Summary
Den mänskliga näthinnan består av funktionellt och molekylärt distinkta regioner, inklusive fovea, gula fläcken och perifera näthinnan. Här, beskriver vi en metod där punch biopsier och manuellt borttagande av vävnad lager från ett mänskligt öga att dissekera och samla dessa olika retinala regioner för nedströms proteomiska analys.
Abstract
Den mänskliga näthinnan består av den sensoriska neuroretina och underliggande retinal pigmenterade epitel (RPE), vilket är ordentligt komplex i vaskulär koroidea skiktet. Olika regioner i näthinnan är anatomiskt och molekylärt distinkta, underlätta unika funktioner och demonstrera differentiell känslighet för sjukdom. Proteomiska analys av var och en av dessa regioner och lager kan ge viktiga insikter i den molekylära processen många sjukdomar, inklusive åldersrelaterad makula Degeneration (AMD), diabetes mellitus och glaukom. Separation av retinal regioner och lager är dock viktigt innan kvantitativa proteomiska analys kan åstadkommas. Här, beskriver vi en metod för dissektion och samling av foveal, makulaödem och perifera retinal regioner och underliggande RPE-åderhinnan complex, som omfattar regionala punch biopsier och manuellt borttagande av vävnad lager från ett mänskligt öga. Endimensionella SDS-PAGE samt nedströms proteomiska analys, till exempel liquid chromatography-tandem masspektrometri (LC-MS/MS), kan användas att identifiera proteiner i varje dissekerade näthinnans skikt, avslöjar molekylära markörer för retinal sjukdom.
Introduction
Näthinnan, RPE, och åderhinnan är komplexa vävnader som visar viktiga regionala skillnader i proteinuttryck, fysiologisk funktion och patologiska mottaglighet1,2. Till exempel påvisa sjukdomar såsom åldersrelaterad makula Degeneration (AMD), retinitis pigmentosa och central seröst retinopati varje karakteristiska lokalisering inom fovea, gula fläcken eller näthinnan periferin1,3, 4,6. Här presenterar vi en metod som visar hur distinkta retinal regioner kan avsmakas självständigt. Det övergripande målet med denna metod är att ge en pålitlig guide för samling av vävnadsprover från foveal, makulaödem och perifera regioner av mänskliga näthinnan och RPE-åderhinnan för proteomiska analys. Den logiska grunden för utveckling och användning av denna teknik är att genom proteomiska analys av dessa särskilda retinal regioner, viktiga molekylära insikter kan vinnas fysiologiska och patofysiologiska funktioner i dessa regioner.
Denna metod lovar att avslöja proteomiska grunden för relativa regionala sjukdom mottaglighet och för att underlätta identifiering av nya specifika terapeutiska mål. Faktiskt, proteomiska utredningar av glaskroppen och dess interaktioner med näthinnan har gett viktiga insikter i den molekylära sammansättning och funktion av frisk och sjuk vävnad5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. dock tydlig jämförande proteomiska analyser av olika retinala regioner saknas. Tekniken hjälper till att stödja dessa välbehövliga studier, som ger fördelar jämfört med andra metoder genom att visa en tillförlitliga och reproducerbara vävnad samling strategi. Mer så, tillvägagångssättet är mycket lättillgängligt, dra nytta av standardstorlek och lättillgängliga vävnad punch biopsi verktyg. Vår teknik betonar lämplig insamling och lagring av vävnader för proteomiska bearbetning, att göra viktiga överväganden för protein stabilitet och nedbrytning. Således, denna metod är lämpligast för utredarna överväger nedströms molekylär analys av proteomiska faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
denna studie godkändes av University of Iowa ' s institutionella Review Board och följer de grundsatser som anges i Helsingforsdeklarationen.
1. Foveal och Macular biopsi Punch
- öppna och fjärilen mänskligt ögat, så att den består av 4 separata klaffar av vävnad, som beskrivs i en tidigare publikation. 5
- börjar med en butterflied mänskliga ögat som placeras i en petriskål, centrerar ett 4 mm punch biopsi verktyg över fovea, tryck ner och rulla försiktigt tills ett snitt runt fovea.
- Generera nästa, ett snitt runt gula fläcken av centrering och trycka ner en 8-mm huden punch biopsi verktyg inom gallerierna av gula fläcken, mild påtryckningsmedel och rullande. Detta kommer att producera en andra, yttre ring av vävnaden som omger första.
