Biochemistry

דיסקציה של הרשתית האנושית ואת RPE-Choroid לניתוח פרוטיאומיה מבנית

Published: November 12, 2017 doi: 10.3791/56203

Thiago Cabral*^1,2,7,8, Marcus A. Toral*^3,4, Gabriel Velez^3,4, James E. DiCarlo^1,2, Anuradha M. Gore³, MaryAnn Mahajan³, Stephen H. Tsang^1,2, Alexander G. Bassuk^5,6, Vinit B. Mahajan^3,9

¹Barbara & Donald Jonas Stem Cell Laboratory, and Bernard & Shirlee Brown Glaucoma Laboratory, Department of Pathology & Cell Biology, Institute of Human Nutrition, College of Physicians and Surgeons, Columbia University, ²Edward S. Harkness Eye Institute, New York-Presbyterian Hospital, ³Omics Laboratory, Byers Eye Institute, Department of Ophthalmology, Stanford University, ⁴Medical Scientist Training Program, University of Iowa, ⁵Department of Pediatrics, University of Iowa, ⁶Department of Neurology, University of Iowa, ⁷Department of Ophthalmology, Federal University of Sao Paulo (UNIFESP), ⁸Department of Ophthalmology, Federal University of EspÍrito Santo (UFES), ⁹Palo Alto Veterans Administration, Palo Alto, CA

* These authors contributed equally

Summary

הרשתית האנושית מורכבת מולקולרי ושאיכות אזורים הנבדלים זה מזה, לרבות fovea, macula, הרשתית ההיקפית. כאן, אנו מתארים שיטה באמצעות ניקוב ביופסיות להסרה ידנית של רקמות שכבות מן העין האנושית כדי לנתח ולאסוף אלה אזורים הנבדלים זה מזה ברשתית לניתוח פרוטיאומיה מבנית במורד הזרם.

Abstract

הרשתית האנושית מורכבת את neuroretina חישה ברשתית כבסיס פיגמנט האפיתל (RPE), אשר הוא ומורכבת בחוזקה על השכבה דמית העין כלי הדם. אזורים שונים של הרשתית מופרדים מבחינה אנטומית, מולקולרי, הקלת פונקציות ייחודיות, הוכחת דיפרנציאלית ולרגישות למחלות. ניתוח פרוטיאומיה מבנית מכל סוג של אזורים אלה שכבות יכול לספק תובנות חיוני לתהליך מולקולריים של מחלות רבות, כולל ז ניוון מקולרי (AMD), סוכרת, גלאוקומה. עם זאת, הפרדת רשתית אזורים שכבות חיוני לפני ניתוח כמותי פרוטיאומיה מבנית יכול להתבצע. כאן נתאר שיטת ניתוח ואוסף של אזורים רשתית foveal מקולרי, ציוד היקפי, שבבסיס RPE-דמית העין מורכבת, מעורבים ביופסיות אגרוף אזוריות ו להסרה ידנית של רקמות שכבות של העין האנושית. עמודים מרחביות חד-ממדי, כמו גם ניתוח פרוטיאומיה מבנית במורד הזרם, כגון ספקטרומטר מסה טנדם-כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS/MS), ניתן להשתמש כדי לזהות חלבונים בכל אחת מהשכבות ברשתית גזור, חשיפת סמנים מולקולריים של מחלות רשתית.

