Summary
Här beskriver vi en kromatin immunoprecipitation (ChIP) och ChIP-seq bibliotek förberedelse-protokollet att generera globala epigenetisk profiler från låg-överflöd kyckling embryonala prover.
Abstract
Kromatin immunoprecipitation (ChIP) är en allmänt använd teknik för att kartlägga lokaliseringen av post-translationally modifierade histoner, Histon varianter, transkriptionsfaktorer eller kromatin-ändra enzymer vid en viss locus eller genome-wide skala. Kombinationen av ChIP analyser med nästa generations sekvensering (dvs ChIP-Seq) är en kraftfull metod att globalt avslöja gen regleringsnät och förbättra funktionella annotering av genomen, speciellt hos icke-kodande reglerande sekvenser. ChIP protokoll kräver normalt stora mängder cellulära material, utgör således hinder tillämpligheten av denna metod att undersöka sällsynta celltyper eller små vävnadsbiopsier. För att göra ChIP analysen förenlig med mängden biologiskt material som kan vanligtvis erhållas i vivo under tidiga ryggradsdjur embryogenes, beskriver vi här en förenklad ChIP protokoll där antalet steg krävs för att slutföra den assay förminskades för att minimera prov förlust. Detta ChIP protokoll har framgångsrikt använts för att undersöka olika Histon ändringar i olika embryonala kyckling och vuxen mus vävnader med låg till medelhög cell nummer (5 x 104 - 5 x 105 celler). Allt detta protokoll är kompatibel med ChIP-seq teknik använda standardbiblioteket beredningsmetoder, vilket ger global epigenetisk kartor i högrelevant embryonala vävnader.
Introduction
Histon post-translationella modifieringar är direkt involverade i olika kromatin-beroende processer, inklusive transkription, replikering och DNA reparation1,2,3. Dessutom olika Histon ändringar visar positiva (t.ex. H3K4me3 och H3K27ac) eller negativt (t.ex. H3K9me3 och H3K27me3) korrelationer med genuttryck och kan definieras brett som aktiverande eller repressiva Histon markerar, respektive2,3. Följaktligen, globala Histon modifiering kartor, även kallad epigenetisk kartor, har dykt upp som kraftfulla och universella verktyg att funktionellt kommentera ryggradsdjur genomen4,5. Till exempel distala reglerande sekvenser såsom förstärkare kan identifieras baserat på förekomsten av specifika kromatin signaturer (t.ex. aktiv förstärkare: H3K4me1 och H3K27ac), som skilja dem från proximala arrangören regioner (t.ex. aktiva initiativtagare: H3K4me3)6,7,8. Å andra finns gener med stora cell identitet tillsynsuppdrag normalt med bred kromatin domäner markerats med H3K4me3 eller H3K27me3, beroende på de underliggande generna, transcriptionally aktiv eller inaktiv status respektive9 ,10. Likaså verkar uttrycket av stora cell identitet gener kontrolleras ofta av flera och rumsligt klustrade Smakförstärkare (dvs Super smakförstärkare), som kan identifieras som bred H3K27ac-märkta domäner11.
För närvarande, genereras Histon modifiering kartor med hjälp av ChIP-seq-teknologi, som i jämförelse med föregående metoder såsom ChIP-chip (ChIP kopplat till microarrays) ger högre upplösning, färre artefakter, mindre buller, bättre täckning och lägre kostar12. Generering av epigenetisk kartor med ChIP-seq teknik har dock dess inneboende begränsningar, främst förknippas med förmåga att framgångsrikt utföra ChIP i prover av intresse. Traditionella ChIP protokoll krävs vanligtvis miljontals celler, som begränsa tillämpligheten av denna metod till in vitro cell linjer eller celler som enkelt kan isolerade i vivo (t.ex. blodkroppar). Under de senaste åren varit ett antal modifierade ChIP protokoll kompatibel med låg cell nummer beskrivs13,14,15,16. Dock dessa protokoll är speciellt konstruerat för att kopplas med nästa generations sekvensering (dvs ChIP-seq) och de vanligtvis använder ad hoc- bibliotek förberedelse metoder13,14, 15 , 16.
Här, vi beskrivit ett ChIP-protokoll som kan användas för att undersöka Histon modifiering profiler med låg till intermediär cell nummer (5 x 104 - 5 x 105 celler) på antingen valda loci (dvs ChIP-qPCR) eller globalt (dvs. ChIP-seq) (figur 1). När kopplat till ChIP-seq teknik, kan våra ChIP-protokollet användas tillsammans med standardbiblioteket beredningsmetoder, vilket gör det i stort sett tillgängliga för många laboratorier10. Detta protokoll har använts för att undersöka flera Histon markerar (t.ex. H3K4me3, H3K27me3 och H3K27ac) i olika kyckling embryonala vävnader (t.ex. spinal neuralrörsdefekter (SNT), frontonasal protuberanser och epiblast). Vi räknar dock med att det bör vara allmänt tillämpliga för andra organismer där biologiskt och/eller kliniskt relevanta prover endast kan erhållas i små mängder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
enligt tyska djurvård riktlinjer, inga djur institutionsvård och användning kommittén (IACUC) godkännande var nödvändigt att utföra chicken embryo experimenten. Enligt lokala riktlinjer kräver endast experiment med kyckling HH44 (18 dagar) embryon och äldre IACUC godkännande. De embryon som används i denna studie var dock alla i tidigare stadier av embryonal utveckling (dvs. HH19 (72 h)).
