Summary
인간의 망막 fovea, 흑점, 그리고 주변 망막을 포함 하 여 기능 및 분자로 별개 영역 구성 됩니다. 여기, 펀치 생 검 및 인간의 눈에서 조직 층의 수동 제거를 사용 하 여 부하 다운스트림 proteomic 분석이 고유한 망막 영역을 수집 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
인간의 망막 혈관 맥락 막 층을 단단히 complexed은 감각 neuroretina 및 근본적인 망막 안료 상피 (RPE)의 구성 됩니다. 망막의 다른 영역은 해부학 및 분자로 독특한, 독특한 기능을 촉진 하 고 질병에 차동 민감성을 보여주는입니다. 각 이러한 영역 및 레이어 Proteomic 분석 연령 황 반 변성 (AMD), 녹 내장, 당뇨병, 등 많은 질병의 분자 과정에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 그러나, 망막 지역과 계층의 분리 정량 proteomic 분석을 수행할 수 있습니다 전에 필수적 이다. 여기, 해 부 및 컬렉션의 시야, 황 반, 및 주변 망막 영역 및 근본적인 RPE 맥락 막 복잡 한, 지역 펀치 생 검 및 인간의 눈에서 조직 층의 수동 제거를 포함 하는 방법을 설명 합니다. 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) 등 다운스트림 proteomic 분석 뿐만 아니라 1 차원 SDS 페이지 사용할 수 있습니다 각 해 부 망막 층에 단백질을 식별 하기 위해 망막 질환에 대 한 분자 biomarkers를 공개.
Introduction
망막, RPE, 및 맥락 막 단백질 표정, 생리 적 기능 및 병 적인 감정1,2에서 중요 한 지역 차이 보여 주는 복잡 한 조직이 있습니다. 예를 들어 등 의학 황 반 변성 (AMD), 망막 화, 중심 장 액 망막 질환 각 질병 특성 지역화 fovea, 흑점, 또는 망막 주변1,3, 설명 4,6. 여기, 우리가 어떻게 다른 망막 영역 수 수 독립적으로 샘플링 하지를 보여주는 방법 제시. 이 방법의 전반적인 목표 proteomic 분석에 대 한 인간의 망막 및 RPE 맥락 막 시야, 황 반, 및 주변 지역에서 조직 샘플의 컬렉션에 대 한 신뢰할 수 있는 가이드를 제공 하는 것입니다. 개발 및이 기술의 사용에 대 한 근거는 이러한 특정 망막 지역, 중요 한 분자 통찰력이이 지역의 생리 및 병 태 생리 기능에 기록 될 수 있습니다의 proteomic 분석을 통해.
이 접근에는 상대 지역 질병 감정, proteomic 기초를 공개 하 고 새로운 구체적인 치료 목표의 식별을 용이 하 게 약속 드립니다. 실제로, 유리 체 및 망막에와 함께 자사의 상호 작용의 proteomic 조사 분자 조성과 건강 하 고 병에 걸리는 조직5,,78 의 기능에 중요 한 통찰력 제공 , 9 , 10 , 11 , 12 , 그러나 13. 별개의 망막 영역의 명확한 비교 proteomic 분석 결여 되는. 기술은 안정적이 고 재현 가능한 조직 컬렉션 접근으로 다른 방법 이상의 장점을 제공이 많이 필요한 연구를 지원 하기 위해 도움이 됩니다. 더 많은 그래서, 방식은 매우 접근 하 고, 표준 사이즈와 쉽게 사용할 수 있는 조직 펀치 생 검 도구 활용 합니다. 우리의 기술 강조 적절 한 수집 및 proteomic 처리, 단백질 안정성과 성능 저하에 대 한 중요 한 고려 사항에 대 한 조직의 저장 합니다. 따라서,이 방법은 proteomic 요인의 다운스트림 분자 분석을 고려 하 고 조사에 가장 적합 합니다.
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Protocol
이 연구는 아이오와의 대학에 의해 승인 되었다 ' s 기관 검토 위원회와 헬싱키의 선언에 명시 된 신조에 고착.
