Summary
Количественная оценка бактериального роста имеет важное значение для понимания микробной физиологии как явление системного уровня. Внедряются протокол для экспериментальных манипуляций и аналитический подход, позволяя для точного, высок объём анализ роста бактерий, который является ключевым предметом интереса в биологии систем.
Abstract
Рост бактерий – это центральное понятие в развитии современной физиологии микроорганизмов, а также в расследовании сотовой динамика на уровне системы. Недавние исследования сообщили корреляции между роста бактерий и геном общесистемного события, такие как сокращение и транскриптом реорганизацию генома. Правильно анализировать бактериальный рост имеет решающее значение для понимания роста зависит от координации функций генов и клеточных компонентов. Соответственно требуется точной количественной оценки роста бактерий в духе высокой пропускной способности. Новые технологические разработки предлагают новые экспериментальные инструменты, которые позволяют обновления методов, используемых для изучения роста бактерий. Протокол, представил здесь использует Считыватель микропланшетов с оптимизированный экспериментальной процедуры для воспроизводимых и точные оценки роста бактерий. Этот протокол был использован для оценки роста нескольких описанных ранее штаммов Escherichia coli . Основные этапы протокола заключаются в следующем: подготовка большого числа клеток запасов в небольших флаконах для повторных тестов с воспроизводимые результаты, использование 96-луночных пластин для оценки роста высокой пропускной способностью и ручной расчет двух крупных Параметры (то есть, максимального роста скорость и плотность населения) представляющий динамику роста. По сравнению с традиционными колонии формирование подразделения (CFU) assay, который подсчитывает количество ячеек, которые культивировали в стеклянных трубок со временем на плитах агара, нынешний метод является более эффективным и дает более подробной временной записи изменения роста, но имеет более строгие предел обнаружения в низкой плотностью населения. В целом описан метод выгодно для точного и воспроизводимого высок объём анализа роста бактерий, которые могут использоваться для концептуальной выводы или сделать теоретические замечания.
Introduction
Микробиологические исследования часто начинаются с культурой бактериальных клеток и оценки кривых роста бактерий, которые представляют собой явление основных бактериальной физиологии1,2,3. Основные культуры принципы широко доступны в опубликованных исследований литературы и учебников, потому что Бактериальная культура является основным методологии. На уровне скамейке значительное внимание традиционно уделяется оптимизации роста СМИ и культивирования условий, но контролирования показателя роста, который скорее всего обеспечит еще большее понимание физиологии микроорганизмов, не был широко изучены4. Для экспоненциально растет бактерий, ключевым параметром клеточного государства является прирост, который было сообщено координироваться с геном, транскриптом и протеом5,6,7,8 . Таким образом количественные оценки бактериального роста имеет решающее значение для понимания физиологии микроорганизмов.
Для оценки роста бактерий, экспериментальные методы, используемые для оценки биомассы хорошо организованной9,10 и основаны на обнаружение биохимических, физические или биологические параметры, такие как оптическая мутность. Кроме того аналитические методы, используемые для захвата динамические свойства изменения роста обычно основаны на установленных нелинейной модели11,12,13, например, логистических уравнений. Динамика роста обычно приобретают приурочен выборки роста клеток в культуре путем измерения оптическая мутность или выполнении анализов колонии формирование подразделения (CFU). Ограничение этих методов культивирования и обнаружения является, что точки данных не являются подлинным отражением динамики народонаселения, поскольку измерение интервалов, часто в часах состояние культуры (например, изменения температуры и Аэрация) нарушается во время выборки. Культура и анализа методов должны быть обновлены с использованием последних изменений в технологии и понимания. Последние достижения в Гонав читателей позволяют в реальном времени наблюдения роста бактерий и значительно уменьшить затраты труда. С помощью этих передовых устройств, последние исследования на рост бактерий сообщили аналитические методы для высокой пропускной способностью измерений14,15.