Obs: Syftet med detta protokoll är att ge en detaljerad beskrivning av ChIP analysen så att den effektivt kan kombineras med qPCR eller nästa generations sekvensering (dvs ChIP-seq) för att undersöka Histon ändringar i låg-överflöd embryonala prover (allt från 5 x 10 4-5 x 10 5 celler för varje ChIP-reaktion) och olika vävnadstyper ( figur 1). Protokollet bör gälla att undersöka de bindande profilerna av transkriptionsfaktorer och aktivatorer (t.ex. p300). På grund av det lägsta överflödet av dessa reglerande proteiner, är dock större cell nummer kan vara obligatoriska (5 x 10 5 - 5 x 10 6 celler för varje ChIP reaktion).
1. beredning av ägg och lokalt av den kyckling SNT
Obs: förfarandet för microdissections tekniskt skiljer sig från vävnad att vävnad och från djurmodell till djurmodell. Detta avsnitt beskriver i detalj dissektion protokollet används för att erhålla brachialis SNT sektioner från scenen-HH19 kyckling embryon som exempel.
- Inkubera bördiga vit leghorn hönsägg, erhålls från en lokal uppfödare, i horisontell orientering vid 37 ° C och 80% luftfuktighet i 3 dagar för att få steg-HH19 kyckling embryon.
- Fastställa stadier enligt hamburgare och Hamilton kyckling embryonala utvecklingsmässiga iscensättning system 17.
- Utför alla microdissections under kalla förhållanden; annars kromatin integritet äventyras.
- Isolera HH19 embryon.
- För att göra embryon tillgängliga, extrahera 3 mL albumin med en 10 mL spruta med en kanyl (0,90 x 40 mm) för att sänka blastoderm.
- Gör en liten öppning i ägget med fina sax och tillsätt 1 mL av Locke lösning (se den Kompletterande material för receptet) att underlätta avlägsnande av extraembryonala hinnor.
- Injicera 10% indiska svart bläck/Locke lösning genom att använda en 1 mL spruta med nål (0.55 x 25 mm 2) under blastoderm för att underlätta visualiseringen av embryon.
- Avskurna extraembryonala membranet som omger embryot använder medicinska kirurgiska fin sax och pincett.
- Använda en perforerad sked för att överföra embryot till en 4,5 cm petriskål innehållande 20 mL 1 x PBS lösning.
- Dissekera bort amnionen och de resterande delarna av extraembryonala membran med fina sax och pincett under ett stereomikroskop.
- Skär tvärgående SNT segmentet på brachialis nivå av embryot, utvidga caudally in i bröstkorg regionen att isolera SNT ( figur 2).
- Ta bort vävnader som omger SNT (t.ex. laterala plattan mesoderm, ektoderm, ryggsträng och aorta) sido/ventralt använder tången ( figur 2).
- Fördjupa varje dissekerade kyckling SNT segment i en 3,5 cm petriskål innehållande 5 mL varm (37 ° C) trypsin (Trypsin/EDTA lösning 1: 250).
- Stoppa trypsin behandling när uppluckring av de icke-neurala vävnaderna runt SNT har upptäckts under ett stereomikroskop.
Obs: Trypsinization tiden måste styras noggrant för att undvika alltför matsmältningen och spridning av nervvävnad och behålla den strukturella integriteten av SNT. - Efter trypsin behandling, ta bort återstående mesenkymala och ektodermala vävnader manuellt för att förbereda avsnittet ren SNT.
- Överföra avsnittet SNT till ett 1,5 mL rör och flash-frysa den i flytande kväve. En gång tillräckligt SNT avsnitt är ackumulerade (pool SNT avsnitt från ~ 30 kyckling embryon för en ChIP reaktion), förvaras vid -80 ° C.
Obs: Om tillräcklig embryonal vävnad (dvs. 5 x 10 5-5 x 10 6 celler) kan vara dissekeras från en enda eller ett fåtal kyckling embryon, sedan frysning är inte nödvändigt och det är möjligt att gå direkt till nästa steg. Vänligen se felsökningsguiden i tabell 1.
Obs: varning! Flytande kväve har en extremt låg temperatur, bära lämpliga skydd.
2. Crosslinking proteiner till DNA: dag 1
Obs: utföra alla steg på is om inte annat anges.
- Tillsätt 500 µL DMEM med 10% FBS och 10 µL 1 M Na-butyrate direkt till fryst vävnad eller, alternativt, omedelbart till nybakade dissekerade vävnad. Homogenisera cellerna genom att åter avbryta försiktigt med 1 mL pipett.
Obs: Tillägg av Na-butyrate är valfritt men rekommenderas om utreda Histon acetylering. I stället för DMEM - 10% FBS, kan prover vara resuspended i 1 x PBS med 0,1% BSA. Tillägg av FBS eller BSA är valfritt, men det underlättar pelletering proverna i efterföljande centrifugering stegen. - Lägg till 13,5 µL av 37% formaldehyd (1% formaldehyd slutlig) och placera den på en rotator för 15 min i rumstemperatur.
Obs: varning! Formaldehyd är giftigt. - Lägga till 25 µL av 2,5 M glycin i röret och placera den på en rotator i 10 min i rumstemperatur att släcka formaldehyd.
- Snurra röret vid 850 x g i 5 minuter vid 4 ° C i en bordsskiva centrifug. Tag bort supernatanten.
- Tvätta pelleten en gång med 500 µL kallt nylagade wash buffert (se den Kompletterande material för receptet), centrifug på 850 x g- och 4 ° C i 5 min, och kasta bort supernatanten.
3. Lys och ultraljudsbehandling
- Förbered komplett lysis buffert (LB) (se den Kompletterande material för receptet) och chill på is. För 1 mL, Använd 950 µL av LB, 40 µL proteas hämmare koncentrat (25 x) och 10 µL av 100% PMSF.
