Summary
Quantitative Bewertung des Bakterienwachstums unbedingt mikrobielle Physiologie als Systemebene Phänomen zu verstehen. Ein Protokoll für experimentelle Manipulation und ein analytischer Ansatz eingeführt, ermöglicht präzise, Hochdurchsatz-Analyse der bakteriellen Wachstum, das ist ein zentrales Thema des Interesses in der Systembiologie.
Abstract
Bakterielles Wachstum ist ein zentrales Konzept in der Entwicklung der modernen mikrobielle Physiologie, sowie bei der Untersuchung der zelluläre Dynamik auf der Systemebene. Jüngste Studien haben Zusammenhänge zwischen Bakterienwachstum und genomweite Ereignisse, z. B. Genom Reduktion und Transkriptom Reorganisation berichtet. Richtig analysieren Bakterienwachstum ist entscheidend für das Verständnis der Wachstum-abhängige Koordination von Genfunktionen und zellulären Komponenten. Dementsprechend ist die präzise quantitative Auswertung des Bakterienwachstums in gewissem Sinne Hochdurchsatz-erforderlich. Neue technologische Entwicklungen bieten neue experimentelle Tools, die Updates über die Methoden zur Untersuchung von Bakterienwachstum zu ermöglichen. Die hier vorgestellte Protokoll beschäftigt einen Mikrotestplatte Leser mit einem hochoptimierten experimentelle Verfahren für die präzise und reproduzierbare Auswertung des Bakterienwachstums. Dieses Protokoll wurde verwendet, um das Wachstum von mehreren Werten zuvor beschriebenen Escherichia-coli -Stämme. Die wichtigsten Schritte des Protokolls sind wie folgt: die Vorbereitung einer großen Anzahl der Zelle Bestände in kleinen Fläschchen für wiederholte Prüfungen mit reproduzierbaren Ergebnissen, die Verwendung von 96-Well Platten für Hochdurchsatz-Wachstum-Bewertung und die manuelle Berechnung von zwei großen Parameter (d.h. maximale Wachstum Rate und Bevölkerung Dichte) repräsentieren die Wachstumsdynamik. Im Vergleich zu den traditionellen koloniebildenden Einheit (KBE) Assay, der die Zellen, die in Glasröhren im Laufe der Zeit auf Agarplatten kultiviert werden zählt, die vorliegende Methode ist effizienter und bietet detailliertere zeitliche Aufzeichnungen über Wachstum Veränderungen, aber hat eine strengere Nachweisgrenze bei niedrigen Bevölkerungsdichte. Zusammenfassend ist das beschriebene Verfahren vorteilhaft für die präzise und reproduzierbare Hochdurchsatz-Analyse des bakteriellen Wachstums, der konzeptionellen Schlussfolgerungen ziehen oder theoretische Bemerkungen verwendet werden kann.
Introduction
Mikrobiologische Untersuchungen beginnen oft mit der Kultur der Bakterienzellen und der Bewertung der Bakterienwachstum Kurven, die ein grundlegendes Phänomen der bakteriellen Physiologie1,2,3darstellen. Grundlegende Kultur Prinzipien sind weit verbreitet in der veröffentlichten Literatur und Lehrbücher, weil Bakterienkultur eine grundlegende Methodik ist. Die Ebene der Bank erhebliche Aufmerksamkeit hat traditionell auf die Optimierung Wachstumsmedien und Kultivierung Bedingungen, sondern steuern die Wachstumsrate, die wahrscheinlich noch größeres Verständnis für mikrobielle Physiologie bieten würde wurde nicht ausgiebig studiert4. Für exponentiell wachsenden Bakterien, ist ein wichtiger Parameter der zellulären Staat die Wachstumsrate, die berichtet wurde, das Genom, Transkriptom und Proteom5,6,7,8 abgestimmt sein . So ist die quantitative Bewertung des Bakterienwachstums entscheidend für das Verständnis der mikrobielle Physiologie.
Um bakterielles Wachstum zu bewerten, die experimentellen Methoden zur Schätzung der Biomasse sind gut etablierte9,10 und basieren auf dem Nachweis von biochemischen, physikalische oder biologische Parameter, z. B. optische Trübung. Darüber hinaus basieren die analytischen Methoden verwendet, um die dynamischen Eigenschaften des Wachstums Änderungen erfassen häufig auf etablierte nichtlineare Modelle11,12,13, z. B. logistische Gleichungen. Wachstumsdynamik sind in der Regel durch zeitgesteuerte Sampling des Zellwachstums in der Kultur durch optische Trübungsmessung oder Durchführung von koloniebildenden Einheit (KBE) Assays erworben. Die Einschränkung dieser Kultivierung und Erkennung Methoden ist, dass die Datenpunkte kein getreues Spiegelbild der Populationsdynamik sind, da die Messintervalle oft in Stunden sind und die Kultur-Bedingung (z. B.Veränderungen in Temperatur und Belüftung) ist zum Zeitpunkt der Probenahme gestört. Kultur und Analysetechniken müssen aktualisiert werden, mit den letzten Entwicklungen in Technologie und Verständnis. Jüngste Fortschritte in der Mikrotestplatte Leser erlauben die Echtzeit-Beobachtung des Bakterienwachstums und Arbeitskosten deutlich zu verringern. Mit diesen fortschrittlichen Geräten, haben die neuesten Studien über Bakterienwachstum Analysemethoden für Hochdurchsatz-Messungen14,15berichtet.
