a una banda de alrededor de 135 bp. Si hay incluso una banda débil, proceder a un segundo limpiar mediante la adición de tampón de elución (ver la Tabla de materiales) hasta un volumen de 50 μl y añadir 47.5 μl de los mezclados granos magnéticos. Si la concentración de la muestra es demasiado baja (< 2 nM), proceder a ejecutar la polimerización en cadena (Paso 13.1), con los 18 ciclos en lugar de 15, con el volumen de 12,5 μl de muestra a la izquierda de paso 12.16.
- Cuantificar las bibliotecas individualmente por qPCR utilizando kits disponibles en el mercado.
Nota: Piscinas de bibliotecas pueden ser ordenados utilizando un secuenciador con una sola lectura 1 x 50 protocolo de nt con el objetivo de 30 M Lee/muestra de.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para ilustrar el funcionamiento de nuestro protocolo de viruta, se realizaron experimentos utilizando secciones SNT agrupadas de embriones de pollo de HH19, las prominencias maxilares de HH22 pollo embriones y embriones de pollo HH3 etapa para investigar los perfiles de unión de ChIP-seq varias modificaciones de las histonas (es decir, H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 y H3K27me3). Una vez que se obtuvieron ADNs de viruta, se evaluó la eficacia de la sonicación por electroforesis del gel de agarosa de los DNAs de entrada correspondientes (figura 3). Entonces, el ChIP y la entrada DNAs fueron utilizados para análisis de qPCR ChIP para medir los enriquecimientos en loci que ser atado o desatado por las modificaciones de la histona investigados (Figura 4A). En el ejemplo que se muestra en la Figura 4A, H3K27me3 y H3K4me3 enriquecimiento ChIP-qPCR evaluaron niveles en las secciones de SNT HH19 alrededor de las regiones promotoras de SOX17 y SOX2, dos genes que son inactivos y activos en el SNT, respectivamente. Como se esperaba, el promotor de SOX2 estaba fuertemente marcado por H3K4me3 pero no por H3K27me3, mientras que el promotor de SOX17 demostraron el patrón opuesto (Figura 4A). Mediante la evaluación de algunos lugares geométricos, es posible estimar la calidad del ChIP sin perder mucho material de ADN para el análisis de ChIP-seq aguas abajo. Confirmando la calidad de los ChIPs, ChIP-seq bibliotecas fueron preparadas y ordenadas. Lugares geométricos representativos se muestran para cada uno de los tejidos embrionarios de pollo investigados: () perfiles para H3K27me3 y H3K4me3 en el SNT de HH19 embriones alrededor PAX7 (Figura 4B); (ii) perfiles para H3K4me2 y H3K27ac en las prominencias maxilares de embriones de pollo de HH22 alrededor SNAI1 (figura 4); y (iii) el perfil de H3K27me3 en embriones de pollo HH3-etapa alrededor de lo locus de TBX3/TBX5 (figura 4). Estos experimentos de ChIP-seq ilustran claramente que nuestro protocolo de ChIP puede usarse para generar perfiles de epigenómica de cantidades limitadas de material biológico en una amplia gama de tejidos embrionarios.