- Återsuspendera pelleten i 300 µL av komplett LB av pipettering och placera den på en gungande plattform för 10 min vid 4 ° C.
- Sonikera prover med följande inställningar: Temp = 4 ° C, Total tid = 7 minuter, “ på ” intervall = 30 s, “ av ” intervall = 30 s, amplitud = 25%
Obs: Ultraljudsbehandling villkor behöver optimeras för varje vävnad och varierar beroende på den någon sonikator används. Det är rekommenderat att använda de lägsta ultraljudsbehandling inställningar som resulterar i klippt DNA alltifrån 200 till 600 bp i storlek. Klippning varierar kraftigt beroende på vävnadstyp, kvantitativaTy, ultraljudsbehandling volym, crosslinking villkor och utrustning. Vänligen se felsökningsguiden i tabell 1. - Snurra sonicated provet vid 16 000 x g i 10 minuter vid 4 ° C till pellet cellulära skräp.
- Överföra lysate (supernatanten) till en fräsch 1,5 mL tub.
Obs: Om utgångsmaterialet bedöms tillräckligt för två ChIP experiment, sedan 300 µL av komplett LB kan läggas till det sonicated kromatinet (dvs slutlig volym: 600 µL). - Lägga till 30 µL 10% oktylfenol ethoxylate för varje 300 µL sonicated lysate (slutlig koncentration: 1%) och blanda genom pipettering.
Obs: varning! Oktylfenol ethoxylate är akut giftiga (oral, dermal, inandning).
4. Antikropp inkubation
- alikvot 330 µL sonicated lysate i två 1,5 mL rör: 300 µL för ChIP och 30 µL som ingående kontroll (10% av utgångsmaterialet). Butiken i " 30 µL Inspelningsvolym prov " vid -20 ° C.
Obs: Om två ChIP reaktioner utförs från samma prov, då den 660 µL sonicated lysate kan distribueras i tre 1,5 mL rör (300 µL för ChIP nr 1, 300 µL för ChIP nr 2 och 60 µL som ingående kontroll (20% av utgångsmaterialet för varje ChIP) ). - Lägga till 3-5 µg av antikropp till de 300 µL av sonicated kromatin alikvotens och Invertera om du vill blanda.
Obs: I denna studie utfördes varje ChIP reaktion med en antikropp som är specifik för Histon H3 tri metylerat på K4 (H3K4me3), Histon H3 di metylerat på K4 (H3K4me2), Histon H3 tri metylerat på K27 (H3K27me3), och Histon H3 tri acetylering på K27 (H3K27me3). Framgången med detta protokoll är helt beroende av kvaliteten på den antikropp som används. Antikroppen bör vara specifika och effektiva på immunoprecipitation av ett specifikt protein. Det är viktigt att bestämma mängden av antikroppar som kan användas till immunoprecipitate tvärbunden protein-DNA complex. Antikroppens specificitet kan också kontrolleras genom Western blot att säkerställa att den upptäcker rätt protein. En antikropp som upptäcker flera ospecifik band rekommenderas inte för ChIP. - Placera röret på en gungande plattform vid 4 ° C över natten (12-16 h) att binda antikroppen till kromatinet.
Obs: Vänligen se felsökningsguiden i tabell 1.
5. Beredning av magnetiska pärlor: dag 2
- alikvotens 50 - 100 µL av Protein G/magnetiska pärla flytgödsel för varje ChIP reaktion i en 1,5 mL microfuge tube på ice.
- Tvätta de magnetiska pärlorna tre gånger med kallt block lösning (se den Kompletterande material för receptet) (4 ° C). Tillsätt 500 µL kallt block lösning och blanda av Invertera eller snärta. Placera röret i en Magnethållare och vänta på pärlor för att bosätta sig på sidan av röret. Häll av den klara vätskan och upprepa. Efter den sista tvättningen, ta bort all vätska med en gel-lastning spets.
6. Immunoprecipitation av kromatinet
- lägga till de 300 µL av antikropp-bundna kromatin i tvättad pärlorna och Invertera om du vill blanda.
- Rotera vertikalt på en tube rotator vid 4 ° C i minst 4 h att binda antikroppen till pärlorna.
7. Tvätta, eluera och vända antipyridinantikropp
- Chill RIPA tvättbuffert (se den Kompletterande material för receptet) på isen, ange vattenbadet till 65 ° C och precool centrifugen till 4 ° C.
- Tvätta kromatin-bundna pärlorna fyra gånger i 1 mL kall RIPA tvättbuffert och hålla på is. Gör så tillsätt 1 mL kall RIPA tvättbuffert och blanda genom att vända eller snärta. Placera röret i magnetiska hållaren och vänta på pärlor för att bosätta sig på sidan av röret. Häll av den klara vätskan och upprepa.
Anmärkning: Antalet tvättar med RIPA tvättbuffert kan behöva optimeras beroende av provtyp, prov överflöd och antikropp används. Ett ökat antal tvättar kommer minska bakgrunden men kommer också minska den totala mängden återvunna DNA, som kan äventyra nedströms analys av qPCR eller ChIP-följande punkter - Tillsätt 1 mL TE/50 mM NaCl till röret och överföra kromatin-bundna pärlorna i TE/50 mM NaCl till en fräsch 1,5 mL mikrofugrör innan du tar bort vätskan med hjälp av magnetiska innehavaren, enligt ovan.
- Snurra pärlorna på 900 x g under 3 minuter vid 4 ° C, placera röret tillbaka i magnetiska hållaren och ta bort alla återstående TE med en gel-lastning spets.