Dieses Protokoll soll die genaue Wachstumsdynamik in gewissem Hochdurchsatz-bewerten, die quantitative Studien nützlich sein werden, die letztlich die Fragen wie die Wachstumsrate bestimmt wird und welche Faktoren beeinflussen die Wachstumsrate. Das Protokoll befasst sich mit allen Faktoren, die für die reproduzierbare und genaue Quantifizierung des Bakterienwachstums berücksichtigt werden sollten. Die experimentelle Methode und Analyse sind detailliert im Haupttext beschrieben. Diese Methode erlaubt die präzise und reproduzierbare Analyse des Bakterienwachstums in gewissem Sinne Hochdurchsatz. Mikrobiologen können dieses Protokoll verwenden, um zusätzliche quantitative Ergebnisse aus ihrer experimentellen Beweise ableiten. Dieses Protokoll kann auch für Studien in der Systembiologie verwendet werden, die versuchen, konzeptionellen Schlussfolgerungen zu ziehen oder einen theoretischen Überblick über Wachstum zu erreichen.
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Protocol
1. Vorbereitung das Wachstumsmedium
Hinweis: die chemische Zusammensetzung der minimale mittlere M63 lautet wie folgt: 62 mM K 2 HPO 4, 39 mM KH 2 PO 4, 15 mM (NH 4) 2 SO 4 1,8 µM FeSO 4, 15 µM Thiamin-HCl, 0,2 mM MgSO 4 und 22 mM Glukose. M63 erfolgt durch das Mischen von drei Stammlösungen: 5 X Lösung, 20 % Glukose und MgSO 4 Thiamin-Lösung. Speichern Sie alle Lösungen bei 4 ° c
- Herstellung der fünf X-Lösung
- , FeSO 4 Lösung vorzubereiten benutzen eine elektrische Pipette und ein Einweg-serologische Pipette eine 50 mL Zentrifugenröhrchen DdH 2 O hinzu. Verwenden Sie eine P-200 hinzufügen 0,06 mL HCl zu erhalten 0,01 M HCl. Add 36 mg FeSO 4-7 H 2 O und gut verrühren.
- 160 mL DdH 2 O in einem Messzylinder messen und einen 500-mL-Becherglas hinzufügen. Fügen Sie die folgenden in dieser Reihenfolge: 10,72 g K 2 HPO 4, 5,24 g KH 2 PO 4, 2, 0 g (NH 4) 2 SO 4 und 0,5 mL FeSO 4-Lösung (vorbereitet in Schritt 1.1.1).
- Mit dem Präzisions-pH-Meter, den pH-Wert auf 7,0 durch Zugabe von 2 M KOH einstellen. Gießen Sie die Lösung in einen Glaszylinder und einem Gesamtvolumen von 200 mL fügen Sie DdH 2 O hinzu. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 250-mL-Filteranlage (PVDF, 0,22 µM).
- Herstellung der 20 % Glukoselösung
- 200 mL DdH 2 O in einem Messzylinder zu messen und um einen 500-mL-Becherglas gießen. Fügen Sie beim Mischen mit einem Magnetrührer, 50 g Glukose. Verdünnen Sie die Lösung in einem Messzylinder auf ein Gesamtvolumen von 250 mL. Die Lösung zu sterilisieren, wie unter Schritt 1.1.3.
- Herstellung der MgSO 4 Thiamin Lösung
- einen 500-mL-Becherglas 150 mL DdH 2 O hinzufügen. Fügen Sie beim Mischen mit einem Magnetrührer ein Gesamtvolumen von 200 mL 1,0 g Thiamin-HCl und 10 g MgSO 4-7 H 2 O. verdünnt die Lösung in einem Messzylinder hinzu. Die Lösung zu sterilisieren, wie unter Schritt 1.1.3.
- Vorbereitung minimale mittlere M63
- legen die fünf X-Lösung, die 20 % Glukoselösung MgSO 4 Thiamin Lösung, eine elektronische Pipette, einer P-200-Pipette und 200 µL Pipettenspitzen auf einer sauberen Werkbank.
- Maßnahme 155,8 mL DdH 2 O in einem Messzylinder und gießen Sie sie in einen 500-mL-Becherglas.
- Mit dem elektronischen Pipette und Einweg-serologische Pipette, Hinzufügen der gemessenen DdH 2 O. 40 mL 5 X und 4 mL 20 % Glucoselösung Fügen Sie dann 0,2 mL MgSO 4 Thiamin-Lösung mit der P-200. Die Lösung zu sterilisieren, wie unter Schritt 1.1.3.
2. Vorbereitung der Glycerin-Lager
- Zelle Kultur
Hinweis: die Bakterienstämme (z.B., W3110 und seine reduzierte Genome) gibt es von Belastung Bank Organisationen. Die Stämme werden in der Regel in Form von Kolonien auf Agarplatten erhalten.- Platz fünf sterilisierte Glasröhren mit Silikon Gummistopper, eine elektronische Pipette, P-1,000, 1.000 µL Pipettenspitzen, P-200, 200-µL-Pipettenspitzen und die Ziel-Stämme (Kolonien auf Tellern) auf einer sauberen Werkbank.