Цель настоящего Протокола заключается в оценить точные динамика в духе высокой пропускной способности, которая будет ценным для количественных исследований, которые в конечном итоге решать вопросы как определяется темпы роста и какие факторы влияют на темпы роста. Протокол устраняет все факторы, которые следует учитывать для воспроизводимой и точный количественный рост бактерий. Экспериментальный метод и анализа описаны подробно в основном тексте. Этот метод позволяет точные и воспроизводимые анализ роста бактерий в духе высокой пропускной способности. Микробиологи можно использовать этот протокол получить дополнительные количественные результаты от их экспериментальных доказательств. Этот протокол также может использоваться для исследования в биологии систем, которые пытаются концептуальной выводы или достичь теоретический обзор роста.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка среднего роста
Примечание: химический состав минимальный средний M63 является следующим: 62 мм K 2 HPO 4, 39 мм х 2 PO 4, 15 мм (NH 4) 2 Т 4, 1.8 мкм FeSO 4, 15 мкм тиамин HCl, 0,2 мм MgSO 4 и 22 мм глюкозы. M63 производится путем смешивания трех акций решения: решение 5 X, 20% глюкозы и MgSO 4 тиамина решение. Хранить все решения при 4 ° C.
- Подготовка пяти X решения
- подготовить FeSO 4 решения, использовать электрические пипетки и одноразовые Пипетки серологические для добавления ddH 2 O в 50-мл пластиковых пробирок. Используйте P-200 для добавления 0,06 мл HCl для получения 0,01 М HCl. Добавить 36 мг FeSO 4-7 H 2 O и хорошо перемешайте.
- Измерения 160 мл ddH 2 O в Измерительный цилиндр и добавить его в стакан 500 мл. Добавьте следующее в следующем порядке: 10.72 g K 2 HPO 4, 5.24 g KH 2 PO 4, 2.0 g (NH 4) 2 т 4 и 0,5 мл FeSO раствора 4 (подготовленных на шаге 1.1.1).
- С помощью рН метр точность, Отрегулируйте пэ-аш до 7.0, добавив 2 M Кох. Залейте раствор в Измерительный цилиндр и добавьте ddH 2 O суммарный объем 200 мл. Стерилизовать решения с помощью блок фильтрации 250 мл (PVDF, 0,22 мкм).
- Подготовка 20% раствора глюкозы
- измерения 200 мл ddH 2 O в Измерительный цилиндр и залить его в стакан 500 мл. Во время смешивания с использованием магнитной мешалкой, добавьте 50 гр глюкозы. Разбавьте раствор в Измерительный цилиндр на общий объем 250 мл. Стерилизовать решение, как описано в шаге 1.1.3.
- Подготовка решения тиамина MgSO 4
- Добавить 150 мл ddH 2 O в 500 мл стакан. Во время смешивания с магнитной мешалкой, добавьте 1.0 g тиамин HCl и 10 г MgSO 4-7 H 2 O. развести решение в Измерительный цилиндр в суммарный объем 200 мл. Стерилизовать решение, как описано в шаге 1.1.3.
- Подготовка минимальной средней M63
- место решение пяти X, 20% раствора глюкозы, решение тиамина MgSO 4, электронных дозаторов, P-200 пипетки и 200 мкл наконечники на чистой скамейке.
- Измерения 155.8 мл ddH 2 O в Измерительный цилиндр и залить его в 500 мл стакан.
- С использованием электронных дозаторов и одноразовые Серологические Пипетки, добавить 40 мл раствора пяти X и 4 мл 20% раствора глюкозы в измеренные ddH 2 O. Затем добавьте 0,2 мл раствора тиамина 4 MgSO с P-200. Стерилизовать решение, как описано в шаге 1.1.3.
2. Подготовка глицерин фондовая
- клетки культуры
Примечание: бактериальных штаммов (например, W3110 и ее снижение геномов) доступны из штамма банковских организаций. Штаммы обычно получаются в виде колоний на плитах агара.- Место пять стерилизованные стеклянные трубки с силиконовые резиновые пробки, электронные пипетки, P-1,000, 1000 мкл наконечники, P-200, 200 мкл наконечники и целевой штаммов (колоний на пластинах) на чистую скамейке. Перед открытием пробки резиновые
- разоблачить рот стеклянную трубку с помощью горелки Бунзена. Подвергать резиновые пробки пламени, после открытия трубки, а затем слегка установите крышку обратно на стеклянной трубки.
- Использовать электронных дозаторов и одноразовые Серологические Пипетки для добавления одной из стеклянных трубок и 4,5 мл M63 другие четыре трубки 5 мл M63.
- Использовать кончик P-200 чтобы выбрать колонии и инокуляции в стеклянную трубку, содержащую 5 мл M63.
- Вихревой трубе сделать подвеска. Затем разбавить раствор 10 раз передавая 0,5 мл этого раствора на один из четырех пробирки, содержащие 4,5 мл M63.
- Повторить процесс, описанный в шаге 2.1.5 для остальных трубок. Серию разрежения с пяти различных концентрациях (разведениях 1, 10, 100, 1000 и 10 000) теперь готов.