- Lägg till 210 µL av eluering buffert (se den Kompletterande material för receptet) vid rumstemperatur och resuspendera genom att snärta.
- Elute för 15 min vid 65 ° C i en värme-block under omskakning.
- Snurra pärlorna på 16 000 x g för 1 min i rumstemperatur och Ställ röret i Magnethållare.
- Överför supernatanten (~ 200 µL) till en färsk mikrofugrör när pärlorna har fast.
- Tina Inspelningsvolym proverna (30 µL) från-20 ° C rumstemperatur (fryst i steg 4.1), tillsätt 3 volymdelar eluering buffert (90 µL) och blanda genom kort vortexa.
- Inkubera chip och kontroll proverna vid 65 ° C över natten (12-16 h) att vända antipyridinantikropp.
8. Digest cellulära proteiner och RNA: dag 3
- 8.1At rumstemperatur, Lägg till 1 volymdel TE buffert per rör (att späda SDS) och Invertera om du vill blanda: Tillsätt 120 µL TE i 120 µL kontrollprov och 200 µL TE till 200 µL av ChIP provet.
- Lägg till RNase A till en slutlig koncentration av 0,2 mg/mL och Invertera att blanda: lägga till 2,4 µL 20 mg/ml RNase A 240 µL av kontrollprov och 4 µL 20 mg/ml RNase A till 400 µL av ChIP provet.
- Inkubera rören vid 37 ° C i ett vattenbad för 2 h att smälta RNA.
- Lägg till proteinas K till en slutlig koncentration av 0,2 mg/mL och Invertera att blanda: lägga till 2,4 µL 20 mg/ml proteinas K 240 µL av kontrollprov och 4 µL 20 mg/ml proteinas K till 400 µL av ChIP provet.
- Inkubera vid 55 ° C i ett vattenbad för 2 h att smälta protein och rena DNA.
9. ChIP-qPCR
Obs: utför DNA-extraktion och rening, som beskrivs i de Kompletterande material.
Obs: Kontrollera ultraljudsbehandling effektivitet som beskrivs i de Kompletterande material, att bekräfta att 200 - till 500-bp DNA-fragment erhålls ( figur 3).
Obs: ett viktigt steg är att bestämma om ChIP faktiskt fungerade. Om det finns kända genomisk bindningsställen för proteinet av intresse, kan primers utformas för kvantitativ PCR (qPCR) att avgöra om de kända platserna specifikt är berikad med ChIP DNA, i jämförelse med negativ-kontroll regioner förväntas inte vara bunden av candidatum proteiner. Som ett exempel, detta arbete visar ChIP-qPCR resultat av flis utförs för H3K4me3 (aktiva promotorn Histon märket) och H3K27me3 (inaktiva arrangören Histon mark) i SNT sektioner isolerade från HH14 chick embryon ( figur 4A ).
- Blanda varje primer par (framåt och bakåt) i samma rör och förbereda en lager koncentration på 20 µM varje med dH 2 O (tabell 2).
Obs: effektiviteten av varje primer par bör utvärderas innan ChIP-qPCR analys. - Använder ChIP och 20% ingående kontrollen DNA som erhölls i steg 8,5 för qPCR optimering.
Obs: Input DNA är oftast utspädd 20 x (till 1% av ett utgångsmaterial som används i ChIP reaktionerna) för qPCR analys. - För varje 10 µL av PCR, blanda följande komponenter i en PCR-röret: för DNA mastermix, tillsätt 2 µL dH2O, 2,5 µL SYBR green mix och 1 µL av DNA (från ChIP eller 1% input); för mastermix med grundfärg , lägga till 2.375 μl dH2O, 2,5 µL SYBR green mix och 0,125 µL av framåt och bakåt primer mix.
- Blanda proverna med vortexa för 2 s och kort Centrifugera vid 900 x g i 1 min.
- Utför realtids-PCR (ett exempel på primers och cykling villkor används här kan hittas i tabell 2 och tabell 3, respektive).
Obs: ChIP-qPCR dataanalys: ChIP signaler är beräknad som procent av indata. Kort, en gång Ct-värden erhålls för varje qPCR reaktion, en utspädningsfaktorn för 100 eller 6.644 cykler (log2 100) tillämpas på de Ct-värden som erhålls för de ingående DNA-reaktionerna. Sedan, för en viss region av intresse (dvs. primer par), ChIP signalerna beräknas enligt följande:
justerat input = Ct (ingång) - 6.644
ChIP signal = 100 x POWER(2;average of adjusted Input-Ct value ChIP sample)
10. chIP-seq bibliotek förberedelse; Slutet reparation: Dag 4
- späd upp till 100 ng av ChIP-DNA i 60 µL eluering buffert (se material tabell).
- Lägga till 40 μl slutet reparera mix och Pipettera försiktigt 10 gånger.
- Inkubera vid 30 ° C i 30 min på en termocykel.
- Vortex magnetiska pärlor och tillsätt 160 μl till röret som innehåller slutet reparation mix. Blanda omsorgsfullt genom pipettering 10 gånger. Inkubera i 15 min i rumstemperatur.
- Placera röret i magnetiska hållaren och vänta på pärlor för att bosätta sig på sidan av den tube...
- Häll av den klara vätskan.
- Samtidigt hålla röret på den magnetisk hållaren, tillsätt 200 μL av nylagade 80% EtOH.
- Inkubera i rumstemperatur i 30 s och Kassera supernatanten. Upprepa en gång..
- Hålla röret för 15 min på den magnetisk hållaren vid rumstemperatur. När pelleten är torr, ta bort röret från Magnethållare.