- Aussetzen die Mündung des Glasrohrs auf dem Bunsenbrenner vor dem Öffnen des Silikon-Gummistopfens. Setzen Sie den Silikon-Gummistopfen in die Flamme nach dem Öffnen der Tube und leicht setzen Sie die Kappe wieder auf die Glasröhre.
- Verwenden die elektronische Pipette und Einweg-serologische Pipette eines der Glasröhren und 4,5 mL M63, die anderen vier Röhrchen 5 mL M63 hinzu.
- P-200 Tipp verwenden, um eine Kolonie zu wählen und in das Glasrohr mit 5 mL M63 impfen.
- Vortex das Rohr zu einer Suspension. Verdünnen Sie die Lösung dann 10-fach durch Übertragung von 0,5 mL dieser Lösung auf eine der vier Röhren mit 4,5 mL M63.
- Wiederholen Sie den Vorgang im Schritt 2.1.5 für die übrigen Röhren beschrieben. Eine Verdünnungsreihe mit fünf verschiedenen Konzentrationen (Verdünnungen von 1, 10, 100, 1000 und 10.000) ist jetzt bereit.
- Sterilisieren die Mündern von Glasröhren und Silikon-Gummistopfen wie unter Punkt 2.1.2 beschrieben. Verschließen Sie die Rohre mit dem Stopfen. Kontamination vermeiden, indem Sie nicht knittern die Silikon-Gummistopper.
- Legen die fünf Röhren in einem vorgewärmten schütteln Inkubator bei 37 ° C und bei 200 u/min schütteln. Inkubation die Kultur über Nacht oder für 10 bis 30 h
- Auswahl der Kultur für das Glycerin Lager
- legen das vorgewärmte Raumtemperatur M63 Medium, P-1,000, 1.000 µL Pipettenspitzen und ein Einweg-Küvette auf einer sauberen Werkbank.
- Hinzufügen 1000 µL M63, eine Einweg-Küvette mit einem p-1, 000. Legen Sie die Einweg-Küvette in einem Spektrophotometer, starten Sie das Programm bei einer festen Wellenlänge von 600 nm und Maßnahme des Rohlings.
- Ans der sauberen Bank die fünf Glasröhren aus dem Schütteln Inkubator.
- Verwerfen M63 von Einweg-Küvette und die gleichen Einweg-Küvette mit einem p-1, 000 1.000 µL Kultur hinzufügen. Die optische Trübung der Zellkultur (OD 600) zu messen, wie in Schritt 2.2.2 beschrieben.
Hinweis: Um eine Kontamination zu vermeiden und eine präzise Messung zu erreichen, setzen Sie die Glasröhren und die Stopper der Flamme wie beschrieben und Wirbel der Kultur vor der Probenahme. Um zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten, sind wiederholte Messungen empfohlen, besonders wenn die Zelldichte niedrig ist. - Der fünf Zellkulturen, wählen Sie in der frühen Phase des exponentiellen Wachstums (OD 600 = 0,01 - 0,05) für den Glycerin bestand.
Hinweis: Wenn mehrere Kulturen dichten im optimalen Bereich, die am nähsten zu 0,05 ist allgemein ausgewählt.
- Machen die Glycerin-Bestände für wiederholte Prüfungen.
Hinweis: Dies ist für die Zubereitung von zehn Aktien beschrieben. Größere oder kleinere Mengen können je nach den experimentellen Anforderungen erfolgen.- Legen Sie die sterilisierten 60 % Glycerin Lösung, zehn sterilisiert 1,5 mL Mikroröhrchen, P-1,000 und P-200, 1.000 und 200 µL Pipettenspitzen und eine Reaktionscup auf einer sauberen Werkbank stehen.
- Fügen Sie 250 µL 60 % Glycerin Lösung und 750 µL der ausgewählten Zellkultur 1,5 mL Reaktionscup und Mischung von Pipettieren sterilisiert.
Hinweis: Das Lager Volumen ist variabel, aber behalten Sie immer eine 1:3-Verhältnis von 60 % Glycerin, Zellkultur; Dadurch wird eine Endkonzentration von 15 % Glycerin. - Stellen die restlichen neun Mikroröhrchen in die Reaktionscup Ständer und 100 µL der Mischung in 2.3.2 Schritt für jedes Rohr vorbereitet zu verzichten. Mittlerweile gibt es zehn identische Glycerin-Beständen für die zukünftige Verwendung.
- Speichern die Bestände in einer Tiefkühltruhe bei-80 ° c
3. Erwerb der Wachstumskurven
- der Mikrotestplatte Leser einrichten.
Hinweis: Die Begriffe in Anführungszeichen zeigen die spezifische Formulierung auf der Platte-Leser verwendet hier verwendet (siehe Tabelle Materialien).- Offene Software. Offene " Protokolle " in " Task-Manager " und wählen Sie " neu erstellen ". Wählen Sie " Standardprotokoll ".
- Open " Verfahren ", und passen Sie die Einstellungen. Offene " Set Temperatur ", und wählen Sie " Inkubator auf ". Set " Temperatur " auf 37 ° C und " Gradient " auf 0 ° C. Check " vorheizen " bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Offene " starten kinetische ", Set " Laufzeit " für 24:00:00 oder 48:00:00, und " Intervall " 00:30:00 oder 01:00.
