Summary
A retina humana é composta de regiões funcionalmente e molecularmente distintas, incluindo a fóvea, mácula e retina periférica. Aqui, descrevemos um método usando o soco de biópsias e remoção manual das camadas de tecido do olho humano para dissecar e coletar estas regiões distintas da retina para análise proteômica a jusante.
Abstract
A retina humana é composta da neuroretina sensorial e o epitélio pigmentado da retina subjacente (RPE), que é complexado com firmeza à camada vascular da coroide. Diferentes regiões da retina são anatomicamente e molecularmente distintas, facilitando as funções originais e demonstrando o diferencial susceptibilidade à doença. Análise proteômica de cada uma destas regiões e camadas pode fornecer insights vitais sobre o processo molecular de muitas doenças, incluindo Age-Related Degeneração Macular (AMD), diabetes mellitus e glaucoma. No entanto, separação de camadas e regiões da retina é essencial antes de análise proteômica quantitativa pode ser realizado. Aqui, descrevemos um método para dissecção e coleção de regiões da retina central, periféricas e maculares e subjacentes RPE coroide complexo, envolvendo regional soco biópsias e remoção manual das camadas de tecido do olho humano. Unidimensional de SDS-PAGE, bem como análise de proteomic a jusante, tais como líquida espectrometria de massa em tandem-cromatografia (LC-MS/MS), pode ser usado para identificar proteínas em cada camada da retina dissecada, revelando moleculares biomarcadores para doenças da retina.
Introduction
A retina, RPE e coroide são tecidos complexos que demonstram diferenças regionais importantes na expressão de proteínas, função fisiológica e patológica suscetibilidades1,2. Por exemplo, doenças como a Degeneração Macular Age-Related (AMD), retinite pigmentosa e retinopatia serosa central cada demonstram característica localização dentro da fóvea, mácula ou retina periferia1,3, 4,6. Aqui, apresentamos um método demonstrando como distinta da retina regiões podem ser degustadas de forma independente. O objetivo geral deste método é fornecer um guia confiável para coleta de amostras de tecido da região macular, Central e periférica da retina humana e RPE coroide para análise proteômica. A justificativa para o desenvolvimento e a utilização desta técnica é que através da análise de proteomic destas regiões específicas da retina, importante introspecções moleculares podem ser adquiridas para as funções fisiológicas e fisiopatológicas destas regiões.
Esta abordagem promete revelar a base de proteomic para suscetibilidades doença regional relativo e para facilitar a identificação de novos alvos terapêuticos específicos. Com efeito, proteomic investigações sobre o vítreo e suas interações com a retina forneceu insights-chave na composição molecular e função dos tecidos saudáveis e doentes5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. no entanto, análises de proteomic nítida de distintas regiões da retina são escassos. A técnica vai ajudar a apoiar estes estudos muito necessária, proporcionando vantagens sobre outros métodos demonstrando uma abordagem de coleta de tecido confiável e reprodutível. Mais ainda, a abordagem é muito acessível, aproveitando-se do ponche de tecido tamanho padrão e prontamente disponíveis a ferramentas de biópsia. Nossa técnica enfatiza a recolha e armazenamento de tecidos para proteomic processamento, fazendo considerações importantes para a estabilidade da proteína e degradação. Assim, este método é mais adequado para os investigadores a jusante análise molecular de proteomic factores a considerar.
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Protocol
este estudo foi aprovado pela Universidade de Iowa ' s Conselho de revisão institucional e adere aos princípios estabelecidos na declaração de Helsinque.
1. Foveal e Macular soco biópsia
- aberto e borboleta olho humano, que consiste em 4 diferentes retalhos de tecido, conforme descrito em uma publicação anterior. 5
- começando com um borboleta olho humano colocado em uma placa de Petri, centralize uma ferramenta de biópsia do perfurador de 4 mm sobre a fóvea, pressione para baixo e role suavemente até que uma incisão é feita ao redor da fóvea.
- Em seguida, gerar uma incisão ao redor da mácula centralização e pressionando para baixo uma ferramenta de biópsia do perfurador de 8 mm da pele dentro das arcadas do macula, aplicando uma pressão suave e rolamento. Isto produzirá um anel exterior, segundo do tecido circundante a primeira.
2. Soco de biópsia da retina periférica
ferramenta de biópsia- uso o soco de 4 milímetros da pele para fazer uma série de socos na retina periférica, apenas fora da arcada. Aqui, fazer dois socos para cada aba quadrante.
Nota: Depois de todos os golpes são feitos, o olho terá dois socos concêntricos no centro, representando a fóvea e macula, e dois socos na base de cada aba-totalizando 8 socos na retina periférica.