Introduction

הרשתית, RPE דמית העין הן רקמות מורכבות המדגימים חשוב הבדלים אזוריים ביטוי חלבון, תפקיד פיזיולוגי ו susceptibilities פתולוגית¹^,². לדוגמה, מחלות כגון ז ניוון מקולרי (AMD), רטיניטיס פיגמנטוזה, רטינופתיה הצפק במרכז כל להדגים לוקליזציה האופיינית בתוך fovea, macula, או רשתית לפריפריה¹^,³^, ⁴^,⁶. כאן, אנו מציגים שיטה הוכחת כמה ברורים רשתית אזורים ניתן לטעום באופן עצמאי. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לספק מדריך אמין עבור אוסף של דגימות רקמות מאזורים foveal מקולרי, היקפי של הרשתית האנושית ואת RPE-choroid לניתוח פרוטיאומיה מבנית. הרציונל שבבסיס פיתוח, שיטה זו היא בעזרת ניתוח פרוטיאומיה מבנית מסוימת ברשתית אזורים אלה, חשוב תובנות מולקולרי עשוי להיות מושגת לתוך הפונקציות הפיזיולוגיות ו pathophysiological של אזורים אלה.

גישה זו מבטיחה לחשוף את הבסיס פרוטיאומיה מבנית מחלה אזורית יחסית susceptibilities, וכדי להקל על זיהוי מטרות טיפוליות ספציפיות חדשות. אכן, חקירות פרוטיאומיה מבנית את הזגוגיות והאינטראקציה שלו עם הרשתית סיפקו תובנות מפתח ההרכב המולקולרי והתפקוד של רקמות בריאים וחולים -⁵^,-⁷^,-⁸ ^, ⁹ ^, ¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³. עם זאת, ברור השוואתי פרוטיאומיה מבנית ניתוחים של אזורים הנבדלים זה מזה ברשתית חסרים. טכניקת יעזור לתמיכה מחקרים אלו נחוצים, במתן יתרונות על פני שיטות אחרות על ידי הפגנת גישה אוסף רקמה לשחזור ואמין. ויותר מכך, הגישה היא מאוד נגיש, ניצול של רקמה בגודל סטנדרטי וזמין אגרוף כלים ביופסיה. הטכניקה שלנו מדגיש את המתאים האיסוף והאחסון של רקמות עבור פרוטיאומיה מבנית, עיבוד, ביצוע שיקולים חשובים עבור חלבון יציבות והשפלה. לפיכך, שיטה זו היא המתאימה ביותר עבור חוקרים בהתחשב במורד הזרם אנליזה מולקולרית של גורמים פרוטיאומיה מבנית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקר זה אושרה על-ידי באוניברסיטת איווה ' s מוסדיים המנהלים ונדבקת העיקרים שנקבעו את הצהרת הלסינקי.

1-Foveal ולהחטיף ביופסיה מקולרי

פתוח, פרפר, העין האנושית. כזה הוא מורכב 4 מדפים נפרדים של רקמות, כפי שמתואר בפרסום הקודם. ⁵
החל מהעין האנושית צלעות מניחים בצלחת פטרי, מרכז כלי ביופסיה אגרוף 4-מ מ מעל fovea לחץ כלפי מטה, לגלגל בעדינות עד חתך מסביב fovea.
הבא, יוצרים חתך באזור המקולה על ידי מרכוז, לוחץ כלי ביופסיה ניקוב עור 8 מ מ בתוך אכסדרות המקולה, הפעלת לחץ עדין מתגלגל. זה יהיה לייצר טבעת שנייה, החיצוני של רקמות המקיפים הראשונים.

2. אגרוף ביופסיה הרשתית ההיקפית

שימוש באיומים 4-מ מ עור כלי ביופסיה לעשות סדרה של אגרופים הרשתית ההיקפית, רק מחוץ למעבר. עושה כאן, שני אגרופים על כל מדף רביע.
הערה: לאחר כל הדיבורים נעשים, העין יהיו שני אגרופים קונצנטריים במרכז, המייצגים את fovea macula, שני אגרופים בבסיס של כל כנף-בהיקף של 8 אגרופים ברשתית ההיקפית.