- Стерилизации уст стеклянных трубок и силиконовые резиновые пробки, как описано в пункте 2.1.2. Крышка трубки с пробками. Избегайте загрязнения, не складок резиновые пробки силиконовые.
- Место пять труб в подогретым пожимая инкубатора при 37 ° C и погрозит 200 об/мин. Инкубировать культуры на ночь или на 10-30 ч.
- Выбор культуры для глицерина акций
- место среднего подогретым комнатной температуре M63, P-1,000, 1000 мкл наконечники и одноразовые кюветы на чистой скамейке.
- Добавить 1000 мкл M63 для одноразовых кювет с P-1, 000. Одноразовые кюветы в спектрофотометр, запустите программу при фиксированной длине волны 600 Нм и мера пустым.
- Переместить пять стеклянных трубок от тряски инкубатора чистого скамейке.
- Отбросить M63 от одноразовых кювет и добавить 1000 мкл культуры же одноразовые кюветы с P-1, 000. Измерить оптическая мутность клеточной культуры (600 OD), как описано в шаге 2.2.2.
Примечание: Чтобы избежать любого загрязнения и добиться точного измерения, разоблачить стеклянных трубок и пробки пламени как описано и вихревой культуры до взятия пробы. Чтобы обеспечить надежные результаты, повторные измерения рекомендуется, особенно при низкой плотности клеток. - Из пяти клеточные культуры, выбрать один, который находится в начале фазы экспоненциального роста (OD 600 = 0.01 - 0.05) для акций глицерола.
Примечание: Если несколько культур имеют плотности в пределах оптимального диапазона, ближе всего к 0,05 обычно выбирается.
- Сделать Глицерин запасов для повторных тестов.
Примечание: Это описано для подготовки десять запасов. Больших или меньших количествах могут быть сделаны в соответствии экспериментальной требования.- Место стерилизованные 60% раствор глицерина, десять стерилизовать 1,5 мл пробирок, P-1,000 и P-200, 1000 и 200 мкл наконечники и Микропробирка стоять на чистой скамейке.
- Внести 250 мкл концентрированного стерилизована 60% раствором глицерина и 750 мкл культуры выбранной ячейки в 1,5 мл микропробирок и микс закупорить.
Примечание: Объем запасов является переменной, но всегда поддерживать соотношение 1:3, 60% глицерина в культуре клеток; Это приводит в конечной концентрации 15% глицерина. - Место оставшиеся девять пробирок на стенде Микропробирка и отказаться от 100 мкл смеси подготовлен на шаге 2.3.2 в каждую пробирку. Есть в настоящее время десять одинаковых глицерина запасов для использования в будущем.
- Хранить запасы в морозильник на -80 ° C.
3. Приобретение кривых роста
- Настройка Считыватель микропланшетов.
Примечание: Термины, показано в кавычки показывают конкретные формулировки, используемых на пластине читателя, используемые здесь (см. таблицу материалы).- Открытое программное обеспечение. Открытые " протоколы " в " Диспетчер задач " и выберите " создать новый ". Выберите " стандартный протокол ".
- Открытое " процедура " и настроить параметры. Открытые " установка температуры " и выберите " инкубатор на ". Задать " Температура " до 37 ° C и " градиент " до 0 ° C. проверить " разогреть " прежде чем переходить к следующему шагу. Открытые " начать кинетическая ", установите " во время выполнения " по 24:00:00 или 48:00:00, и " интервал " 00:30:00 или 01:00:00.
Примечание: Это занимает примерно 1 мин для чтения всего 96 хорошо пластина. - Открыть " Shake " и " Shake режим " как " линейного ". Проверить " Constitution трясти " и " частота " на 567 cpm. Открытые " читать ", проверить " Absorbance ", " конечной точки/кинетической ", и " монохроматоры. " установить " волны " 600.
- Нажмите " Validate " для подтверждения, что процедура верно. Нажмите кнопку " сохранить " сохранить его как новую программу для будущего использования.
- В реальном времени, записи роста
- нарисовать 96-луночных пластины пиктограмма (8 × 12 таблица) для указания позиции привитых культуры образцов на 96-луночных пластине. Распечатать таблицу и использовать его как ссылку для эксперимента,.