3. Fóvea e coleção de biópsia Macula
- como o tecido está agora pronto para coleta, coletar todas as biópsias de tecido em tubos de microcentrífuga separado e congelamento com nitrogênio líquido para processamento a jusante. Armazenar todas as amostras a-80 ° C até utilização.
- Use uma pinça de Colibri 0.12 curvo para pegar as bordas do tecido translúcido da fóvea da retina. Para coletar, elevar e separar o tecido central do RPE-coroide subjacente.
- Da mesma forma, use a pinça Colibri 0,12 para agarrar o anel exterior do tecido translúcido mácula. Se o tecido ainda está anexado ao tecido subjacente ou adjacente, usar um par de tesoura Westcott para aparar cuidadosamente a borda, capturando apenas o componente da retina e dissecando afastado qualquer tecido de nervo óptico incluído no ponche.
4. Coleção de Retina periférica
- usar os fórceps de Colibri 0,12 curvados delicadamente, separar os discos de tecido da retina periférica da RPE coroide subjacente e coloque dentro de tubos de microcentrífuga individuais.
- No caso do gel vítreo residual, use a pinça para levantar e separar o gel fora tanto quanto possível antes da coleta do tecido retinal. Uma vez que a retina foi removida, a pigmentada RPE-coroide permanece abaixo.
5. Central e Macula RPE coroide coleção
- uso a 0,12 Colibri fórceps para apreender as bordas do tecido RPE coroide escuro que se encontra abaixo da área da fóvea removida. Separe com cuidado este tecido da esclera e coletar.
- Usando a pinça mesma, segure as bordas do anel externo de tecido de RPE coroide escuro subjacente a área macular removida. Separe com cuidado este tecido da esclera, segurando as bordas em pontos diferentes ao redor do anel e puxando levemente. Eventualmente, o anel de tecido RPE coroide vai ser desalojado e podem ser coletado.
Nota: Fórceps secundário na mão oposta pode ser útil em manipular o tecido RPE coroide durante a remoção. Como o tecido da retina, Wescott tesoura pode ser usada para auxiliar na remoção de qualquer tecido que não foi totalmente incisão usando a ferramenta do perfurador.
6. Coleção de RPE coroide Retina periférica
- usar a pinça Colibri 0,12 para descascar o RPE-coroide nas 8 áreas periféricas soco.
- Como anteriormente, coloque o tecido de RPE coroide em tubos de microcentrífuga e congelamento com nitrogênio líquido para processamento a jusante. Manter todas as amostras a-80 ° C até utilização.
7. Dissecação de tesoura
Nota: se a lâmina de biópsia do perfurador é maçante ou a ferramenta de biópsia do perfurador é empurrada não dura o suficiente, pode não haver um Clean-Cut o tecido circundante.
- Nestes casos, afastar o tecido tanto quanto possível e em seguida, use tesoura Westcott para aparar e separar.
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Representative Results
Tecido de RPE coroide e da retina podem ser processadas de várias maneiras, de acordo com uma investigação individual. Após a coleta, o pesquisador possuirá amostras da retina e RPE coroide tecido da região central, exterior mácula e retina periférica (Figura 1). Especificamente, o soco de região central incluirá a fóvea, o parafovea e uma pequena quantidade do perifovea adjacente. O soco macular inclui o restante da região perifoveal, bem como uma pequena quantidade da região adjacente de perto-periférico. Finalmente, os socos periféricos da amostra nas regiões mid periféricos e distante-periférico. Em um experimento de representante, amostras de tecido foram tripsina-digerido em analisaram utilizando SDS-PAGE unidimensional para visualizar o conteúdo de proteína (Figura 2A). Os resultados desta análise sugerem proteínas distintas entre as diferentes regiões da retina. Análise por líquido espectrometria de massa em tandem-cromatografia (LC-MS/MS)6 devidamente identificado peptídeos da rodopsina, uma proteína altamente abundante e exclusivo da retina. Um espectro de rodopsina representativos obtido da região macular é mostrado na Figura 2B. Uma análise mais aprofundada do conteúdo de proteína irá fornecer insights sobre as funções moleculares das regiões anatomicamente distintas da retina. No caso em que a dissecação não é executada com cuidado, e a retina não é devidamente separadoda do RPE-coroide, diferenças no teor de proteína entre esses dois tecidos não será perceptíveis.