Figura 1: Descripción esquemática del protocolo ChIP de baja abundancia de muestras embrionarias aislados de embriones de pollo de. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: breve resumen del Protocolo de microdisección SNT. El segmento transversal de SNT se corta a nivel braquial de un embrión de pollo de HH19. Después del tratamiento de la tripsina, se extirpa el tejido no neural mecánicamente con unas pinzas. No, notocordio; SNT, tubo de los nervios espinal; y así, somite. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: ejemplo de sonicación óptima. Una muestra de pollo HH19 de SNT fue sonicada de 11 ciclos, con 30 s ON y 45 s apagado de los pulsos en amplitud "alta", utilizando un sonicador. Las reticulaciones se revirtieron y el ADN purificado se resolvió en un gel de agarosa al 1.5%. El tamaño del fragmento óptima se observa después de 11 ciclos, que van desde 200-500 BP haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: ejemplos de representante de análisis ChIP por ChIP-qPCR o ChIP-SEQ (A) H3K27me3 (izquierda) y niveles (derecha) H3K4me3 en las regiones indicadas fueron medidos por ChIP-qPCR análisis realizado usando secciones SNT aisladas de embriones de pollo HH19. La región del promotor SOX2 es activa en el SNT y pues se caracteriza por H3K4me3 pero no por H3K27me3; la región del promotor SOX17 es inactiva en el SNT y por lo tanto se enriquece en H3K27me3 pero no en H3K4me3; Chr6 Neg representa una región intergénica en cromosoma 6 de pollo y sirve como control negativo. Barras de error representan la desviación estándar de tres repeticiones técnicas. (B) ChIP-seq (H3K27me3 en magenta, H3K4me3 en azul y la entrada en rojo) se muestran los perfiles de los embriones del polluelo de SNC de HH14 alrededor del locus PAX7. (C) ChIP-seq (H3K4me2 en naranja, H3K27ac en verde y la entrada en rojo) los perfiles de las prominencias maxilares de HH22 embriones aparecen alrededor del SNAI1 locus. (D) ChIP-seq (H3K27me3 en magenta) y entrada en rojo perfiles de HH3 embriones aparecen alrededor de lo locus de TBX3/TBX5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: ejemplo de ChIP-seq biblioteca de validación utilizando el sistema de control de calidad de ARN automatizado. Se analizaron las mismas bibliotecas de ChIP-seq con el sistema automatizado de control de calidad de RNA antes de (A) y después (B) limpieza de dímero de cartilla. Dímeros de primer pueden verse como una banda débil de bp de ~ 135 en (A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Pasos | Problema | Razón posible | Solución |
| 5 1,2,3,4 y 11 | Señal de ChIP de baja proporción de ruido según qPCR de ChIP o ChIP-seq | Calidad de tejido comprometida. | Realizar disecciones de micro en condiciones de frío; de lo contrario puede verse comprometida la integridad de la cromatina. |
| Pérdida de muestra después de la centrifugación de muestras de reticulado. | Utilizar medio DMEM con 10-20% suero o paso de centrifugación repetida y aumentar el tiempo a 10 minutos. | ||
| Cross-linking duración. | Optimizar el tiempo de reticulación. Veces mayor reticulación pueden facilitar la detección de ciertas proteínas, tales como co activadores y represores Co que no vinculan al ADN directamente. | ||
| Pérdida de muestra debido a múltiples lavados en PBS. | Reducir el número de lavados; pueden repetir pasos de centrifugación a 1.500 x g. | ||
| Sonicación subóptima en tamaños de ADN sea demasiado largos o demasiado cortos. | Realizar un experimento de curso de tiempo para optimizar las condiciones de sonicación. Tamaños de fragmento óptima desde 200 hasta 500 bp | ||
| Anticuerpo no es apto para ChIP. | Utilice un diverso anticuerpo contra la proteína endógena o un anticuerpo contra una etiqueta añadida a una proteínas expresado exógenamente (por ejemplo, bandera, HA). | ||
| 12 | Bajo o sin señales en qPCR, incluso para la entrada de ADN | Imprimaciones subóptimas | Revise la cartilla eficiencia y especificidad; diseño de nuevas cartillas. |
| Cantidad insuficiente de ADN | No hay suficiente material de partida. Aumentar la cantidad de ADN por reacción de qPCR. |
| Cartillas de | Secuencia de |
| SOX2-F | CCTTGCTGGGAGTACGACAT |
| SOX2-R | GCCCTGCAGTACAACTCCAT |
| SOX17-F | CCCTGAACTGTCATGTGTGG |
| SOX17-R | CAAACAGTTGCCTTTGAGCA |
| Chr6-neg-F | CCGTCAATCTCTGCTTGTGA |
| Chr6-neg-R | TGGAATCTGCTTGTCACTGC |
Tabla 2: Secuencias de cartilla para ChIP-qPCR.
| Preincubación | ||
| Temperatura | Tiempo | |
| 95 ° C | 5 min | |
| Amplificación de | ||
| Temperatura | Tiempo | |
| 95 ° C | 10 s | |
| 60 ° C | 10 s | 45 |
| 72 ° C | 10 s | Ciclos de |
| Curva de fusión | ||
| Temperatura | Tiempo | |
| 95 ° C | 5 s | |
| 65 ° C | 1 min | |
| Refrigeración | ||
| 40 ° C | 30 s | |
Tabla 3: Condiciones PCR para ChIP-qPCR.