Примечание: Скважин, расположенных по краям микроплиты должен содержать только пустой среднего из-за испарения. - Место плоскую стерилизованные 96-луночных микропланшетов дно с крышкой, P-1000, 1000 мкл наконечники, P-200, 200 мкл наконечники, несколько 1.5 мл пробирок, дозатор 8-многоканальный, стерилизованные реагент водохранилище, комнатной температуре M63 и глицерина запасы (подготовленных на шаге 2.3) на лавочке чистой.
- Добавить примерно 25 мл M63 реагент водохранилище. Используйте этот запас водохранилища для всех следующих шагов.
- Добавить 900 мкл M63 для пробирок в подготовке для изготовления серийных разведений.
- Оттепель глицерин акций при комнатной температуре. 900 мкл M63 талой глицерин фондовых и вихрь. Это приводит в десятикратного разбавления акций оригинальный глицерола.
- Передачи 100 мкл десятикратного разбавления до другой Микропробирка, содержащий 900 мкл M63 и вихря. Это приводит к 100-кратного разбавления.
- Повторите шаг 3.2.6 пока не достигнуто требуемое количество разведений.
- Заполнить скважин на краю микропланшетов с 200 мкл M63 с помощью 8-канальный дозатор (P-200).
Примечание: Эти скважины может использоваться как пустое. - Нагрузка 200 мкл каждого разбавленный образец подготовлен в шагах 3.2.4 - 3.2.7 Гонав скважин согласно таблице ссылок (шаг 3.2.1). Вихревой разреженных образцов до загрузки и загрузки же образца в нескольких скважин на разнообразных мест на табличке.
- Место 96-луночных микропланшетов на пластине читателя.
- Открытое " чтения теперь " в " Диспетчер задач " и выбрать программу (раздел 3.1). Нажмите кнопку " ОК " для начала измерения. Сохранить запись как новый экспериментальный файл для анализа данных (раздел 4).
- нарисовать 96-луночных пластины пиктограмма (8 × 12 таблица) для указания позиции привитых культуры образцов на 96-луночных пластине. Распечатать таблицу и использовать его как ссылку для эксперимента,.
4. Анализ данных
- Экспорт результатов данных реального времени темпы роста (статья 3.2) для памяти USB stick как текстовый файл.
Примечание: 96-луночных отформатированные результаты (кривые) будет отображаться на пластине читателя в режиме реального времени. Почасовая записей (ОД значения) могут быть экспортированы в виде таблицы; строки и столбцы представляют собой хорошо чисел (например, A1, B1) и время измерения (например, 00:00:59), соответственно. - Открыть текстовый файл с программным обеспечением электронной таблицы.
- Копировать на новый лист для дальнейшего анализа Почасовая ОД 600 гласит о 96-луночных микропланшетов.
- Вычитание фона читает на время ноль от почасовой читает каждого образца хорошо.
Примечание: Для удобства, среднее значение пустой скважинах содержащих M63 (шаг 3.2.8) может использоваться как значение фона. - Вычислить среднее пяти последовательных чтений 600 ОД оценить максимальную плотность.
Примечание: Крупнейший среднее значение пяти последовательных чтений 600 ОД определяется как максимальная ОД 600 соответствующей кривой роста. - Рассчитать темпы роста, µ (h -1), используя следующее уравнение для всех пар последовательных значений ОД 600:
Примечание: В этом уравнении, C, я и C i + 1 представляют ОД 600 значения любых двух раз подряд точек (t, я и t i + 1, ««««соответственно). LN указывает натуральный логарифм. - Расчет изменения темпов роста с течением времени на основе почасовой ОД 600 читает согласно шагу 4.6. Вычислить среднее и стандартное отклонение пяти последовательных темпов оценить максимальный прирост.
Примечание: Крупнейший средней с наименьшим стандартное отклонение определяется как максимальный прирост соответствующей кривой роста.
5. Подтверждающий глобального смещения 96-луночных читает (необязательно)
Примечание: обе пластины читателя и расходные материалы для 96-луночных пластины может привести к предвзятым измерений. Для достижения очень точные и воспроизводимые количественные результаты, подтверждающие глобального смещения 96-луночных плиты рекомендуется.
- Подготовить 96-луночных плиты и плиты читатель для смещения теста, как описано в разделе 3.2.2.
- Добавить 20 мл M63 для стерилизации пластиковых 50 мл пробирок. Добавьте глицерин бульон же пластиковых пробирок и вихря. Приостановлено решением передать стерилизованные реагент водохранилище.
- Использовать 8-канальный дозатор для передачи 200 мкл раствора приостановлено пластину 96-а.