2. Perifer Retinal biopsi Punch
- användning 4 mm huden punsch biopsi verktyg för att göra en serie av slag i den perifera näthinnan, strax utanför arkaden. Här göra två slag för varje kvadrant flap.
Obs: Efter alla stansar är gjorda, ögat kommer att ha två koncentriska stämplingar i centrera, som företräder fovea och gula fläcken, och två slag vid basen av varje flik-totalt 8 slag i den perifera näthinnan.
3. Fovea och makula biopsi samling
- som vävnaden är nu redo för insamling, samla alla vävnadsbiopsier i separat microfuge rör och frysa med flytande kväve för nedströms behandling. Lagra alla prover vid-80 ° C tills utilization.
- Använda en tång med böjda 0,12 i Colibri att ta tag i kanterna av den genomskinliga vävnaden i näthinnans fovea. Samla in, lyfta och separera foveal vävnaden från underliggande RPE-åderhinnan.
- Likaså använder 0,12 Colibri tången för att förstå den yttre ringen av genomskinlig makula vävnad. Om vävnaden är fortfarande kopplad till underliggande eller intilliggande vävnad, använda ett par Westcott sax att försiktigt trimma kanten, fånga bara komponenten retinal och dissekera bort någon synnerven vävnad ingår i punsch.
4. Perifera näthinnan samling
- använda böjda 0,12 Colibri tången försiktigt separera perifera näthinnevävnad skivorna från underliggande RPE-åderhinnan och inom enskilda microfuge tuber.
- När det gäller kvarstående glaskroppen gel, använda tången för att lyfta och separera gelen bort så mycket som möjligt innan samling av retinala vävnaden. När näthinnan har tagits, pigmenterade RPE-åderhinnan förblir nedan.
5. Foveal och makula RPE-åderhinnan samling
- användning av 0,12 Colibri pincett att ta tag i kanterna av mörka RPE-åderhinnan vävnad som ligger under området för borttagna fovea. Försiktigt separera denna vävnad från sklera och samla.
- Använder samma tången, ta tag i kanterna av den yttre ringen av mörka RPE-åderhinnan vävnad underliggande borttagna macular området. Försiktigt separera denna vävnad från sklera genom att ta tag i kanterna på olika punkter runt ringen och lätt dra. Så småningom ringen av RPE-åderhinnan vävnad kommer att rubbas och kan samlas.
Obs: Sekundära tången i motsatta handen kan vara till hjälp i att manipulera RPE-åderhinnan vävnaden under borttagning. Som retinala vävnaden, Wescott sax kan användas för att hjälpa till att ta bort någon vävnad som inte var fullt anskäras med verktyget punch.
6. Perifera näthinnan RPE-åderhinnan samling
- Använd 0.12 Colibri tången för att skala bort RPE-åderhinnan i områdena perifera punch 8.
- Som tidigare placera RPE-åderhinnan vävnaden i microfuge rör och frysa med flytande kväve för nedströms behandling. Hålla alla prover vid-80 ° C fram till användning.
7. Hobbyverktyg dissektion
Obs: om punch biopsi bladet är tråkig eller verktyget punch biopsi trycks inte tillräckligt hårt, det kan inte finnas en clean-cut omgivande vävnad.
- i dessa fall dra vävnaden bort så mycket som möjligt, och sedan använda Westcott sax för att trimma och separata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Retinal och RPE-åderhinnan vävnad kan behandlas på olika sätt för att passa en enskild undersökning. Efter samling, kommer forskaren besitter prover av retinal och RPE-åderhinnan vävnad från foveal regionen, yttre makula och perifera näthinnan (figur 1). Specifikt, kommer att foveal regionen stansen omfatta fovea, parafovea och en liten mängd av den intilliggande perifovea. Macular punsch innehåller resten av regionen perifoveal samt en liten mängd av intilliggande nära-perifera regionen. Slutligen, prova de perifera stämplingar mitten perifera och långt-perifera regionerna. I en representativ experiment, vävnadsprover var trypsin-rötas och analyseras med endimensionella SDS-PAGE för att visualisera proteinhalt (figur 2A). Resultaten av denna analys föreslår distinkta proteiner bland de olika regionerna av näthinnan. Analys av flytande kromatografi-tandem masspektrometri (LC-MS/MS)6 identifierade korrekt peptider från rhodopsin, ett mycket rikligt och unika näthinnan protein. Ett representativt rhodopsin spektrum erhållits från macular regionen visas i figur 2B. Ytterligare analys av proteininnehållet ger inblick i de molekylära funktionerna anatomiskt distinkta regioner av näthinnan. Ifall dissektion utförs inte noggrant och näthinnan är inte ordentligt skild från RPE-åderhinnan, kan skillnader i proteinhalt mellan dessa två vävnader inte märkbara.