- Återsuspendera pelleten i 20 μL av resuspension buffert. Försiktigt Pipettera 10 gånger för att blanda grundligt.
- Inkubera i 2 min i rumstemperatur.
- Placera röret i magnetiska hållaren och vänta på pärlor för att bosätta sig på sidan av röret. Överföra 17,5 μL av supernatanten till en ny tub.
11. ChIP-seq bibliotek förberedelse; Hypofysadenylatecyclase 3 ' slutar
- lägga till 12,5 μl av A-tailing mix till nya röret och blanda grundligt genom att försiktigt pipettering upp och ner 10 gånger. Placera röret på en termocykel och inkubera enligt följande program: 37 ° C i 30 min, 70 ° C i 5 min och håll vid 4 ° C
12. ChIP-seq bibliotek förberedelse; Ligera adaptrar
- lägga till 2,5 μl resuspension buffert, 2,5 μl av ligering mix och 2,5 μl av lämpliga RNA adapter index. Blanda noggrant genom pipettering försiktigt upp och ner 10 gånger.
- Inkubera på en termocykel för 10 min vid 30 °.
- Tillsätt 5 μl stop ligering buffert och blanda grundligt genom pipettering 10 gånger.
- Vortex magnetiska pärlor och tillsätt 42,5 μl till provet. Blanda omsorgsfullt genom pipettering 10 gånger. Inkubera i 15 min i rumstemperatur.
- Placera röret i magnetiska hållaren och vänta på pärlor för att bosätta sig på sidan av röret och häll av den klara vätskan
- Samtidigt hålla röret på den magnetisk hållaren, tillsätt 200 μL av nylagade 80% EtOH.
- Inkubera i rumstemperatur i 30 s och Kassera supernatanten. Upprepa en gång.
- Hålla röret på Magnethållare och, låt provet lufttorka för 15 min..
- Ta bort röret från Magnethållare och återsuspendera pelleten i 52,5 μL av resuspension buffert. Blanda omsorgsfullt genom pipettering 10 gånger. Odla i rumstemperatur i 2 min, placera röret i magnetiska hållaren och vänta på pärlor för att bosätta sig på sidan av röret. Överför 50 μL av klara supernatanten till en ny tub.
- Vortex magnetiska pärlor och tillsätt 50 μl till provet. Blanda omsorgsfullt genom pipettering 10 gånger. Inkubera i 15 min i rumstemperatur.
- Placera röret i magnetiska hållaren och vänta på pärlor för att bosätta sig på sidan av röret och häll av den klara vätskan.
- Samtidigt hålla röret på den magnetisk hållaren, tillsätt 200 μL av nylagade 80% EtOH.
- Inkubera i rumstemperatur i 30 s och Kassera supernatanten. Upprepa en gång.
- Hålla röret på Magnethållare och, låt provet lufttorka för 15 min.
- Ta bort röret från Magnethållare och återsuspendera pelleten i 27,5 μL av resuspension buffert. Blanda noggrant genom pipettering 10 gånger.
- Inkubera i rumstemperatur i 2 min, placera röret i magnetiska hållaren och vänta på pärlor för att bosätta sig på sidan av röret. Överför 25 μL av klara supernatanten till en ny tub.
13. ChIP-seq bibliotek förberedelse; Amplifiering av DNA-fragment
- plats 12,5 µL av mallen i en 0,2 mL PCR-rör. Lägga till 2,5 μl av PCR-primer cocktail, 10 μL av förbättrad PCR-mix. Blanda grundligt genom pipettering upp och ner 10 gånger. Placera röret på en termocykel och de villkor som beskrivs i tabell 4.
- Vortex magnetiska pärlor och tillsätt 25 μl till provet. Blanda omsorgsfullt genom pipettering 10 gånger. Inkubera i 15 min i rumstemperatur.
- Placera röret i magnetiska hållaren, vänta på pärlor för att bosätta sig på sidan av röret och häll av den klara vätskan.
- Samtidigt hålla röret på den magnetisk hållaren, tillsätt 200 μL av nylagade 80% EtOH. Odla i rumstemperatur i 30 s och Kassera supernatanten. Upprepa en gång.
- Hålla röret på magnetisk hållare och, låt provet luften torka i 15 min. ta bort röret från Magnethållare och återsuspendera pelleten i 32,5 μL av resuspension buffert. Blanda noggrant genom pipettering 10 gånger.
- Inkubera PCR-röret/plattan i 2 min i rumstemperatur. Placera PCR-röret/plattan på den magnetisk stå i rumstemperatur, vänta på pärlor för att bosätta sig på sidan av röret och överföra 30 μL av supernatanten till en ny tub.
14. ChIP-seq bibliotek förberedelse; Bibliotek validering
Obs: validering av biblioteket utförs med hjälp av ett DNA och RNA kvalitetskontrollsystemet. Förberedelse av stege: alikvotens 1 µL genomisk DNA stege i första röret/väl och tillsätt 3 µL prov buffert.
- Provberedning: Blanda 1 µL bibliotek provet (10-100 ng/µL) med 3 µL prov buffert i en tub. Varva ner och sedan vortex på maxhastighet för 5 s. spinn ner till placera provet vid botten av röret.
- Läsa in proverna i kvalitetskontrollsystemet.
- När körningen är klar, analysera resultaten genom att ställa in kontrasten på det högsta värdet att se till att ingen primer dimerer i provet ( figur 5), primer dimerer bör överensstämma vid ett band runt 135 bp. Om även ett svagt band är närvarande, vidare till en andra sanering genom att lägga till eluering buffert (se Material tabell) upp till en 50 µL volym och tillsätt 47,5 µL av blandade magnetiska pärlor. Om koncentrationen av provet är för låg (< 2 nM), fortsätta att köra PCR (steg 13,1), med 18 cykler i stället för 15, med volymen 12,5-µL prov kvar från steg 12.16.