- Место пластину 96-луночных на читателя пластины и начать измерения.
- Запись почасовой ОД 600 читает и анализировать, как описано в разделе 4. Сравните Расчетный максимальный рост скорость и плотность населения каждой скважины для определения местоположения предвзятости гласит: 96-луночных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описан метод предоставляет средства для захвата динамический рост бактерий в духе непрерывного, высокой пропускной способности, используя формат 96-луночных читателя, который принимает несколько измерений оптической плотности в различные промежутки времени (от минут до часов до суток). Кривые роста ассортимента штаммов E. coli , выражая различных геномов могут приобретаться точно в одном эксперименте (рис. 1A). По сравнению с описан метод традиционный метод (пробирного CFU) обычно требует больше интервалов времени (рис. 1B) и является трудоемким, если требуется несколько культуры. Кроме того каждый раз выборки культуры для CFU assay требует использования небольшого количества клеточной культуры, который не может использоваться для повторных измерений. Кроме того ограниченное число моментов времени для обнаружения может пропустить точки отбора проб, которые необходимы для правильного расчета темпов роста и максимально ОД600. Однако, кое assay имеет нижний предел обнаружения, 103 - 104 клеток/мл, что делает его по крайней мере двух порядков более чувствительны, чем оптическая мутность assay (OD600= 0,001, которая имеет предел обнаружения приблизительно 105 -106 клеток/мл). Описан метод обеспечивает практический и эффективный экспериментальный инструмент для систем уровня исследований по динамике роста.
Основным преимуществом этого протокола является, что он принимает повторные измерения от общих запасов глицерина. Имея несколько клеточных культур в различных ставок разрежения в начале фазы экспоненциального роста весьма полезны, потому что она позволяет исследователям определить время культуры в любые сроки и избегает, насыщенный культур из-за непредсказуемых событий. Повторил культивирования и измерения обыкновенных акций, которые были подготовлены от одного из пяти культур, начатый с использованием ставок различных разрежения, как описано в протоколе раздел 2.2 (рисунок 2A), представил весьма сходные результаты роста анализ динамики. Несколько кривых роста неоднократные и независимых измерений (N = 6) перекрываются хорошо (Рисунок 2Бверхней панели), с мало разницы (Рисунок 2BНижняя панель), особенно на этапе экспоненциальное ( Рисунок 2B, затененный район). Эти результаты показывают, что описан метод обеспечивает высокую воспроизводимость результатов.
Оценки глобального смещения 96-луночных читает настоятельно рекомендуется. В рамках нынешнего метода, глобального смещения оценивается путем мониторинга роста одичал типа E. coli штамм W3110, как описано в протоколе раздела 5. Например темпы роста рассчитывается от кривых роста, показали значительные различия среди 96 скважин (Рисунок 3А), представляющий глобальные колебания, производный от манипулирования данными и ошибки устройства. Эти ошибки могут быть замаскированы путем загрузки того же образца в несколько скважин в различных местах на плите. Контрастом максимальная ОД600 показал ясно местоположение зависимых уклоном для достижения результатов, как постепенного изменения наблюдались в вертикальном направлении, то есть, максимальное ОД600 постепенно увеличивается из скважин в колонке 2 до тех Колонка 11 на 96-луночных пластины (рис. 3B). Чтобы избежать предвзятых результаты, того же образца рекомендуется быть загружены в скважинах, расположенных по обе стороны 96-луночных пластины для повторных измерений. Предполагается, что неблагоприятным географическим уклоном в максимальных значений600 ОД в результате различий в испарения, которые определяются системой отопления и герметизации эффективности. По сравнению с скважин в середине 96-луночных микропланшетов, скважин, расположенных по краям, как правило, показывают относительно высокие значения, отражающие разнообразный испарения, в результате уплотнения микроплиты. Кроме того поскольку другие 96-луночных планшетов же смещения испытанию показали аналогичные изменения направления, основанные на где колодец был расположен на табличке, степень смещения может зависеть от читателя пластины. Таким образом важно оценить глобальный сдвиг 96-луночных читает в исследованиях, которые определяют максимальную плотность. Коммерчески доступные пластины читателей, все имеют их конкретных глобальных предвзятости, вызванной отопления и покачивая эффективность и 96-луночных планшетов основном дифференцируются по герметизации эффективности.