| Desnaturalización inicial | ||
| Temperatura | Tiempo | |
| 95 ° C | 3 min | |
| Amplificación de | ||
| Temperatura | Tiempo | |
| 98 ° C | 20 s | |
| 60 ° C | 15 s | 15 |
| 72 ° C | 30 s | Ciclos de |
| Extensión final | ||
| Temperatura | Tiempo | |
| 72 ° C | 5 s | |
| Refrigeración | ||
| 4 ° C | Mantenga | |
Tabla 4: Condiciones PCR para la amplificación de fragmentos de ADN durante la preparación de la biblioteca de ChIP-seq.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Epigenómica perfiles de modificación de las histonas con ChIP-seq pueden utilizarse para mejorar la anotación funcional de genomas vertebrados en diferentes contextos celulares4,5,18. Estos perfiles epigenómica pueden utilizarse, entre otras cosas, para identificar elementos de reforzador, para definir el estado regulador de potenciadores (es decir, activo, preparado, o preparada) y definir los reguladores de identidad principales de la célula en diferentes biológicos o contextos patológicos (p. ej., amplio H3K4me3 promotor dominios y super-potenciadores)6,7,9,10,11,19. Sin embargo, debido a la limitación inherente de la prueba de la viruta, que típicamente requiere de millones de células, modificación de histonas más perfiles se han generado en líneas de célula en vitro y célula tipos que pueden ser ordenados en vivo en grandes cantidades 4. más recientemente, se han descrito varios ChIP-seq protocolos que son compatibles con un número de células extremadamente baja, ampliando considerablemente la gama de tipos de células y tejidos en que epigenómica perfiles, en principio, se pueden generaron13 ,14,15,16. Estos nuevos protocolos de ChIP-seq cada dependen de específicos ad hoc los métodos de preparación de biblioteca que, al menos en algunos casos, requieren de equipo no estándar o reactivos14,15,16.
Aquí, describimos un protocolo de ChIP que funciona con bajos números de células intermedias (5 x 104 - 5 x 105 células) obtenido en vivo de diferentes tejidos embrionarios10. Para aumentar la sensibilidad de nuestros ensayos de ChIP, hemos eliminado varios pasos normalmente durante el ChIP, como secuencial celular y lisis nuclear, que pueden resultar en una pérdida progresiva de material valioso. Así, después de la reticulación, las muestras se tratan con un tampón de lisis solo y posteriormente se sonicó para minimizar la pérdida de muestra. Lo importante, nuestro protocolo de ChIP es compatible con análisis de qPCR, permitiendo el análisis epigenómicos de loci seleccionados de interés. Además, nuestro protocolo de ChIP puede combinarse con ChIP-seq biblioteca preparación métodos estándar, siendo así potencialmente útil para la mayoría de los laboratorios con acceso a la tecnología de secuenciación de próxima generación.
ChIP y ChIP-seq protocolos pueden utilizarse no sólo para investigar los perfiles de unión de modificaciones de las histonas, pero también para descubrir los sitios de unión de otros importantes reguladores transcripcionales, como factores de transcripción activadores Co (por ejemplo, P300 y CBP)20. Por lo general, ChIPs (y ChIP-seq) para factores de transcripción y activadores de Co, que no son tan abundantes como las histonas, requieren considerablemente más materia prima que los ChIPs para las marcas de las histonas. Así, el protocolo descrito no necesariamente funcione para la mayoría de factores de transcripción o activadores co a menos que el número de a partir de las células es considerablemente mayor (por ejemplo, 5 x 105 - 5 x 106 células) o altamente específicos y anticuerpos eficaces están disponibles. Sin embargo, con la mayor optimización y los métodos de preparación de biblioteca constantemente mejorando, esperamos que ChIP-seq de material celular limitado será factible para la mayoría de las proteínas reguladora.