Figur 1 . Retinal regioner. En representativ bild av en hälsosam mänskliga näthinnan. Olika retinala regioner markeras av prickade kretsar och regioner som ingick i urvalet av punch biopsier indikeras av heldragna cirklar. Den gula prickade cirklar representerar regionen foveal, inklusive fovea, parafovea och perifovea (resor utåt från centrum), medan den gula solid cirkeln representerar 4 mm foveal punsch. Den blå streckade cirkeln representerar anatomiska macular regionen, medan den blå solid cirkeln representerar 8 mm macular punsch. Slutligen representerar de rosa prickig cirklarna nära retinal perifera området (nära P), mitten av retinal perifer region (mitten av P), och långt perifer region (långt P). De rosa heldragna cirklarna representerar de 4 mm perifera näthinnan stämplingar, som innehåller Regionkommittén Mid P och långt P. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Identifiering av Retinal proteiner. Perifera näthinnan och gula fläcken foveal regioner fanns biopsier och användes för proteomiska analys. (A) endimensionella SDS-PAGE och silverfärgning visualiseras proteiner i varje näthinnans regionen. (B) näthinnan vävnadsprover omfattades av liquid chromatography-tandem masspektrometri (LC-MS/MS) analys. Den representativa spektrum visas är av rhodopsin protein identifierats i macular regionen. Detta spektrum utgör en av fem unika rhodopsin peptider identifieras i gula fläcken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Efter vävnad är insamling, provhantering och behandling avgörande överväganden14. Bevarande i flytande kväve är att föredra framför kemiska fixering, som den senare kan resultera i skador på proteinstruktur, som kan förvränga nedströms analys. Dessutom, är flytande kväve bevarande rekommenderad till metoder som inte inbegriper frysning av prover. Särskilt, Ferrer et al. visade signifikanta skillnader i proteinnivåer mellan hjärnan prover bevaras vid 4 ° C eller rumstemperatur, jämfört med de lagras vid 0 ° C15. Dessutom är det viktigt att vara försiktig när prover, som specifik kemisk och fysikalisk behandling innan frysning har potential att förändra proteinnivåer och post-translationella modifieringar16,17. Denna punkt betonar vikten av den avsedda nedströms analysen av prover. Separat, är postmortala tidpunkten för vävnad skörd en annan faktor som kan påverka nivåer och stabilitet av specifika proteiner. Kan försämras till det provet proteomet beroende på tiden efter slakt och lagring temperatur18,19,20. Dessutom är kontrollera för tid efter slakt nedbrytning, såsom genom användning av interna kontroller mellan sjukdom vävnad och frisk vävnad, avgörande. Om den tidpunkt faktorn ignoreras, kan nedbrytning skeva resultat. Som en allmän regel, ju förr är vävnaden analyserade post mortem, mindre risk för nedbrytning till alter studieresultat.
Flera processuella ändringar kan göras till detta protokoll som bättre passar en specifik forskningsfråga. En ändring är att olika storlek hud punch biopsi verktyg kan användas för att samla in olika mängder av vävnadsprover. Mer eller mindre vävnad kan krävas för nedströms proteomiska bearbetning beroende på kvantitet eller stabilitet av specifika proteiner av intresse. Storleken på vävnad punch biopsi kan dessutom bestämma hur grovt de specifika regionerna av näthinnan eller RPE-åderhinnan kommer att provtas. Till exempel om specifika, fina regioner av patologisk vävnad krävs kan mindre hud punch biopsi verktyg behövas. Dessutom om ett avsnitt är så fin att det sjunker under funktionerna i punch biopsi verktyg, kan lokalt vara krävs21. Dessutom, kan användning av visuella hjälpmedel, till exempel en dissekera omfattning eller förstoringsglas, stöd samlingen vävnad processen-särskilt i fall av mindre jordglob storlekar, såsom med infantil okulära vävnader.