3. Fovea ואוסף ביופסיה Macula

כמו הרקמה עכשיו מוכן לאיסוף, לאסוף את כל ביופסיות רקמות microfuge נפרד צינורות ומקפיאים בעזרת חנקן נוזלי לעיבוד הזרם. לאחסן כל דוגמאות ב-80 מעלות צלזיוס עד ניצול.
להשתמש מלקחיים קוליברי 0.12 מעוקל כדי לתפוס את הקצוות של רקמה שקופה של fovea ברשתית. כדי לאסוף, לרומם, להפריד את רקמת foveal דמית-RPE הבסיסית.
להשתמש המלקחיים קוליברי 0.12 לתפוס את הטבעת החיצונית של הרקמה macula שקוף. אם הרקמה עדיין מחובר הרקמה הבסיסית או סמוכים, השתמש ווסטקוט מספריים לחתוך בזהירות את הקצה, לכידת רק הרכיב ברשתית, לנתח משם כל רקמות עצב הראייה כלול את האגרוף.

4. אוסף הרשתית ההיקפית

להשתמש המלקחיים קוליברי 0.12 מעוקל בעדינות להפריד את הדיסקים רקמת הרשתית ההיקפית RPE-דמית העין הבסיסית ואת המקום בתוך צינורות בודדים microfuge.
במקרה של ג'ל בזגוגית שיורית, להשתמש המלקחיים להרים ולהפריד את הג'ל משם ככל האפשר לפני אוסף של רקמת רשתית. לאחר הרשתית הוסר, דמית-RPE פיגמנט נשאר מתחת.

5. Foveal ואוסף RPE-Choroid Macula

שימוש 0.12 מלקחיים קוליברי לאחוז בקצוות של הרקמה RPE-שכבה דמית כהה שמתחת האזור fovea שהוסר. הפרד בזהירות את הרקמה הזאת מן בסקלרה לאסוף.
עם המלקחיים אותו, תופסים את הקצוות של הטבעת החיצונית של רקמות RPE-שכבה דמית כהה שבבסיס מקולרי האזור שהוסר. הפרד בזהירות זה רקמות מן בסקלרה על ידי האוחז את הקצוות בנקודות שונות מסביב לזירה ומושך בקלילות. בסופו של דבר, הטבעת של רקמות RPE-choroid יצא ממקומו, וייתכן שהוא שנאספו.
הערה: מלקחיים משני ביד הנגדית יכול להיות שימושי לתמרן את הרקמה RPE-שכבה דמית במהלך ההסרה. כמו רקמת רשתית, מספריים Wescott יכול לשמש כדי לסייע בהסרת כל רקמת היה לא מלא חרות באמצעות הכלי אגרוף.

6. אוסף RPE-Choroid הרשתית ההיקפית

להשתמש המלקחיים קוליברי 0.12 הקילוף דמית-RPE באזורים היקפיים אגרוף 8.
כאמור, למקם את הרקמה RPE-שכבה דמית microfuge צינורות ומקפיאים בעזרת חנקן נוזלי לעיבוד במורד הזרם. לשמור כל דוגמאות ב-80 מעלות צלזיוס עד ניצול.

7. . מספריים דיסקציה

הערה: אם הלהב ביופסיה אגרוף הוא משעמם או הכלי ביופסיה אגרוף לא דחף חזק מספיק, ייתכן שאין סביבה הסוהר הרקמה.