- Kvantifiera biblioteken individuellt av qPCR med kommersiellt tillgängliga kits.
Obs: Pooler av biblioteken kan sekvenseras med en sequencer med en singel-läsa 1 x 50 nt protokollet syftar till 30 M läsningar/sample.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att illustrera prestanda för våra ChIP protokoll, utfört vi ChIP-seq experiment med poolade SNT sektioner från HH19 kyckling embryon, maxillary protuberanser av HH22 kyckling embryon, och scenen-HH3 kyckling embryon att undersöka bindande profiler olika Histon ändringar (dvs. H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 och H3K27me3). När ChIP DNAs erhölls, utvärderades ultraljudsbehandling effektiviteten av agaros gelelektrofores av de motsvarande ingående DNAs (figur 3). Sedan användes den ChIP och ingående DNAs för ChIP-qPCR-analys för att mäta rikedomar på lokus förväntas antingen bunden eller obunden av de undersökta Histon ändringarna (figur 4A). I exemplet i figur 4A, H3K27me3 och H3K4me3 anrikning utvärderades nivåer i HH19 SNT sektioner av ChIP-qPCR runt arrangören regionerna SOX17 och SOX2, två gener som är inaktiva och aktiva i SNT respektive. Som förväntat, präglades SOX2 arrangören starkt av H3K4me3 men inte av H3K27me3, medan SOX17 arrangören visade det motsatta mönstret (figur 4A). Genom att utvärdera några loci, är det möjligt att uppskatta kvaliteten på ChIP utan att förlora mycket DNA material för nedströms ChIP-seq analys. När kvaliteten på markerna bekräftades, var ChIP-seq bibliotek beredd och sekvenserade. Representativa loci visas för var och en av de undersökta kyckling embryonala vävnaderna: (i) profiler för H3K27me3 och H3K4me3 i SNT av HH19 chick embryon runt PAX7 (figur 4B); (ii) profiler för H3K4me2 och H3K27ac i de maxillary protuberanser av HH22 kyckling embryon runt SNAI1 (figur 4 c); och (iii) profil för H3K27me3 i HH3-scenen kyckling embryon runt det TBX3/TBX5 locus (figur 4 d). Dessa ChIP-seq experiment illustrerar tydligt att våra ChIP-protokollet kan användas för att generera epigenetisk profiler från begränsade mängder av biologiskt material i ett brett spektrum av embryonala vävnader.
Figur 1: Schematisk översikt av ChIP protokoll för låg-överflöd embryonala prover isolerade från kyckling embryon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: kort översikt över protokollet SNT lokalt. Tvärgående SNT segmentet är avskuren på brachialis nivå av ett HH19 chicken embryo. Efter trypsin behandling avlägsnas icke-neural vävnad mekaniskt med pincett. Inte, ryggsträng; SNT, spinal neuralrörsdefekter; och så, somite. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: exempel på Optimal ultraljudsbehandling. En kyckling SNT HH19 provet var sonicated för 11 cykler, med 30 s ON och 45 s OFF pulser på ”hög” amplitud använder en någon sonikator. Antipyridinantikropp var ombytta och renade DNA var löst på en 1,5% agarosgel. Optimal fragment storlek observeras efter 11 cykler, alltifrån 200-500 bp. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa exempel på ChIP analys av ChIP-qPCR eller ChIP-följande punkter (A) H3K27me3 (vänster) och H3K4me3 (höger) i de angivna regionerna mättes av ChIP-qPCR-analys utförs med SNT sektioner isolerade från HH19 chick embryon. SOX2 promotor regionen är aktiv i SNT och därmed är markerade av H3K4me3 men inte av H3K27me3; SOX17 arrangören regionen är inaktiv i SNT och anrikas därför i H3K27me3 men inte i H3K4me3; Chr6 Neg representerar en intergenic region i kyckling kromosom 6 och fungerar som en negativ kontroll. Felstaplar representera standardavvikelsen från tre tekniska replikat. (B) ChIP-seq (H3K27me3 i magenta, H3K4me3 i blått och input i rött) profiler från SNTs av HH14 chick embryona visas runt det PAX7 locus. (C) ChIP-seq (H3K4me2 i orange, H3K27ac i grönt och input i rött) profiler från de maxillary protuberanser av HH22 chick embryon visas runt det SNAI1 locus. (D) ChIP-seq (H3K27me3 i magenta) och input i rött profiler från HH3 chick embryon visas runt det TBX3/TBX5 locus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: exempel på ChIP-seq bibliotek validering med hjälp av automatiserad RNA kvalitetskontrollsystemet. Samma ChIP-seq biblioteken analyserades med automatiserade RNA kvalitetskontroll systemet innan (A) och efter (B) primer dimer rensning. Primer dimerer kan ses som en svag ~ 135 bp band i (A). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Steg | Problemet | Möjlig orsak | Lösning |
| 1,2,3,4 5 och 11 | Låg ChIP signal till brus förhållande enligt ChIP-qPCR eller ChIP-seq | Vävnaden kvaliteten äventyras. | Utföra mikro-dissektioner i kyla; annars äventyras kromatin integritet. |
| Prov förlust efter centrifugering av tvärbunden prover. | Använd DMEM medium med 10-20% serum eller upprepa centrifugeringssteget och öka tiden till 10 min. | ||