Hinweis: Es dauert ca. 1 min zu lesen, eine gesamte 96 gut Platte. - Open " schütteln, " und " Shake Modus " als " Linear ". Überprüfen Sie " CoNstitution Shake " und " Frequenz " auf 567 cpm. Offene " lesen ", überprüfen " Absorption ", " Endpunkt/kinetische ", und " Monochromatoren. " gesetzt " Wellenlänge " bis 600.
- Klicken Sie " Validate " zu bestätigen, dass das Verfahren korrekt ist. Klicken Sie " speichern Sie " als ein neues Programm für die spätere Verwendung zu speichern.
- Echtzeit-Aufnahme des Wachstums
- zeichnen einen 96-Well-Platte-Piktogramm (8 × 12 Tabelle) um die Positionen der beimpften Kultur Proben auf der 96-Well-Platte anzugeben. Drucken Sie die Tabelle und verwenden Sie es als Referenz für das Experiment.
Hinweis: Der Brunnen befindet sich am Rande der Mikrotestplatte sollte nur leere Medium wegen Verdunstung enthalten. - Ort eine sterilisierte 96-Well-flache Unterseite Mikrotestplatte mit Deckel, P-1000, 1000 µL Pipettenspitzen, P-200, 200-µL-Pipettenspitzen, mehrere 1,5 mL Mikroröhrchen, ein 8-Mehrkanal-Pipette, sterilisierte Reagenz Reservoir, Raumtemperatur M63 und Glycerin Aktien (vorbereitet in Schritt 2.3) auf einer sauberen Werkbank.
- Ca. 25 mL M63 hinzufügen das Reagenz-Reservoir. Dieses Reservoir-Lager für die folgenden Schritte verwenden.
- Fügen Sie 900 µL M63, Mikroröhrchen in Vorbereitung für die Herstellung von Verdünnungsreihen.
- Lassen die Glycerin-Aktie bei Raumtemperatur auftauen. Fügen Sie 900 µL M63 aufgetauten Glycerin Lager und Wirbel. Dies führt zu einer 10-divisibel Verwässerung der ursprünglichen Glycerin Aktie.
- Transfer 100 µL der 10-divisibel Verdünnung zu einer anderen Reaktionscup mit 900 µL M63 und Wirbel. Dies führt zu einer 100-fold Verdünnung.
- Wiederholen Sie Schritt 3.2.6 bis die gewünschte Anzahl von Verdünnungen erreicht werden.
- Füllen die Brunnen am Rande der Mikrotestplatte mit 200 µL M63 mit einer 8-Kanal-Pipette (P-200).
Hinweis: Diese Brunnen können als Rohling verwendet werden. - Last 200 µL der einzelnen verdünnt Probe vorbereitet in Schritten 3.2.4 - 3.2.7 um die Mikrotestplatte Brunnen nach der Referenztabelle (Schritt 3.2.1). Wirbel der verdünnten Proben vor dem Laden und laden die gleiche Probe in mehreren Wells in vielfältig Standorte auf der Platte.
- 96-Well Mikrotestplatte auf der Platte-Leser legen.
- Open " Read Now " in " Task-Manager " und wählen Sie das Programm (Abschnitt 3.1). Klicken Sie auf " OK " Messung zu beginnen. Speichern Sie die Aufnahme als neue experimentelle Datei für die Datenanalyse (Abschnitt 4).
- zeichnen einen 96-Well-Platte-Piktogramm (8 × 12 Tabelle) um die Positionen der beimpften Kultur Proben auf der 96-Well-Platte anzugeben. Drucken Sie die Tabelle und verwenden Sie es als Referenz für das Experiment.
4. Analyse der Daten
- Export die Ergebnisse der Daten in Echtzeit Wachstumsrate (Abschnitt 3.2) auf einen USB-Speicher-stick als eine Text-Datei.
Hinweis: Eine 96-Well formatierte Ergebnisse (Kurven) werden auf der Platte Leser in Echtzeit angezeigt. Die Stundenaufzeichnungen (OD-Werte) können als Tabelle exportiert werden; die Zeilen und Spalten darstellen, die gut Zahlen (z.B. A1, B1) und die Messzeit (z.B. 00:00:59), beziehungsweise. - Öffnen Sie die Textdatei mit einem Tabellenkalkulations-Software.
- Kopieren Sie die stündlichen OD 600 lautet der 96-Well Mikrotestplatte in ein neues Arbeitsblatt zur weiteren Analyse.
- Subtrahieren Hintergrund liest vor Zeit Null von der stündlichen liest jeder Probe gut.
Hinweis: der Einfachheit halber der Mittelwert des Rohlings Brunnen enthaltenden M63 (Schritt 3.2.8) kann verwendet werden, als den Hintergrundwert. - Berechnen Sie den Mittelwert aus fünf aufeinander folgenden OD 600 liest die maximale Bevölkerungsdichte abzuschätzen.