במקרים אלה, למשוך את הרקמות החוצה ככל האפשר, ולאחר מכן השתמש ווסטקוט מספריים לחתוך ולהפריד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אופסין # רטינל ורקמות RPE-choroid יעובד בדרכים שונות שיתאימו חקירה בודדים. לאחר אוסף, החוקר יהיה בעל דוגמאות רשתית ורקמות RPE-choroid מן האזור foveal, macula החיצוני, הרשתית ההיקפית (איור 1). באופן ספציפי, האגרוף אזור foveal יכלול את fovea, parafovea את כמות קטנה של perifovea הסמוך. המכה מקולרי כולל השארית של אזור perifoveal, כמו גם כמות קטנה של האזור ליד-ציוד היקפי סמוכים. בסופו של דבר, האגרופים היקפיים לטעום האזורים ההיקפית באמצע ולא רחוק-ההיקפית. בניסוי נציג, דגימות רקמה היו טריפסין- מתעכל נותחה באמצעות עמודים מרחביות חד-ממדי להמחיש תכולת החלבון (איור 2 א). התוצאות של ניתוח זה מציע חלבונים ברורים בין האזורים השונים של הרשתית. ניתוח באמצעות ספקטרומטר מסה טנדם-כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS/MS)⁶ מזוהים כהלכה פפטידים של אופסין # רודופסין, חלבון רשתית שופע ומיוחד מאוד. קשת נציג אופסין # רודופסין המתקבל האזור מקולרי מוצג באיור 2B. ניתוח נוסף של תכולת החלבון של תספק תובנות הפונקציות מולקולרית של האזורים ברורים אנטומית של הרשתית. במקרה הקרע אינה נעשית בקפידה ולאחר הרשתית לא מופרד כראוי RPE-דמית העין, ההבדלים תכולת החלבון בין רקמות שני אלה לא תהיה ניכרת.

איור 1 . אזורים ברשתית. תמונת הנציגה של הרשתית האנושית בריא. אזורים שונים ברשתית מודגש על ידי חוגים מנוקד, אזורים שנדגם על ידי ניקוב ביופסיות מסומנים באמצעות החוגים מוצק. צהוב מנוקד מעגלים מייצגים את אזור foveal, לרבות fovea, parafovea, perifovea (נוסע כלפי חוץ מן המרכז,) תוך למעגל מוצק צהוב מייצג את האגרוף foveal של 4 מ מ. העיגול הכחול המנוקד מייצג את אזור מקולרי אנטומיים, בעוד מוצק העיגול הכחול מייצג את האגרוף מקולרי של 8 מ מ. בסופו של דבר, העיגולים ורוד מנוקד מייצגים ליד ברשתית ההיקפית האזור (ליד P), באמצע אזור ברשתית ההיקפית (אמצע P) ואזור עד עכשיו היקפיים (רחוק P). החוגים מוצק ורוד מייצגים את האגרופים הרשתית ההיקפית 4 מ מ, אשר מכילים את האזורים אמצע P ורחוק P. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 . זיהוי של חלבונים ברשתית. הרשתית ההיקפית, macula ואזורי foveal היו ביופסיה ומשמש לניתוח פרוטיאומיה מבנית. (א) One-Dimensional מרחביות-דף, צביעת כסף דמיינו חלבונים בכל אזור ברשתית. (B) דגימות רקמה רשתית היו נוזלי כרומטוגרפיה-טנדם ספקטרומטר מסה (LC-MS/MS) ניתוח. נציג קשת הצבעים המוצגת היא של החלבון אופסין # רודופסין המזוהה באזור מקולרי. ספקטרום נרחב זה מייצג את אחת של חמש פפטידים אופסין # רודופסין ייחודי המזוהה של המקולה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

לאחר רקמת אוסף, דוגמת טיפול וטיפול הם שיקולים מכריע¹⁴. שימור בחנקן נוזלי הוא המועדף על קיבוע כימי, כפי האחרון עלול לגרום נזק למבנה חלבון, אשר יכול להטות את ניתוח במורד הזרם. בנוסף, חנקן נוזלי השימור היא המועדפת בשיטות שאינן כוללות הקפאת דגימות. ראוי לציין, פרר. et al. הראה הבדלים משמעותיים בין דגימות המוח נשמר 4 ° C או בטמפרטורת החדר, בהשוואה לאלו המאוחסנים ב- 0 ° C¹⁵רמות החלבון. יתרה מזאת, חשוב להיזהר בעת עיבוד דגימות, כמו טיפול כימי, פיזי מסוים לפני ההקפאה יש פוטנציאל לשנות את רמות החלבון ו שינויים post-translational¹⁶^,¹⁷. נקודה זו מדגישה את החשיבות של שוקל ניתוח במורד הזרם המיועד של דגימות. בנפרד, פוסט-מורטם התזמון של קצירת רקמות היא גורם נוסף אשר יכולים להשפיע על רמות והיציבות של חלבונים ספציפיים. השפלה יכולה להתרחש עד פרוטאום מדגם בהתאם זמן פוסט-מורטם ואחסון טמפרטורה¹⁸^,¹⁹^,²⁰. יתר על כן, שליטה על הזמן פוסט-מורטם השפלה, כגון על-ידי שימוש בקרה פנימית בין מחלת רקמת רקמה בריאה, היא קריטית. אם הגורם תזמון מתעלמת, השפלה יכול להטות את תוצאות. ככלל, ככל הרקמה הוא שנותחה פוסט-מורטם, הסיכון פחות השפלה לשנות את תוצאות המחקר.