1. Foveal 및 황 반 생 검 펀치
- 오픈 및 나비 인간의 눈, 그것은 조직의 4 별도 플랩의 이전 게시에 설명 된 대로 구성 되어 그런
- . 5
- butterflied 육안 페 트리 접시에 배치와 함께 시작, 4 m m 펀치 생 검 도구는 fovea에 센터, 누르고는 fovea 주위 절 개를 만든 때까지 부드럽게 롤.
- 다음, 중심 및 망막의 아케이드 내 8 m m 피부 펀치 생 검 도구를 누르고, 부드러운 압력을 적용 및 압 연 하 여 황 반 주위 절 개를 생성 합니다. 이 조직 둘러싼 첫 번째의 두 번째, 외부 반지를 생산할 예정 이다.
2. 주변 망막 생 검 펀치
아케이드 밖에 주변 망막에서 펀치의 시리즈를 만들기 위하여- 사용 4 mm 피부 펀치 생 검 도구. 여기, 각 사분면 플랩에 대 한 두 개의 펀치를 확인.
참고: 모든 펀치 만들어집니다, 눈 fovea 및 망막, 대표 센터, 2 개의 동심 펀치를 가질 것이 고 두 각 플랩 총의 기지에서 펀치 후 8 펀치 주변 망막에서.
3. Fovea 및 망막 생 컬렉션
- 조직 완충, 이제는 별도 microfuge 관에 모든 조직 생 검을 수집 하 고 액체 질소를 사용 하 여 다운스트림 처리에 대 한 고정. 활용도까지-80 ° C에서 모든 샘플을 저장.
- 곡선된 0.12 Colibri 집게를 사용 하 여 망막 fovea의 반투명 직물의 가장자리를 잡아. 수집, 상승 하 고 근본적인 RPE 맥락 막에서 시야 조직 분리.
- 에서는 마찬가지로 0.12 Colibri 집게를 사용 하 여 반투명 망막 직물의 외부 반지를 파악. 조직 내부 또는 인접 조직에 연결 아직도, Westcott가 위를 사용 하 여 신중 하 게 그냥 망막 구성 요소를 캡처하는 펀치에 포함 된 모든 시 신경 조직을 멀리 해 부 가장자리 트림.
4. 주변 망막 컬렉션
- 곡선된 0.12 Colibri 집게를 사용 하 여 부드럽게 근본적인 RPE 맥락 막 및 개별 microfuge 관 내에서 주변 망막 조직 디스크 구분.
- 잔여 유리 체 젤의 경우 리프트 젤 멀리 분리 하는 겸 자 사용 망막 직물의 수집 하기 전에 가능한 만큼 많이. 일단 망막 제거 된 안료 RPE 맥락 막 아래 남아.
5. 시야와 망막 RPE 맥락 막 컬렉션
- 제거 fovea의 영역 아래 어두운 RPE 맥락 막 조직의 가장자리 파악 하 사용은 0.12 Colibri 집게. 조심 스럽게 sclera 및 수집에서이 조직 분리.
- 어두운 RPE 맥락 막 조직의 제거 된 황 반 지역 기본 외부 링의 가장자리를 잡고 같은 집게를 사용 하 여. 조심 스럽게 반지 주위 다른 지점에서 가장자리를 파악 하 고 가볍게 당겨 여는 sclera에서이 조직을 구분 합니다. 결국, RPE 맥락 막 조직의 반지 dislodged 됩니다 및 수집 될 수 있습니다.
참고: 반대 손으로 보조 겸 RPE 맥락 막 조직을 제거 하는 동안 조작에 유용할 수 있습니다. 망막 조직 처럼 웨스 콧은 위 펀치 도구를 사용 하 여 완전히 베 하지는 모든 조직을 제거에 도움을 사용할 수 있습니다.
6. 주변 망막 RPE 맥락 막 컬렉션
- 0.12 Colibri 집게를 사용 하 여 벗 겨 8 주변 펀치 영역에서 RPE 맥락 막.