Hinweis: Der größte Mittelwert der fünf aufeinander folgenden OD 600 lautet ist definiert als die maximale OD 600 entsprechende Wachstumskurve. - Berechnung die Wachstumsrate µ (h -1), durch die Anwendung der folgenden Gleichung für alle Paare aufeinander folgender Werte OD 600:
Hinweis: In dieser Gleichung C ich und C i + 1 repräsentieren die OD 600 Werte zwei aufeinander folgenden Zeitpunkten (t ich und t i + 1, beziehungsweise). LN gibt natürlichen Logarithmus. - Berechnen die Veränderungen bei der Zunahme im Laufe der Zeit auf Stundenbasis OD 600 basierend liest laut Schritt 4.6. Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung der fünf aufeinander folgenden Wachstumsraten, die maximale Wachstumsrate zu schätzen.
Hinweis: Der größte Mittelwert mit der kleinsten Standardabweichung ist definiert als die maximale Wachstumsrate der entsprechenden Wachstumskurve.
5. Bestätigt die globale Vorspannung des 96-Well lautet (Optional)
Hinweis: sowohl die Platte Leser und die Verbrauchsmaterialien 96-Well-Platte können dazu führen, dass voreingenommene Messungen. Um sehr präzise und reproduzierbar quantitative Ergebnisse zu erzielen, bestätigt die globale Vorspannung der 96-Well-Platte ist sehr zu empfehlen.
- 96-Well-Platte und der Platte-Leser auf den Bias Test vorbereiten, wie in Abschnitt 3.2.2 beschrieben.
- Fügen Sie 20 mL M63, eine sterilisierte 50 mL Zentrifugenröhrchen. Die Brühe Glycerin auf die gleichen Zentrifugenröhrchen und Wirbel. Übertragen die abgehängte Lösung zu einem sterilisierten Reagenz Reservoir.
- Verwenden Sie einen 8-Kanal-Pipette, um 200 µL der suspendierten Lösung auf die 96-Well-Platte zu übertragen.
- 96-Well-Platte auf den Teller-Leser und starten Sie die Messung.
- Datensatz die stündliche OD 600 liest und analysiert, wie in Abschnitt 4 beschrieben. Vergleichen Sie die berechnete maximale Wachstum Rate und Bevölkerung Dichte von jedem gut zu bestimmen, standortbezogene Voreingenommenheit des 96-Well lautet.
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Representative Results
Das beschriebene Verfahren bietet die Möglichkeit, dynamische Wachstum von Bakterien in einer kontinuierlichen, Hochdurchsatz-Weise durch den Einsatz eines 96-Well-Format-Reader, der mehrere optische Dichtemessungen in verschiedenen Zeitabständen (von Minuten bis Stunden bis Tage) nimmt zu erfassen. Die Wachstumskurven aus einer Zusammenstellung von E. Coli -Stämme, die mit dem Ausdruck verschiedener Genome können genau in einem einzigen Experiment (Abbildung 1A) erworben werden. Im Vergleich zu der beschriebenen Methode die traditionelle Methode (KBE-Assay) in der Regel erfordert längere Zeitintervalle Probenahme (Abbildung 1 b) und ist arbeitsintensiv, wenn mehrere Kultur erforderlich ist. Darüber hinaus erfordert jede Kultur Abtastzeit für die KBE-Assay die Verwendung von einem kleinen Volumen der Zellkultur, die für wiederholte Messungen verwendet werden kann. Darüber hinaus können begrenzte Anzahl von Zeitpunkten für die Erkennung die Probenahmestellen vermissen, die für die korrekte Berechnung der Wachstumsrate und der maximalen OD600benötigt werden. Jedoch hat die KBE-Assay eine untere Nachweisgrenze, 103 - 104 Zellen/mL, so dass es mindestens zwei Größenordnungen empfindlicher als die optische Trübung-Assay (OD600= 0.001, hat eine Nachweisgrenze von ca. 105 -106 Zellen/mL). Das beschriebene Verfahren bietet ein praktisches und effizientes experimentelles Werkzeug für Systemebene Studien zur Wachstumsdynamik.
Ein entscheidender Vorteil dieses Protokolls ist, dass es wiederholte Messungen aus einem gemeinsamen Glycerin bestand. Mit mehreren Zellkulturen an verschiedenen Verdünnungsraten in frühen exponentiellen Wachstumsphase ist sehr nützlich, weil es ermöglicht die Kulturzeit auf einer Zeitskala abschätzen und vermeidet, dass Kulturen aufgrund von unvorhersehbaren Ereignissen gesättigt. Kultivierung und Messungen von Stammaktien, die aus einer der fünf Kulturen mit unterschiedlichen Verdünnungsraten gemäß Protokoll Abschnitt 2.2 (Abbildung 2A), präsentiert sehr ähnliche Ergebnisse des Wachstums initiiert wurden wiederholt Dynamik-Analyse. Mehreren Wachstumskurven wiederholte und unabhängige Messungen (N = 6) gut überlappt (Abb. 2 boben), mit wenig Varianz (Abbildung 2 bBodenplatte), insbesondere in der exponentiellen Phase ( Abbildung 2 b, schattierter Bereich). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das beschriebene Verfahren hoch reproduzierbare Ergebnisse liefert.