מספר שינויים פרוצדורלי יכולה להיעשות כדי פרוטוקול זה כדי שיתאים יותר שאלה מחקר ספציפי. שינוי אחד הוא גודל שונה העור אגרוף ביופסיה כלי עשוי לשמש כדי לאסוף כמויות שונות של דגימות רקמה. רקמות פחות או יותר עשויות להידרש פרוטיאומיה מבנית במורד הזרם, עיבוד בהתאם הכמות או היציבות של חלבונים ספציפיים של עניין. יתר על כן, בגודל של רקמות לקחת את הביופסיה ניתן לקבוע בצורה גועלית איך ניתן לטעום את האזורים הספציפיים של הרשתית או RPE-שכבה דמית. לדוגמה, אם אזורים ספציפיים, בסדר של רקמות פיפטות נדרשות, קטן יותר העור אגרוף ביופסיה כלי עשוי להיות נחוץ. יתר על כן, אם סעיף זה כל כך כיף כי זה יורד מתחת היכולות של אגרוף ביופסיה כלים, microdissection עשוי להיות נדרש²¹. בנוסף, השימוש בעזרים חזותיים, כגון היקף ויבתר או זכוכית מגדלת, עשויים לסייע האוסף רקמות תהליך-במיוחד במקרים של גלובוס בגדלים קטנים יותר, כגון ברקמות עינית אינפנטילי.

לבסוף, חשוב לציין כי בזמן טכניקה זו מקבצת RPE ורקמות דמית העין כמקשה אחת, רקמות אלו יישארו נפרדות מולקולרי והן מבחינה תפקודית. ואכן, proteomes שונים במידה ניכרת בין רקמות שני אלה. עם זאת, למרות שהבדלים אלה, RPE דמית העין נשארים אנטומית פונקציונלית, קלינית מקושר²^,⁶^,⁷. וכך כל ניתוח פרוטיאומיה מבנית במורד הזרם של המתחם RPE-choroid צריך לזכור הבחנה מפתח זו.

כתב יד זה מדגים גישה פשוטה, אמינה, תקורה נמוכה לאוסף דוגמאות לניתוח פרוטיאומיה מבנית fovea, macula, ואת הרשתית ההיקפית רקמות RPE-שכבה דמית העין האנושית. שיקול דעתו של החוקר, שינויים יכול להתבצע תהליך איסוף או רקמות טיפול, אוסף קדם פוסט אוסף, בהתאם הניתוח המיועד פרוטיאומיה מבנית במורד הזרם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

שאין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

שהתנהל הוא נתמך על ידי מענקים NIH [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698, R21AG050437], דוריס דיוק מענק קרן צדקה #: 2013103, ומחקר כדי למנוע עיוורון (RPB), ניו יורק. MT GV נתמכים על ידי NIH הענק T32GM007337.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-34
8-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-37
0.12 Colibri Forceps	Stephens Instruments	S5-1145
Wescott Scissors	Sklar Surgical Instruments	64-3146
Microfuge tubes	Eppendorf	#022364111	1.5 mL
Liquid Nitrogen	Praxair, Inc.	7727-37-9 [R]