| Cross-linking varaktighet. | Optimera crosslinking tiden. Ökad crosslinking gånger kan underlätta upptäckten av vissa proteiner, såsom aktivatorer och co kvinnoförtryckarna som inte binder till DNA direkt. | ||
| Prov förlust på grund av flera tvättar i PBS. | Minska antalet tvättar; centrifugering steg kan upprepas vid 1500 x g. | ||
| Suboptimal ultraljudsbehandling resulterar i antingen för lång eller för kort DNA storlekar. | Utföra en tid kursen experiment för att optimera ultraljudsbehandling villkor. Optimal fragment storlekar från 200 till 500 bp | ||
| Antikropp inte lämplig för ChIP. | Använd en annan antikropp mot kroppsegna proteinet eller en antikropp mot en tagg som tillsätts en exogent uttryckta proteiner (t.ex. flagga, HA). | ||
| 12 | Låg eller ingen signaler i qPCR, även för input DNA | Suboptimal grundfärger | Kontrollera primer effektivitet och specificitet; utforma nya primers. |
| Otillräcklig mängd DNA | Inte tillräckligt utgångsmaterial. Öka mängden DNA används per qPCR reaktion. |
| Grundfärger | Sekvens |
| SOX2-F | CCTTGCTGGGAGTACGACAT |
| SOX2-R | GCCCTGCAGTACAACTCCAT |
| SOX17-F | CCCTGAACTGTCATGTGTGG |
| SOX17-R | CAAACAGTTGCCTTTGAGCA |
| Chr6-neg-F | CCGTCAATCTCTGCTTGTGA |
| Chr6-neg-R | TGGAATCTGCTTGTCACTGC |
Tabell 2: Primer sekvenser för ChIP-qPCR.
| Preinkubation | ||
| Temperatur | Tid | |
| 95 ° C | 5 min | |
| Förstärkning | ||
| Temperatur | Tid | |
| 95 ° C | 10 s | |
| 60 ° C | 10 s | 45 |
| 72 ° C | 10 s | Cykler |
| Smältande kurva | ||
| Temperatur | Tid | |
| 95 ° C | 5 s | |
| 65 ° C | 1 min | |
| Kylning | ||
| 40 ° C | 30 s | |
Tabell 3: PCR villkor för ChIP-qPCR.
| Inledande denaturering | ||
| Temperatur | Tid | |
| 95 ° C | 3 min | |
| Förstärkning | ||
| Temperatur | Tid | |
| 98 ° C | 20 s | |
| 60 ° C | 15 s | 15 |
| 72 ° C | 30 s | Cykler |
| Slutliga förlängning | ||
| Temperatur | Tid | |
| 72 ° C | 5 s | |
| Kylning | ||
| 4 ° C | Håll | |
Tabell 4: PCR villkor för amplifiering av DNA-fragment under ChIP-seq bibliotek beredning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Epigenetisk profilering av Histon modifiering med ChIP-seq kan användas för att förbättra funktionella annotering av vertebrate genomen i olika cellulära sammanhang4,5,18. Dessa epigenetisk profiler kan användas, bland annat för att identifiera enhancer element, att definiera den reglerande delstaten Smakförstärkare (dvs, aktiv, grundmålade eller redo), och att definiera stora cell identitet tillsynsmyndigheter i olika biologiska eller patologiska sammanhang (t.ex. breda H3K4me3 promotorn domäner och super-förstärkare)6,7,9,10,11,19. Dock på grund av inneboende begränsning av ChIP analysen, som vanligtvis kräver miljontals celler, sorteras de flesta Histon modifiering profiler har genererats i in vitro- cellinjer och cell typer som kan i vivo i stora mängder 4. nyligen flera ChIP-seq protokoll har beskrivits som är kompatibla med extremt låg cell nummer, alltså dramatiskt växande utbudet av celltyper och vävnader i som epigenetisk profiler i princip kan genereras13 ,14,15,16. Dessa nya ChIP-seq protokoll varje är beroende av särskilda ad hoc- bibliotek beredningsmetoder som, åtminstone i vissa fall kräver icke-standardiserad utrustning eller reagenser14,15,16.
Här beskriver vi ett ChIP-protokoll som fungerar med låg till intermediär cell nummer (5 x 104 - 5 x 105 celler) erhålls i vivo från olika embryonala vävnader10. För att öka känsligheten för våra ChIP analyser, har vi eliminerat flera steg som normalt används under ChIP, såsom sekventiell cell och nukleära Lys, vilket kan resultera i en progressiv förlust av värdefulla material. Således efter crosslinking, prover behandlas med en enda lyseringsbuffert och därefter är sonicated för att minimera prov förlust. Ännu viktigare, är våra ChIP protokollet kompatibelt med qPCR analys, vilket möjliggör epigenetisk analys av valda loci av intresse. Våra ChIP protokoll kan dessutom kombineras med standard ChIP-seq bibliotek beredningsmetoder, vilket är potentiellt användbar till de flesta laboratorier med tillgång till nästa generations sekvensering teknik.
ChIP och ChIP-seq protokoll kan användas inte bara undersöka de bindande profilerna av Histon ändringar, men också att avslöja för andra viktiga transkriptionell tillsynsmyndigheter, såsom transkriptionsfaktorer och aktivatorer (t.ex. P300 och CBP)20. Typiskt, ChIPs (och ChIP-seq) för transkriptionsfaktorer och aktivatorer, som inte är så gott som histoner, kräver betydligt mer utgångsmaterial än ChIPs för Histon märken. Således, protokollet beskrivs kanske inte nödvändigtvis fungerar för de flesta transkriptionsfaktorer eller aktivatorer såvida inte antalet start celler är betydligt ökade (t.ex. 5 x 105 - 5 x 106 celler) eller mycket detaljerade och Det finns effektiva antikroppar. Dock med ytterligare optimering och de ständigt förbättrad bibliotek beredningsmetoder, räknar vi med att ChIP-seq från begränsade cellulära material kommer att bli möjligt för de flesta reglerande proteiner.