Figura 1 . Regiões da retina. Uma imagem representativa de uma retina humana saudável. Diferentes regiões da retina são realçadas por círculos pontilhados, e regiões amostradas pelo soco biópsias são indicadas por círculos sólidos. O amarelo círculos pontilhados representam a região central, incluindo a fóvea, parafovea e perifovea (viajando para fora do centro), enquanto o círculo amarelo sólido representa o soco de central de 4 mm. O círculo azul pontilhado representa a região macular anatômica, enquanto o círculo azul sólido representa o soco de macular de 8 mm. Finalmente, os círculos pontilhados rosa representam a região periférica da retina (perto de P), quase meados região periférica da retina (meados P) e a região periférica longe (longe P). Os círculos sólidos rosa representam os socos de retina periférica de 4 mm, que contêm as regiões Mid P e P longe. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Identificação de proteínas Retinal. As regiões central, mácula e retina periférica foram biopsiados e usado para análise proteômica. (A) One-Dimensional SDS-PAGE e coloração prata visualizaram proteínas em cada região da retina. (B) amostras de tecido da Retina foram objecto de análise de líquido espectrometria de massa em tandem-cromatografia (LC-MS/MS). O representante espectro mostrado é da proteína rodopsina identificada na região macular. Este espectro representa um dos cinco únicos rodopsina peptides identificados na mácula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Depois de tecido recolha, manipulação de amostra e tratamento são cruciais considerações14. Preservação em nitrogênio líquido é preferida por fixação química, como o último pode resultar em danos à estrutura da proteína, que pode distorcer a análise a jusante. Além disso, a preservação de nitrogênio líquido é preferencial para métodos que não envolvem o congelamento de amostras. Notavelmente, Ferrer et al mostraram diferenças significativas nos níveis de proteína entre amostras de cérebro preservadas a 4 ° C ou temperatura ambiente, em comparação com aqueles armazenados em 0 ° C15. Além disso, é importante ter cuidado quando o processamento de amostras, como tratamento químico e físico específico antes de congelamento tem potencial para alterar os níveis de proteína e modificações borne-translational16,17. Neste ponto enfatiza a importância de considerar a análise se destina a jusante das amostras. Separadamente, tempo de post-mortem do tecido colheita é outro fator que pode afetar os níveis e estabilidade de proteínas específicas. Degradação pode ocorrer para o amostra proteome dependendo do tempo post mortem e armazenamento temperatura18,19,20. Além disso, controlar para degradação post-mortem de tempo, como pelo uso de controles internos entre doença tecido e tecido saudável, é crucial. Se o fator tempo é ignorado, degradação poderia distorcer os resultados. Como regra geral, quanto mais cedo o tecido é analisada post mortem, o menos risco de degradação de alterar os resultados do estudo.
Várias modificações processuais podem ser feitas para este protocolo para melhor se adaptar uma pergunta de pesquisa específicos. Uma modificação é que tamanho diferente pele soco biópsia ferramentas podem ser usadas para coletar quantidades diferentes de amostras de tecido. Mais ou menos tecido pode ser necessário para jusante proteomic processamento dependendo da quantidade ou da estabilidade das proteínas específicas de interesse. Além disso, o tamanho da biópsia tecido soco pode determinar como grosseiramente as regiões específicas da retina ou coroide-RPE vão amostrar. Por exemplo, se regiões específicas, fina do tecido patológico são necessárias, pequenas ferramentas de biópsia da pele soco podem ser necessária. Além disso, se uma seção é tão fina que deixa cair abaixo os recursos das ferramentas de biópsia do perfurador, microdissection pode ser necessário21. Além disso, o uso de recursos visuais, tais como uma dissecação escopo ou lupa, pode ajudar a coleção de tecido processo-particularmente em casos de tamanhos menores do globo, tais como com tecido ocular infantil.
Finalmente, é importante observar que essa técnica agrupa o RPE e tecidos coroide como um complexo único, estes tecidos mantém molecularmente e funcionalmente distintos. Na verdade, os proteomes diferem marcadamente entre estes dois tecidos. No entanto, apesar que dessas diferenças, o RPE e coroide permanecem anatomicamente, funcionalmente e clinicamente ligados2,6,7. Assim, qualquer análise proteômica a jusante do complexo RPE coroide deve ter em mente esta distinção fundamental.
Este manuscrito demonstra uma abordagem simples, confiável e de baixa sobrecarga para coleta de amostra para análise proteômica da fóvea, macula e retina periférica e tecido RPE coroide nos olhos humanos. A critério do investigador, modificações podem ser feitas para o processo de coleta ou tecido manipulação, pré- coleção e pós-coleção, dependendo da análise pretendida proteomic a jusante.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
VBM é suportada por concessões de NIH [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 e R21AG050437], Doris Duke Charitable Foundation Grant #: 2013103 e pesquisa para evitar cegueira (RPB), New York, NY. MT e GV são suportados pelo NIH conceder T32GM007337.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-34 | |
| 8-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-37 | |
| 0.12 Colibri Forceps | Stephens Instruments | S5-1145 | |
| Wescott Scissors | Sklar Surgical Instruments | 64-3146 | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | #022364111 | 1.5 mL |
| Liquid Nitrogen | Praxair, Inc. | 7727-37-9 [R] |
References
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