Aunque los protocolos de nuestro ChIP y ChIP-seq han sido ampliamente validados para una variedad de modificaciones de las histonas y los tejidos embrionarios, nos gustaría destacar algunas medidas importantes que consideramos esenciales para generar perfiles de alta calidad epigenómica. Primero, las muestras embrionarias deben ser recién aislado en condiciones que no pongan en peligro la integridad de la cromatina. Se trata de realizar disecciones bajo condiciones de frío o congelación flash agrupadas muestras hasta que se acumula suficiente material. Otro paso fundamental es la sonicación, que debe ser optimizado con precisión para realizar fichas de alta calidad. Sonicación óptimas condiciones con frecuencia varían, dependiendo del tipo de tejido, la cantidad de tejido o el sonicador se utiliza. Por último pero no menos importante, un ChIP éxito en última instancia depende de la disponibilidad del específico y ChIP compatible con anticuerpos contra las proteínas de interés.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen sus intereses financieros que compiten a ser revelada.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Jan Appel por su excelente asistencia técnica durante el establecimiento de este protocolo. Trabajo en el laboratorio de Rada-Iglesias es apoyado por CMMC intramuros financiación, becas de investigación de la DFG (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1 y TE 1007/3-1), el investigador avanzado UoC grupo Grant y la beca del CECAD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| BSA powder | Carl Roth | 3737.3 | |
| Phosphate Saline buffer (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Tris-HCL pH 8.0 | Sigma Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.2 | |
| Na-Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-24 | |
| N-lauroylsarcosine | Sigma Aldrich | 61743-25G | |
| Hepes | Applichem | A3724,0250 | |
| LiCl | Carl Roth | 3739.2 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I3021-100ml | |
| SDS | Carl Roth | 1833 | |
| Protein G/magnetic beads | Invitrogen | 1004D | |
| 37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-1L | |
| Glycine | |||
| RNase | Peqlab | 12-RA-03 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 46.35 E | |
| Na-butyrate | Sigma Aldrich | SLB2659V | |
| Proteinase inhibitor | Roche | 5892791001 | |
| SYBRgreen Mix | biozym | 617004 | |
| dH2O | Sigma Aldrich | W4502 | |
| 1 Kb ladder | Thermofisher | SM1333 | |
| Orange G | Sigma Alrich | 03756-25 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-072 | |
| Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100) | Roth | 3051.4 | |
| DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) | Gibco | 31331-028 | |
| Gel loading tips Multiflex | A.Hartenstein | GS21 | |
| qPCR Plates | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 384 well | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 1.5 mL tubes | Sarstedt | 72,706 | |
| 100 - 1,000 µL Filter tips | Sarstedt | 70,762,211 | |
| 2 - 20 µL Filter tips | Sarstedt | 70,760,213 | |
| 2 - 200 µL Filter tips | Sarstedt | 70,760,211 | |
| 0.5 - 10 µL Filter tips | Sarstedt | 701,116,210 | |
| H3K27me3 antibody | Active Motif | 39155 | |
| H3K27ac antibody | Active Motif | 39133 | |
| H3K4me3 antibody | Active Motif | 39159 | |
| H3K4me2 antibody | Active Motif | 39141 | |
| End Repair Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Paramagnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Resuspension buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| A-Tailing Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Ligation Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| RNA Adapter Indexes | Illumina | RS-122-2101 | |
| Stop Ligation Buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| PCR Primer Cocktail | Illumina | FC-121-4001 | |
| Enhanced PCR Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Genomic DNA ladder | Agilent | 5067-5582 | |
| Elution Buffer | Agilent | 19086 | |
| Sample Buffer | Agilent | 5067-5582 | |
| Library Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4835 – 07960204001 | |
| Fertile chicken white eggs | LSL Rhein Main | KN: 15968 | |
| Needle (Neoject) | A.Hartenstein | 10001 | |
| Syringe (Ecoject 10 mL) | Dispomed witt oHG | 21010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Hermle | Z 216 MK | |
| Thermoshaker | ITABIS | MKR13 | |
| Sonicator | Active Motive | EpiShear probe sonicator | |
| Sonicator | Diagenode | Bioruptor Plus | |
| Rotator | Stuart | SB3 | |
| Variable volume (5 –1,000 μL) pipettes | Eppendorf | N/A | |
| Timer | Sigma | N/A | |
| Magnetic holder | Thermo Fisher | DynaMag-2 12321D | |
| Table spinner | Heathrow Scientific | Sprout | |
| Mixer | LMS | VTX 3000L | |
| Real-Time PCR Cycler | Roche | Light Cycler; Serial Nr.5662 | |
| PCR Cycler | Applied Biosystems | Gene Amp PCR System 9700 | |
| DNA and RNA quality control system | Agilent | Agilent 4200 TapeStation System | |
| Forceps | Dumont | 5-Inox-H | |
| Perforated spoon | World precision instruments | 501997 |
References
- Jenuwein, T., Allis, C. D.
- Kouzarides, T.
- Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K.
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Benayoun, B. A., et al. H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency. Cell. 158 (3), 673-688 (2014).
- Rehimi, R., et al. Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations. Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).
- Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
- Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).
- Ho, J. W. K., et al.
- Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why? Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
- Spitz, F., Furlong, E. E. M. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