Även om våra ChIP och ChIP-seq-protokoll har validerats i stor utsträckning för olika Histon modifieringar och embryonala vävnader, vill vi lyfta fram några kritiska steg som vi anser viktigt att generera högkvalitativa epigenetisk profiler. Först behöver de embryonala proverna isoleras nymalen under förhållanden som inte kompromissa kromatin integritet. Dessa inkluderar utför dissektioner under kalla förhållanden eller flash-frysning samlingsprover tills tillräckligt material är samlat. Ett annat viktigt steg är ultraljudsbehandling, som måste optimeras noggrant för att utföra högkvalitativa marker. Optimal ultraljudsbehandling villkor varierar ofta beroende på vävnadstyp av, mängden vävnad, eller den någon sonikator används. Sist men inte minst, bygger en framgångsrik ChIP i slutändan på tillgången till specifika och ChIP-kompatibel antikroppar mot proteinerna av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inte några konkurrerande finansiella intressen ska lämnas.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Jan Appel för hans utmärkta tekniska bistånd under etableringen av detta protokoll. Arbete i Rada-Iglesias laboratoriet stöds av CMMC intramurala finansiering, DFG forskningsanslag (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1 och TE 1007/3-1), UoC avancerade forskaren grupp Grant och CECAD beviljande.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| BSA powder | Carl Roth | 3737.3 | |
| Phosphate Saline buffer (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Tris-HCL pH 8.0 | Sigma Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.2 | |
| Na-Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-24 | |
| N-lauroylsarcosine | Sigma Aldrich | 61743-25G | |
| Hepes | Applichem | A3724,0250 | |
| LiCl | Carl Roth | 3739.2 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I3021-100ml | |
| SDS | Carl Roth | 1833 | |
| Protein G/magnetic beads | Invitrogen | 1004D | |
| 37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-1L | |
| Glycine | |||
| RNase | Peqlab | 12-RA-03 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 46.35 E | |
| Na-butyrate | Sigma Aldrich | SLB2659V | |
| Proteinase inhibitor | Roche | 5892791001 | |
| SYBRgreen Mix | biozym | 617004 | |
| dH2O | Sigma Aldrich | W4502 | |
| 1 Kb ladder | Thermofisher | SM1333 | |
| Orange G | Sigma Alrich | 03756-25 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-072 | |
| Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100) | Roth | 3051.4 | |
| DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) | Gibco | 31331-028 | |
| Gel loading tips Multiflex | A.Hartenstein | GS21 | |
| qPCR Plates | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 384 well | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 1.5 mL tubes | Sarstedt | 72,706 | |
| 100 - 1,000 µL Filter tips | Sarstedt | 70,762,211 | |
| 2 - 20 µL Filter tips | Sarstedt | 70,760,213 | |
| 2 - 200 µL Filter tips | Sarstedt | 70,760,211 | |
| 0.5 - 10 µL Filter tips | Sarstedt | 701,116,210 | |
| H3K27me3 antibody | Active Motif | 39155 | |
| H3K27ac antibody | Active Motif | 39133 | |
| H3K4me3 antibody | Active Motif | 39159 | |
| H3K4me2 antibody | Active Motif | 39141 | |
| End Repair Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Paramagnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Resuspension buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| A-Tailing Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Ligation Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| RNA Adapter Indexes | Illumina | RS-122-2101 | |
| Stop Ligation Buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| PCR Primer Cocktail | Illumina | FC-121-4001 | |
| Enhanced PCR Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Genomic DNA ladder | Agilent | 5067-5582 | |
| Elution Buffer | Agilent | 19086 | |
| Sample Buffer | Agilent | 5067-5582 | |
| Library Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4835 – 07960204001 | |
| Fertile chicken white eggs | LSL Rhein Main | KN: 15968 | |
| Needle (Neoject) | A.Hartenstein | 10001 | |
| Syringe (Ecoject 10 mL) | Dispomed witt oHG | 21010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Hermle | Z 216 MK | |
| Thermoshaker | ITABIS | MKR13 | |
| Sonicator | Active Motive | EpiShear probe sonicator | |
| Sonicator | Diagenode | Bioruptor Plus | |
| Rotator | Stuart | SB3 | |
| Variable volume (5 –1,000 μL) pipettes | Eppendorf | N/A | |
| Timer | Sigma | N/A | |
| Magnetic holder | Thermo Fisher | DynaMag-2 12321D | |
| Table spinner | Heathrow Scientific | Sprout | |
| Mixer | LMS | VTX 3000L | |
| Real-Time PCR Cycler | Roche | Light Cycler; Serial Nr.5662 | |
| PCR Cycler | Applied Biosystems | Gene Amp PCR System 9700 | |
| DNA and RNA quality control system | Agilent | Agilent 4200 TapeStation System | |
| Forceps | Dumont | 5-Inox-H | |
| Perforated spoon | World precision instruments | 501997 |
References
- Jenuwein, T., Allis, C. D.
- Kouzarides, T.
- Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K.
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Benayoun, B. A., et al. H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency. Cell. 158 (3), 673-688 (2014).
- Rehimi, R., et al. Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations. Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).
- Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
- Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).
- Ho, J. W. K., et al.
- Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why? Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
- Spitz, F., Furlong, E. E. M. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