- 이전, RPE 맥락 막 조직 microfuge 관에서 놓고 다운스트림 처리에 대 한 액체 질소를 사용 하 여 고정 합니다. 활용도까지-80 ° C에서 모든 샘플을 유지.
7. 해 부가 위
참고: 펀치 생 검 칼 날이 무딘 또는 펀치 생 검 도구는 충분히 열심히 강요 하지, 있을 수 있습니다 하지 맵시 주변 조직.
- 이러한 경우 멀리 당겨 조직을 가능한 한 많이, 다음 Westcott가 위를 사용 하 여 장식 하 고 분리.
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Representative Results
망막 및 맥락 막의 RPE 조직 개별 조사에 맞게 다양 한 방법으로 처리할 수 있습니다. 수령 후, 연구원 망막 및 RPE 맥락 막 시야 지역, 외부 망막 및 주변 망막 (그림 1)에서 조직 샘플을가지고 것입니다. 특히, 시야 지역 펀치는 fovea, parafovea, 및 인접 한 perifovea의 작은 금액을 포함 됩니다. 황 반 펀치 perifoveal 지역 뿐만 아니라 인접 한 근처 주변 지역의 작은 금액 나머지 포함 됩니다. 마지막으로, 주변 펀치 샘플 중간 주변 멀리 주변 지역. 대표적인 실험에서 조직 샘플 트립 신 소화 했다 고 단백질 함량 (그림 2A)을 시각화 하기 위해 1 차원 SDS 페이지를 사용 하 여 분석. 이 분석의 결과 것 망막의 여러 지역 중에서 독특한 단백질을 좋습니다. 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS)6 에 의해 분석은 제대로 rhodopsin, 매우 풍부 하 고 독특한 망막 단백질에서에서 펩 티 드를 확인. Macular 지역에서 얻은 대표적인 rhodopsin 스펙트럼 그림 2B에 표시 됩니다. 단백질 함량의 추가 분석 망막의 해부학 고유 영역의 분자 기능에 대 한 통찰력을 제공할 것입니다. 해 부, 신중 하 게 수행 되지 않습니다 및 망막 RPE 맥락 막에서 제대로 분리 되지는 경우,이 두 조직 간의 단백질 함량 차이 뚜렷한 되지 않습니다.
그림 1 . 망막 영역. 건강 한 인간의 망막의 대표 이미지입니다. 점선 원으로 다른 망막 영역 강조 표시 하 고 지역 펀치 생 검에 의해 샘플링 단단한 원형으로 표시 됩니다. 점선된 원 대표 fovea, parafovea, 및 perifovea (중심에서 바깥쪽으로 여행), 노란색 고체 원 동안 시야 영역 노란색 4mm 시야 펀치를 나타냅니다. 파란색 점선된 원 해부학 황 반 지역을 나타내고 파란색 단색 원 8 m m 황 반 펀치를 나타냅니다. 마지막으로, 분홍색 점선된 원 망막 주변 지역 (중반 P)까지 주변 지역 (멀리 P) 중간 근처 망막 주변 지역을 (근처 P)를 나타냅니다. 핑크 솔리드 원 중반 P와 P까지 영역을 포함 하는 4 m m 주변 망막 펀치를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 망막 단백질의 id. 주변 망막, 황 반, 및 시야 영역 biopsied proteomic 분석을 위해 사용 했다. (A) One-Dimensional SDS 페이지와 실버 얼룩 시각 망막 각 지역에 있는 단백질. (B) 망막 조직 샘플 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) 분석 대상이 됐다. 표시 된 대표적인 스펙트럼 macular 지역에서 확인 된 rhodopsin 단백질입니다. 이 스펙트럼 망막에서 확인 된 5 개의 독특한 rhodopsin 펩 티 드 중 하나를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
조직 후 컬렉션, 샘플 처리 및 치료입니다 중요 한 고려 사항14. 액체 질소에 보존은 선호 화학 기정에 후자 손상 될 수 있습니다 다운스트림 분석을 기울일 수 있는 단백질 구조. 또한, 액체 질소 보존 샘플의 포함 하지 않는 방법을 선호입니다. 특히, 페 러 외. 4 ° C 또는 0 ° C15에 저장에 비해 상 온에서 보존 하는 뇌 샘플 사이 단백질 수준에서 큰 차이가 나타났다. 또한, 그것은 어는 단백질 수준 및 포스트 번역 상 수정16,17를 변경 하기 전에 특정 화학 및 물리 치료로 샘플을 처리할 때 주의 해야 하는 것이 중요. 이 샘플의 의도 다운스트림 분석 고려의 중요성을 강조. 별도로, 사후 타이밍 수확 하는 조직 수준 및 특정 단백질의 안정성에 영향을 미칠 수 있는 또 다른 요인은 이다. 저하는 시간 사후 및 저장 온도18,,1920에 따라 샘플 프로테옴을 발생할 수 있습니다. 또한, 질병 조직 사이의 건강 한 조직, 내부 제어의 사용 하 여 같은 시간 사후 저하에 대 한 제어 결정적 이다. 타이밍 요소를 무시 하는 경우 저하 결과 왜곡 수 있습니다. 일반적으로 빨리 조직 분석된-사후, 연구 결과 변경 하는 저하에 대 한 더 적은 위험입니다.