Этот метод предназначен для систематического анализа роста бактерий, и она может использоваться для анализа двух основных параметров, т.е., плотности роста темпы и клетки, которые обычно применяются в самых различных областях, например систем биологии, эволюция, и Экология16,17. Вычисления вручную, с использованием таблицы вводится Показать обработки сырья читает производить оценку параметров роста плотности темпы и клеток. Почасовые ставки роста сначала рассчитываются от сырой читает кривой роста (рис. 4A) согласно протоколу раздел 4.6 как набор данных последовательных изменений в темпах роста (рис. 4В). Средства и стандартные отклонения каждые пять последовательных темпов приобретаются последовательно (рис. 4 c-D), и крупнейший средний прирост с наименьшим стандартное отклонение определяется как максимальные темпы роста Кривая (Рисунок 4 c-D, подчеркнул). Плотность максимальной клеток (600OD) анализируется аналогично (Рисунок 4E-F). Расчетный рост курса и клеток плотность подвергаются впоследствии для дальнейшего анализа. Обратите внимание, что описанные расчеты могут быть автоматически выполнены с использованием вычислительных платформ (языки программирования), например, R и Python.
Рисунок 1 кривых роста приобрела с различными методами. (A) несколько приобретений кривых роста. Кривые роста четырех различных штаммов E. coli , выражая различных геномов были получены на основе высокой пропускной способности. E. coli клетки были выращены в минимальный средний M63, и изменения в ОД600 чтений были записаны Считыватель микропланшетов интервалами 1-h. Штаммов от левой до правой являются дикого типа E. coli W3110 (номер 0) и ее снижение геномов чисел 1, 10 и 18 (описанные ранее5), соответственно. Кривая роста (B) , полученные с помощью CFU assay. Одичал тип клетках E. coli (номер 0) были культивировали и были взяты пробы в назначенное время точках в течение нескольких часов. Изменения роста оценивались с использованием CFU assay. Кружков указывают записи или отбора проб. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Воспроизводимость измерений повторяется. (A) ночь культуры разнообразный разрежающегоs. E. coli клетки были привиты в трубы на несколько разрежения цены, которые варьируются от 1-к 10,000-fold, как указано. Клетки были культивировали при 37 ° C с встряхивания на 200 rpm для приблизительно в 12 ч. Конечные значения600 ОД пяти клеточных культур (слева направо) были 1,51, 0,74, 0,05, 0,008 и 0,001, соответственно. Культура с ОД600 0,05 использовался для общих запасов глицерина. (B) высокую воспроизводимость измерений. Шесть независимых роста кривых (Топ, серые линии) же штамм E. coli были приобретены и рассчитывается от шести должностей микроплиты и двух флаконов общих запасов глицерина. Черная линия представляет собой среднее шести роста кривых. Коэффициенты вариации (CV) шесть повторных измерений были расчетные (внизу), и устойчивый низких точек являются тенью в розовом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 глобального смещения формата 96-луночных. (A) тепла карта темпов роста. E. coli сотовый фондовой было приостановлено в минимальный средний M63 и одинаково загружаются в 96 скважин (в виде таблицы 12 × 8) микропланшетов. Изменения в ОД600 были получены с помощью Считыватель микропланшетов, как описано в разделе 5 протокола. Градация от белого к красному показывает темпы роста от 0,7 до 0,9 h-1. (B) тепла карта максимальной ОД600. Градация от белого к красному показывает максимальные значения600 ОД от 0.9 до 1,2. Расчеты для темпов роста и максимально ОД600 , описаны на рисунке 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 анализ кривых роста. (A) необработанных данных кривых роста. Почасовая читает600 ОД заговор против время культуры. Кружков указывают время выборки. (B) височные изменения в темпах роста. Почасовая темпы роста между двух последовательных чтений600 ОД рассчитываются согласно уравнению, описанной в 4.6. (C) означает темпы роста. Среднее из пяти последовательных темпов рассчитываются дать плавный рост. (D) стандартные отклонения среднего роста ставок. Вычисляется стандартное отклонение же пять последовательных темпов. Максимальный прирост с наименьшим стандартное отклонение будет выделена красным цветом. (E) означает ОД600. Среднее из пяти последовательных значений600 ОД рассчитывается для определения гладкой ОД600. (F) стандартных отклонений от значения ОД600 . Вычисляется стандартное отклонение же пять последовательных значений600 ОД. Максимальная ОД600 с наименьшим стандартное отклонение будет выделена красным цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важнейшие шаги в протоколе включают разработку обыкновенных акций экспоненциально растущей клетки и репликации же образцов в нескольких скважин в различных позициях на микроплиты. Ранее микробиологов начал культуры от ночи до культуры. Хотя этот метод может сократить время запаздывания бактериального роста, трудно добиться воспроизводимости роста кривых. Как показано на рисунке 2, независимых измерений, с использованием общих запасов глицерин привело к почти идентичные роста кривых, которые обеспечивают точные и воспроизводимые результаты. Как показано на рисунке 3, скважин в различных местах дают слегка различных чтений, который считается глобальных фоновых измерений. Для количественной оценки роста бактерий следует рассмотреть этот фон. Прививка образцов в нескольких скважин на местах разнообразных пластины для экспериментальных репликации настоятельно рекомендуется для учета глобального смещения.