Schätzung der globalen Vorspannung des 96-Well lautet wird dringend empfohlen. In dem vorliegenden Verfahren die globale Vorspannung wird geschätzt durch die Überwachung des Wachstums des Wildtyp E. Coli Stamm W3110, wie im Protokoll Abschnitt 5 beschrieben. Zum Beispiel berechnet die Wachstumsraten von Wachstumskurven zeigte erhebliche Unterschiede unter den 96 Wells (Abbildung 3A), Vertreter der globalen Fluktuation der Datenmanipulation und Gerätefehler abgeleitet. Dieser Fehler können durch das Laden der gleichen Probe in mehreren Brunnen an verschiedenen Orten auf der Platte maskiert werden. Hingegen die maximale OD600 zeigte eine klare ortsabhängigen Voreingenommenheit für die Ergebnisse als schleichende Veränderungen in der vertikalen Richtung beobachtet wurden, erhöht d. h. die maximale OD600 allmählich aus den Brunnen der Spalte 2 derjenigen Spalte 11 auf der 96-Well-Platte (Abb. 3 b). Um die verzerrte Ergebnisse zu vermeiden, empfiehlt sich die gleiche Probe in den Brunnen befindet sich auf beiden Seiten der 96-Well-Platte für wiederholte Messungen geladen werden. Wird angenommen, dass die standortbezogene Vorspannung in maximaler OD600 Werte aus der Variation in Verdunstungsraten, entstehen, die durch Heizung und Abdichtung Effizienz bestimmt sind. Verglichen mit dem Brunnen in der Mitte der 96-Well-Mikrotestplatte, tendenziell der Brunnen befindet sich an den Rändern relativ höhere Werte, spiegelt die vielfältigen Verdunstungsraten infolge die Dichtwirkung der Mikrotestplatte zeigen. Darüber hinaus da andere 96-Well-Mikroplatten dem gleichen Bias Test unterworfen ähnliche Richtungsänderungen zeigten, basierend auf dem Brunnen auf der Platte befand, kann das Ausmaß des Bias auf der Platte Leser abhängen. Daher ist es wichtig, die globale Vorspannung des 96-Well lautet in Studien zu bewerten, die maximale Bevölkerungsdichte zu bestimmen. Handelsübliche Platte Leser, die alle ihre spezifischen globalen Voreingenommenheit haben, verursacht durch die Heizung und schütteln der Effizienz und der 96-Well-Mikroplatten unterscheiden sich vor allem durch die Dichtwirkung.
Diese Methode eignet sich für die systematische Analyse des Bakterienwachstums und es kann zur Analyse von zwei wichtigen Parameter, d. h., Wachstum Rate und Zelle Dichte, die häufig in den unterschiedlichsten Bereichen, wie Systembiologie, Evolution, gelten und Ökologie-16,-17. Die manuelle Berechnung mit Tabellenkalkulation wird eingeführt, um die Verarbeitung des raw lautet die ausgewerteten Parameter des Wachstums Rate und Zelle Dichte produzieren zu zeigen. Die stündliche Wachstumsraten werden zuerst von der rohen lautet der Wachstumskurve (Abb. 4A) laut Protokoll Abschnitt 4.6 als ein Dataset sequentielle Veränderungen in Wachstumsraten (Abbildung 4 b) berechnet. Die Mittel und die Standardabweichungen der alle fünf aufeinander folgende Wachstumsraten gegenüber dem Vorquartal erworben werden (Abbildung 4-D), und die größte durchschnittliche Wachstumsrate mit der kleinsten Standardabweichung ist definiert als die maximale Wachstumsrate des Wachstums Kurve (Abbildung 4-D, hervorgehoben). Die maximale Zelldichte (OD600) wird in ähnlicher Weise analysiert (Abbildung 4E-F). Die berechnete Wachstum Rate und Zelle Dichte werden anschließend weitere Analyse unterzogen. Beachten Sie, dass die beschriebenen Berechnungen automatisch durchgeführt werden können, mit Computer-Plattformen (Programmiersprachen), z. B.R und Python.
Abbildung 1 Wachstumskurven mit vielfältigen Methoden erworben. (A) mehrere Übernahmen von Wachstumskurven. Wachstumskurven von vier unterschiedlichen E. Coli -Stämme, die mit dem Ausdruck verschiedener Genome wurden in gewissem Sinne Hochdurchsatz-erhalten. Die E. Coli -Zellen wurden in minimalen mittleren M63 angebaut, und die Änderungen in OD600 mal gelesen wurden durch ein Lesegerät Mikrotestplatte in 1 h Abständen aufgenommen. Die Stämme von links, rechts sind die Wildtyp E. Coli W3110 (Nummer 0) und seine reduzierte Genomen Zahlen 1, 10 und 18 beschriebenen (zuvor5), beziehungsweise. (B) die Wachstumskurve mittels des KBE-Tests gewonnen. Wildtyp- E. Coli Zellen (Nummer 0) kultiviert wurden und wurden über mehrere Stunden zu den angegebenen Zeitpunkten beprobt. Die Wachstums-Änderungen wurden anhand der KBE-Assay geschätzt. Offenen Kreise zeigen die Aufnahme oder Probenahmestellen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Reproduzierbare Messungen wiederholt. (A) über Nacht Kulturen der abwechslungsreichen Verdünnungs. E. Coli Zellen wurden in Röhren an mehreren Verdünnungsraten geimpft, die variiert von 1 bis zur 10,000-fold, wie angegeben. Die Zellen wurden bei 37 ° C mit Schütteln bei 200 u/min für ca. 12 h kultiviert. OD600 Endwerte von fünf Zellkulturen (von links nach rechts) waren 1,51, 0,74, 0.05, 0,008 0,001, beziehungsweise. Die Kultur mit OD600 von 