여러 프로시저 수정 더 구체적인 연구 질문에 맞게이 프로토콜을 만들 수 있습니다. 한 수정은 다른 크기 피부 펀치 생 검 도구 다른 양의 조직 샘플을 수집 하는 데 사용할 수 있습니다. 더 적은 또는 더 많은 조직 다운스트림 proteomic 수량 또는 관심사의 특정 단백질의 안정성에 따라 처리에 대 한 필요할 수 있습니다. 또한, 조직 펀치 생 검의 크기 RPE 맥락 막과 망막의 특정 지역 것입니다 샘플링 하는 조잡 한 방법을 확인할 수 있습니다. 예를 들어 pathologic 조직의 특정, 좋은 지역 필요한 경우, 작은 피부 펀치 생 검 도구 필요할 수 있습니다. 또한, 섹션 그것 펀치 생 검 도구 기능 떨어지면 너무 괜찮아요, 서 필요한21을 수 있습니다. 또한, 해 범위 또는 돋보기, 같은 시각 도구를 사용 하 여 수 있습니다 원조 조직 컬렉션 프로세스-특히 작은 세계 크기의 경우에에서와 같은 유아 눈 조직으로.
마지막으로, 그것은 그 동안이 기술을 그룹 RPE 및 맥락 막 조직 단일 복합물으로,이 조직 구분 분자로 및 기능적으로 중요 한. 실제로, proteomes는이 두 조직 사이 현저 하 게 다르다. 그러나, 그럼에도 불구 하 고 이러한 차이, RPE 및 맥락 막 남아 해부학, 기능, 및 임상2,,67연결. 따라서이 키 구별 모든 다운스트림 proteomic 분석 RPE 맥락 막 복잡 한 마음에 부담 한다.
이 원고는 간단, 신뢰할 수 있는, 낮은 오버 헤드가 접근 fovea, 흑점, 및 주변 망막 인간의 눈에 RPE 맥락 막 조직 proteomic 분석에 대 한 샘플 컬렉션을 보여 줍니다. 수 사관의 재량에, 수정 컬렉션 프로세스 또는 조직 처리, 사전 컬렉션 의도 다운스트림 proteomic 분석에 따라 후 컬렉션을 만들 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언.
Acknowledgments
VBM은 NIH 교부 금 [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698, R21AG050437], 도리스 듀크 자선 재단 보조금 지원 #: 2013103, 및 연구를 방지 실명 (RPB), 뉴욕, 뉴욕. MT 및 GV는 NIH에서 지원 T32GM007337를 부여.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-34 | |
| 8-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-37 | |
| 0.12 Colibri Forceps | Stephens Instruments | S5-1145 | |
| Wescott Scissors | Sklar Surgical Instruments | 64-3146 | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | #022364111 | 1.5 mL |
| Liquid Nitrogen | Praxair, Inc. | 7727-37-9 [R] |
References
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