Кроме обработки ошибок, следует рассмотреть модификации и устранения неполадок, производный от экспериментальных устройств и принадлежностей. Коммерчески доступны несколько передовых Гонав читателей. Они показывают разнообразие в характеристики, такие как метод коррекции длины волны света, режим нагрева или охлаждения и способ и частота встряхивания. Основываясь на нашем опыте, испарения должны решаться в высок объём исследований потому что ОД600 читает значительно влияние изменения в объем жидкости. Испарения вызывается метод нагрева используется Гонав читателей и архитектурой планшет. Два режима нагрева, обычно реализуются в коммерческих Гонав читателей отопления теплого воздуха и отопление с горячей плите. Считыватель микропланшетов, используемые в настоящем протоколе используется поджарки в качестве метода Отопление для уменьшения испарения, потому что средний в микроплиты будет быстро высыхать в дует теплый воздух. Планшет также должны быть тщательно отобраны. Различные 96-луночных планшетов (с крышками) вызывают различные уровни испарения. Описан метод использует формат пластины с глубоким покрытые крышкой, которая уменьшает испарение.
Кроме того если исследование требует стационарной фазы анализа кривой роста, то способ и частота встряхивания в Считыватель микропланшетов следует принимать во внимание. Покачивая во время культура обеспечивает равномерно приостановить рост клеток в средствах массовой информации. Неправильное встряхивания или низкой частоты может вызвать ячейки стека вокруг хорошо края или в центре на высокой плотности, в результате ложных чтений, которые находятся ниже или выше, чем фактические читает. Описан метод использует линейное, двунаправленный встряхивания. Хотя вероятно достаточно 8-образной пожимая режиме, мы не рекомендуем круговой режим встряхивания.
Главным недостатком этого метода является испарения клеток питательной среды. Поскольку объем максимальной культуры является небольшим, т.е., 200 мкл, инкубации при 37 ° C вызывает значительное испарение. Таким образом этот метод не подходит для культивирования дольше, чем 48 ч. Кроме того, клеточных культур низкой плотности следует избегать, поскольку оптического обнаружения (600OD) ограничена на эти плотности. При рассмотрении вместе, очень медленно растущих клеток/штаммы или очень низкой начальной концентрации культур не предпочтительным, поскольку они требуют больше времени и не ниже предела обнаружения ОД600.
Этот метод дает точный, высокой пропускной способностью измерений, которые являются весьма выгодным для систематических обследований. В результате представителя, этот метод позволяет оценить ассортимент штаммы кишечной палочки с различными genomic последовательностей и/или средних легко и можно воспроизвести5. По сравнению с традиционными методами культивирования в трубах и вручную измерения образцов в разное время точках, описан метод является меньше труда и время интенсивных. Предполагается, что будущие приложения и развитие метода привлекать Автоматизация экспериментальных манипуляций и Вычислительный анализ. Автоматические измерения и робототехники применение приведет к весьма эффективный и надежный метод оценки роста клеток и выполнение тестов выживания, с использованием бактериальной и mammalian клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Мы благодарим Kohei Tsuchiya за предоставление CFU пробирного пример. Эта работа частично финансово поддержали субсидий для научных исследований (C) № 26506003 (для BWY) от министерства образования, культуры, спорта, науки и технологии, Япония.