0,05 wurde für den gemeinsamen Glycerin Bestand verwendet. (B) hoch reproduzierbare Messungen. Sechs unabhängige Wachstumskurven (oben, graue Linien) von der gleichen E. Coli -Stamm wurden erworben und auf die Mikrotestplatte und zwei Fläschchen mit der gemeinsamen Glycerin bestand aus sechs Positionen berechnet. Die schwarze Linie entspricht dem Durchschnitt der sechs Wachstumskurven. Die Koeffizienten der Variation (CV) von den sechs wiederholten Messungen waren berechneten (unten), und die stetige Tiefpunkte sind in rosa überschattet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 globale Vorspannung des 96-Well-Format. (A) Heatmap Wachstumsraten. Der E. Coli Zelle bestand war in minimalen mittleren M63 suspendiert und ebenso in den 96 Vertiefungen der die Mikrotestplatte (dargestellt als Tabelle 12 × 8) geladen. Die Änderungen im OD600 erhielten mit dem Mikrotestplatte Reader, wie in Abschnitt 5 des Protokolls beschrieben. Die Abstufung von weiß bis rot zeigt die Wachstumsraten von 0,7 bis 0,9 h-1. (B) Heatmap des maximalen OD600. Die Abstufung von weiß bis rot zeigt die maximale OD600 Werte von 0,9 bis 1,2. Die Berechnungen für die Wachstumsrate und maximale OD600 sind wie in Abbildung 4beschrieben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 Analyse der Wachstumskurven. (A) Rohdaten von Wachstumskurven. Der stündliche OD600 liest sind gegen die Kulturzeit aufgetragen. Offenen Kreise zeigen die Abtastzeiten. (B) zeitliche Veränderung der Wachstumsraten. Stündliche Wachstumsraten zwischen zwei aufeinander folgenden OD600 mal gelesen werden gemäß der Gleichung in 4.6 beschrieben berechnet. Bedeuten Sie (C) hohe Wachstumsraten. Der Mittelwert der fünf aufeinander folgenden Wachstumsraten werden berechnet, um glatte Wachstumsraten geben. (D) Standardabweichungen vom Mittelwert Wachstumsraten. Die Standardabweichung der gleichen fünf aufeinander folgende Wachstumsraten wird berechnet. Die maximale Wachstumsrate mit der kleinsten Standardabweichung ist rot hervorgehoben. (E) bedeutet OD600. Der Mittelwert der fünf aufeinander folgende OD600 Werte errechnet sich die glatte OD600bestimmen. (F) Standardabweichungen der Mittelwerte OD600 . Standardabweichung der gleichen fünf aufeinander folgenden OD600 Werte errechnet. Die maximale OD600 mit der kleinsten Standardabweichung ist rot hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Wichtige Schritte im Protokoll sind die Vorbereitung einer Stammaktie der exponentiell wachsenden Zellen und die Replikation der gleichen Proben in mehreren Brunnen an verschiedenen Positionen auf die Mikrotestplatte. Zuvor, Mikrobiologen die Kultur angefangen eine Übernachtung Vorkultur. Während diese Methode die Verzögerungszeit des Bakterienwachstums verringern kann, ist es schwierig, reproduzierbare Wachstumskurven zu erreichen. Wie in Abbildung 2dargestellt, führte die unabhängigen Messungen unter Verwendung der gemeinsamen Glycerin Bestände nahezu identische Wachstumskurven, die präzise und reproduzierbare Ergebnisse liefern. Wie in Abbildung 3dargestellt, geben Brunnen an verschiedenen Standorten etwas anders lautet, gilt die globale Hintergrund der Messungen. Für die quantitative Auswertung des Bakterienwachstums sollte diesem Hintergrund betrachtet werden. Inokulation von Proben für mehrere Bohrlöcher an abwechslungsreiche Platte stellen für experimentelle Replikation wird dringend empfohlen, um globale Vorspannung zu berücksichtigen.
Neben der Behandlung von Fehlern, sollte die Änderung und Fehlerbehebung, abgeleitet von den experimentellen Geräten und Verbrauchsmaterialien betrachtet werden. Mehrere fortgeschrittene Mikrotestplatte Leser sind im Handel erhältlich. Sie zeigen eine breite Variation in Eigenschaften, wie die Methode der Justage der Wellenlänge des Lichts, die Art der Beheizung oder Kühlung, und die Art und Häufigkeit der Erschütterung. Basierend auf unserer Erfahrung, sollten Verdunstung im Hochdurchsatz-Studien angesprochen werden, weil Änderungen in Flüssigkeitsvolumen großen Einfluss auf die OD600 mal gelesen. Verdunstung wird durch die Methode der Heizung durch die Mikrotestplatte Leser und die Architektur der Mikrotiterplatten verwendet verursacht. Die beiden Modi der Heizung, die häufig in kommerziellen Mikrotestplatte Leser implementiert sind Heizung mit Warmluft und Heizung mit einer Heizplatte. Die Mikrotestplatte Leser in diesem Protokoll verwendeten verwendet die heiße Platte als eine Heizmethode um Verdunstung zu verringern, weil das Medium in die Mikrotestplatte bläst warme Luft schnell austrocknen würde. Die Mikrotiterplatten sollte auch sorgfältig ausgewählt werden. Verschiedene 96-Well-Mikrotiterplatten (mit Deckel) dazu führen, dass verschiedene Ebenen der Verdunstung. Das beschriebene Verfahren nutzt das Plattenformat mit einem tiefen überdachte Deckel, der Verdunstung reduziert.