Slutligen är det viktigt att notera att medan denna teknik grupper av RPE och koroidea celler som en enda komplex, dessa vävnader förbli molekylärt och funktionellt åtskilda. Faktiskt proteom skiljer sig markant mellan dessa två vävnader. Men samband trots dessa skillnader, RPE och åderhinnan förbli anatomiskt, funktionellt och kliniskt2,6,7. Alltså bör någon nedströms proteomiska analys av RPE-åderhinnan anläggningen ha i åtanke här viktig skillnad.
Detta manuskript visar en enkel, tillförlitlig, låg overhead strategi för provtagning för proteomiska analys av fovea, gula fläcken, och perifera näthinnan och RPE-åderhinnan vävnad i människors ögon. Efter bedömning av prövaren, kan ändringar göras till insamlingen eller vävnad hantering, före samling och efter samling, beroende på avsedda nedströms proteomiska analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter förklarade.
Acknowledgments
VBM är stöds av NIH grants [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 och R21AG050437], Doris Duke Charitable Foundation Grant nr: 2013103, och forskning att förhindra blindhet (RPB), New York, NY. MT och GV stöds av NIH bevilja T32GM007337.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-34 | |
| 8-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-37 | |
| 0.12 Colibri Forceps | Stephens Instruments | S5-1145 | |
| Wescott Scissors | Sklar Surgical Instruments | 64-3146 | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | #022364111 | 1.5 mL |
| Liquid Nitrogen | Praxair, Inc. | 7727-37-9 [R] |
References
- Chirco, K. R., Sohn, E. H., Stone, E. M., Tucker, B. A., Mullins, R. F. Structural and molecular changes in the aging choroid: implications for age-related macular degeneration. Eye (Lond). , (2016).
- Zhang, P., et al. Defining the proteome of human iris, ciliary body, retinal pigment epithelium, and choroid. Proteomics. 16 (7), 1146-1153 (2016).
- Funke, S., et al. Glaucoma related Proteomic Alterations in Human Retina Samples. Sci Rep. 6, 29759 (2016).
- Decanini, A., et al. Human retinal pigment epithelium proteome changes in early diabetes. Diabetologia. 51 (6), 1051-1061 (2008).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of human vitreous body elements for proteomic analysis. J Vis Exp. (47), (2011).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic landscape of the human choroid-retinal pigment epithelial complex. JAMA Ophthalmol. 132 (11), 1271-1281 (2014).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. J Vis Exp. (50), (2011).
- Skeie, J. M., et al. Proteomic analysis of vitreous biopsy techniques. Retina. 32 (10), 2141-2149 (2012).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic interactions in the mouse vitreous-retina complex. PLoS One. 8 (11), e82140 (2013).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M.
- Skeie, J. M., Roybal, C. N., Mahajan, V. B. Proteomic insight into the molecular function of the vitreous. PLoS One. 10 (5), e0127567 (2015).
- Velez, G., et al. Precision Medicine: Personalized Proteomics for the Diagnosis and Treatment of Idiopathic Inflammatory Disease. JAMA Ophthalmol. 134 (4), 444-448 (2016).
- Velez, G., et al. Proteomic analysis of elevated intraocular pressure with retinal detachment. Am J Ophthalmol Case Rep. 5, 107-110 (2017).
- Skeie, J. M., et al. A biorepository for ophthalmic surgical specimens. Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 209-217 (2014).
- Ferrer, I., et al. Brain protein preservation largely depends on the postmortem storage temperature: implications for study of proteins in human neurologic diseases and management of brain banks: a BrainNet Europe Study. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (1), 35-46 (2007).
- Ahmed, M. M., Gardiner, K. J. Preserving protein profiles in tissue samples: differing outcomes with and without heat stabilization. J Neurosci Methods. 196 (1), 99-106 (2011).
- Kanshin, E., Tyers, M., Thibault, P. Sample Collection Method Bias Effects in Quantitative Phosphoproteomics. J Proteome Res. 14 (7), 2998-3004 (2015).
- Crecelius, A., et al. Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE. Proteomics. 8 (6), 1276-1291 (2008).
- Oka, T., Tagawa, K., Ito, H., Okazawa, H. Dynamic changes of the phosphoproteome in postmortem mouse brains. PLoS One. 6 (6), e21405 (2011).
- Nagy, C., et al. Effects of postmortem interval on biomolecule integrity in the brain. J Neuropathol Exp Neurol. 74 (5), 459-469 (2015).
- Mukherjee, S., et al. Proteomic analysis of frozen tissue samples using laser capture microdissection. Methods Mol Biol. 1002, 71-83 (2013).