Acknowledgments
Авторы не имеют ничего сообщать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KH2PO4 | Wako | 166-04255 | |
| (NH4)2SO4 | Wako | 019-03435 | |
| MgSO4-7H2O | Wako | 138-00415 | |
| Thiamine-HCl | Wako | 201-00852 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| HCl | Wako | 080-01066 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O) | Wako | 094-01082 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | |
| Glycerol | Wako | 075-00611 | |
| Centrifuge tube (50 mL, sterilized) | WATSON | 1342-050S | |
| Pipette Tips, 200 µL | WATSON | 110-705Y | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | WATSON | 110-8040 | |
| Microtube (1.5 mL) | WATSON | 131-715C | |
| 8 multichannel-pipette | WATSON | NT-8200 | |
| PASORINA STIRRER | AS ONE | 2-4990-02 | |
| Glass cylinder (200 mL) | AS ONE | 1-8562-07 | |
| Precision pH mater | AS ONE | AS800 / 1-054-01 | |
| Pipetman P-200 | GILSON | 1-6855-05 | |
| Pipetman P-1000 | GILSON | 1-6855-06 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (10 mL) | SANPLATEC | SAN27014 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (25 mL) | SANPLATEC | SAN27015 | |
| Microtube stand | BM Bio | 801-02Y | |
| Vortex | BM Bio | BM-V1 | |
| Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear) | Sigma-Aldrich | Corning, 3370 | |
| Corning Costar reagent reservoir (50 mL) | Sigma-Aldrich | Corning, 4870 | |
| Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 µM) | Merck Millipore | SCGVU02RE | |
| Pipet-Aid XP | DRUMMOND | 4-000-101 | |
| Bioshaker (BR-23UM MR) | TAITEC | 0053778-000 | |
| Disposal cell (1.5 mL) | Kartell | 1938 / 2-478-02 | |
| DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | A23616 | |
| EPOCH2 | BioTek | 2014-EP2-002 / EPOCH2T | |
| Beaker (500 mL) | IWAKI | 82-0008 | |
| BIO clean bench | Panasonic | MCV-B131F | |
| Glass tubes | NICHIDEN RIKA GLASS | P-10M~P-30 /101019 | |
| Silicone rubber stoppers | ShinEtsu Polymer | T-19 | |
| Bacterial strains | Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan |
References
- Kovarova-Kovar, K., Egli, T. Growth kinetics of suspended microbial cells: from single-substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics. Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3), 646-666 (1998).
- Soupene, E., et al. Physiological studies of Escherichia coli strain MG1655: growth defects and apparent cross-regulation of gene expression. J Bacteriol. 185 (18), 5611-5626 (2003).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Egli, T. Microbial growth and physiology: a call for better craftsmanship. Front Microbiol. 6, 287 (2015).
- Kurokawa, M., Seno, S., Matsuda, H., Ying, B. W. Correlation between genome reduction and bacterial growth. DNA Res. 23 (6), 517-525 (2016).
- Matsumoto, Y., Murakami, Y., Tsuru, S., Ying, B. W., Yomo, T. Growth rate-coordinated transcriptome reorganization in bacteria. BMC Genomics. 14, 808 (2013).
- Nahku, R., et al. Specific growth rate dependent transcriptome profiling of Escherichia coli K12 MG1655 in accelerostat cultures. J Biotechnol. 145 (1), 60-65 (2010).
- Dai, X., et al. Reduction of translating ribosomes enables Escherichia coli to maintain elongation rates during slow growth. Nat Microbiol. 2, 16231 (2016).
- Madrid, R. E., Felice, C. J. Microbial biomass estimation. Crit Rev Biotechnol. 25 (3), 97-112 (2005).
- Harris, C. M., Kell, D. B. The estimation of microbial biomass. Biosensors. 1 (1), 17-84 (1985).
- Yates, G. T., Smotzer, T. On the lag phase and initial decline of microbial growth curves. J Theor Biol. 244 (3), 511-517 (2007).
- Kargi, F. Re-interpretation of the logistic equation for batch microbial growth in relation to Monod kinetics. Lett Appl Microbiol. 48 (4), 398-401 (2009).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Crit Rev Food Sci Nutr. 51 (10), 917-945 (2011).
- Sprouffske, K., Wagner, A. Growthcurver: an R package for obtaining interpretable metrics from microbial growth curves. BMC Bioinformatics. 17, 172 (2016).
- Hall, B. G., Acar, H., Nandipati, A., Barlow, M. Growth rates made easy. Mol Biol Evol. 31 (1), 232-238 (2014).
- Hermsen, R., Okano, H., You, C., Werner, N., Hwa, T. A growth-rate composition formula for the growth of E.coli on co-utilized carbon substrates. Mol Syst Biol. 11 (4), 801 (2015).
- Engen, S., Saether, B. E. r- and K-selection in fluctuating populations is determined by the evolutionary trade-off between two fitness measures: Growth rate and lifetime reproductive success. Evolution. 71 (1), 167-173 (2017).