Außerdem, wenn die Studie stationäre Phasenanalyse der Wachstumskurve erfordert, sollte dann die Art und Häufigkeit der Erschütterungen in der Mikrotestplatte Leser berücksichtigt werden. Schütteln während Kultur sorgt dafür, dass die wachsenden Zellen gleichmäßig in den Medien ausgesetzt sind. Unsachgemäße schütteln oder niedriger Frequenz verursachen die Zellen, zu stapeln, um den gut Rand oder in der Mitte bei einer hohen Dichte, wodurch falsch liest, die entweder niedriger oder höher als tatsächliche mal gelesen. Die beschriebene Methode verwendet lineare, bidirektionale schütteln. Während der 8-förmigen schüttelnde Modus wahrscheinlich ausreichend ist, empfehlen wir nicht den kreisförmigen Modus schütteln.
Die größte Beschränkung dieser Methode ist die Verdunstung von der Zellkulturmedium. Da die maximale Kulturvolumen klein ist, verursacht also200 µL Inkubation bei 37 ° C erhebliche Verdunstung. Damit diese Methode eignet sich für die Kultivierung länger als 48 h zusätzlich, Zellkulturen mit geringer Dichte sollte vermieden werden, da bei diesen dichten optischen Erkennung (OD600) beschränkt. Zusammen betrachtet, sind sehr langsam wachsende Zellen/Dehnungen oder sehr geringen Ausgangskonzentration Kulturen nicht bevorzugt, da sie längeren Zeit benötigen und sind unterhalb der Nachweisgrenze von OD600.
Diese Methode liefert präzise, Hochdurchsatz-Messungen, die sehr vorteilhaft für systematischen Erhebungen sind. Als ein repräsentatives Ergebnis dieser Methode erlaubt es, um ein Sortiment von E. Coli -Stämme mit verschiedenen Genomsequenzen bzw. Medium einfach und reproduzierbar zu bewerten5. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden der Kultivierung in Rohren und manuell messen Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten, ist die beschriebene Methode weniger Arbeits- und zeitintensiv. Zukünftige Anwendungen und Entwicklung der Methode werden angenommen, die Automatisierung von experimentelle Manipulation und computergestützte Analyse einzubeziehen. Automatische Messung und Robotik Anwendung führt zu eine hocheffiziente und zuverlässige Methode der Bewertung von Zellwachstum und Durchführung überleben Tests mit Bakterien- und Säugetier-Zellen.
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Disclosures
Wir danken für die Bereitstellung der KBE-Assay-Beispiel Kohei Tsuchiya. Diese Arbeit wurde teilweise finanziell durch eine Beihilfe für wissenschaftliche Forschung (C) Nr. 26506003 (zu BWY) vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie, Japan unterstützt.
Acknowledgments
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KH2PO4 | Wako | 166-04255 | |
| (NH4)2SO4 | Wako | 019-03435 | |
| MgSO4-7H2O | Wako | 138-00415 | |
| Thiamine-HCl | Wako | 201-00852 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| HCl | Wako | 080-01066 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O) | Wako | 094-01082 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | |
| Glycerol | Wako | 075-00611 | |
| Centrifuge tube (50 mL, sterilized) | WATSON | 1342-050S | |
| Pipette Tips, 200 µL | WATSON | 110-705Y | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | WATSON | 110-8040 | |
| Microtube (1.5 mL) | WATSON | 131-715C | |
| 8 multichannel-pipette | WATSON | NT-8200 | |
| PASORINA STIRRER | AS ONE | 2-4990-02 | |
| Glass cylinder (200 mL) | AS ONE | 1-8562-07 | |
| Precision pH mater | AS ONE | AS800 / 1-054-01 | |
| Pipetman P-200 | GILSON | 1-6855-05 | |
| Pipetman P-1000 | GILSON | 1-6855-06 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (10 mL) | SANPLATEC | SAN27014 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (25 mL) | SANPLATEC | SAN27015 | |
| Microtube stand | BM Bio | 801-02Y | |
| Vortex | BM Bio | BM-V1 | |
| Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear) | Sigma-Aldrich | Corning, 3370 | |
| Corning Costar reagent reservoir (50 mL) | Sigma-Aldrich | Corning, 4870 | |
| Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 µM) | Merck Millipore | SCGVU02RE | |
| Pipet-Aid XP | DRUMMOND | 4-000-101 | |
| Bioshaker (BR-23UM MR) | TAITEC | 0053778-000 | |
| Disposal cell (1.5 mL) | Kartell | 1938 / 2-478-02 | |
| DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | A23616 | |
| EPOCH2 | BioTek | 2014-EP2-002 / EPOCH2T | |
| Beaker (500 mL) | IWAKI | 82-0008 | |
| BIO clean bench | Panasonic | MCV-B131F | |
| Glass tubes | NICHIDEN RIKA GLASS | P-10M~P-30 /101019 | |
| Silicone rubber stoppers | ShinEtsu Polymer | T-19 | |
| Bacterial strains | Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan |
References
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