プロテオーム解析のための人間の網膜と網膜色素上皮・脈絡膜の解剖

Summary

人間の網膜は中心窩、黄斑の周辺部網膜など、分子の機能と異なる領域で構成されます。ここでは、細かく分析し、下流のプロテオーム解析のこれらの異なる網膜領域を収集パンチ生検と組織人間の目からレイヤーを手動で削除を使用して、メソッドについて述べる。

Abstract

人間の網膜は、しっかりと血管脈絡層に複合体である感覚の neuroretina と基になる網膜色素上皮 (RPE) ので構成されます。網膜の異なる領域は、解剖学的および分子異なります、ユニークな機能を促進し、病気に対する差動感受性を示します。これらの地域や層のそれぞれのプロテオーム解析は加加齢黄斑変性 (AMD)、糖尿病、緑内障など多くの病気の分子プロセスに重要な洞察力を提供できます。ただし、定量的プロテオーム解析を行うことができます前に網膜領域と層の分離が不可欠です。ここでは、解離と中心窩、黄斑および周辺網膜領域と網膜色素上皮-脈絡膜複合体の基になる、地域のパンチ生検と組織人間の目からレイヤーを手動で削除を含むコレクションの手法について述べる。液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析法 (MS/LC-MS) などの下流のプロテオーム解析と同様に、一次元の SDS-PAGE 使えます切り裂かれた網膜各層については、蛋白質を識別するために網膜疾患の分子バイオ マーカーを明らかに。

Introduction

網膜、網膜色素上皮、脈絡膜は、蛋白質の表現、生理機能、病理学的感受率^1,2の重要な地域の違いを示す複雑な組織です。たとえば、加加齢黄斑変性 (AMD)、網膜色素変性症、中心性漿液性網膜症は、各などの疾患を示す特徴的な局在中心窩、黄斑、網膜周辺部^{1,3、以内 4,6}。どのように異なる網膜領域は独立してサンプリングすることができますを示す方法を紹介します。このメソッドの全体的な目標は、プロテオーム解析の人間の網膜と網膜色素上皮・脈絡膜の中心窩、黄斑および周辺地域から組織サンプルのコレクションのための信頼できるガイドを提供することです。開発し、この技術の使用のための理論的根拠では、これら特定の網膜領域、これらの領域の生理学的および病態生理学的機能に分子洞察が得られる可能性があります重要なのプロテオーム解析。

このアプローチは、相対地域病感受性のプロテオミクス基盤を明らかにするため、新しい具体的な治療目標の識別を容易にするお約束します。確かに、硝子体と網膜とのやり取りのプロテオーム研究は分子組成と健康と病気の組織^5,7,8の機能に重要な洞察を提供しています。^{,9,10,11,12,13}。 ただし、異なる網膜領域の明確な比較プロテオーム解析が欠けています。技術は、信頼性と再現性のある組織のコレクションのアプローチを示すことによって他の方法上の利点を提供するこれらの大いに必要な研究をサポートするのに役立ちます。もっとそう、アプローチは非常にアクセス可能な標準サイズと容易に入手できる組織パンチ生検ツールを活用です。本手法では、プロテオミクス処理、タンパク質の安定性の低下の重要な考慮事項のためのティッシュの適切なコレクション ・を強調しています。したがって、このメソッドは、プロテオーム因子の下流の分子解析を考慮した調査に最適です。

Protocol

本研究はアイオワの大学によって承認された ' s 制度検討委員会ヘルシンキ宣言に掲げる原則に従っている

。

1 Foveal と黄斑の生検パンチ

1. 開くと蝶人間の目は、その前の文書に記載されている、組織の 4 の別のフラップので構成されます。 ^。5
2. シャーレは、2 枚に開いた人間の目に始まり、中心窩の上 4 mm のパンチ生検ツールの中心、押し、中心窩周囲切開までやさしくローリングします
。
3. は次に、中心し黄斑のアーケード内の 8 mm スキン パンチ生検ツールを押すと、穏やかな圧力を適用してローリングで斑の周り切開を生成します。これは組織の周りの最初の 2 番目、外側リングが生成されます
。

2。周辺網膜生検パンチ

アーケードのすぐ外の周辺網膜におけるパンチの一連をする

1. 使用 4 mm スキン パンチ生検ツール。ここでは、各象限のフラップの 2 つのパンチを作る
   。 注: すべてのパンチをした後、目が黄斑の中心窩を表す 2 つの同心円パンチ センターで 2 つはそれぞれフラップ積算基地でパンチ 8 パンチ周辺部網膜にします
。

3。黄斑と斑生検コレクション

1. 組織が、コレクションの準備ができて今別 microfuge の管ですべての組織生検を収集し、凍結する液体窒素を使用してダウン ストリーム処理のため。使用率まで-80 ° C ですべてのサンプルを格納します
。
2. は、網膜の中心窩の半透明のティッシュの端をつかむため曲線 0.12 コリブリ鉗子を使用します。収集、昇格し、中心窩の組織を基になる網膜色素上皮-脈絡膜から分離します
。
3. は、同様に、半透明黄斑組織の外側のリングを把握するのに 0.12 コリブリ鉗子を使用します。組織は、基になるまたは隣接する組織にまだ接続されている場合、は、慎重にトリム エッジ、網膜のコンポーネントだけをキャプチャし、離れてパンチに含まれる任意の視神経組織を解剖するウェストコットはさみのペアを使用します
。

4。周辺網膜コレクション

1. 基になる網膜色素上皮-脈絡膜と内の個々 の microfuge の管場所から周辺の網膜組織ディスクを優しく曲線の 0.12 コリブリ鉗子を使用します
。
2. 残存硝子体ゲルの場合別のゲルを離れてを持ち上げて鉗子を使用して網膜のティッシュのコレクションの前に可能な限り。色素性網膜色素上皮-脈絡膜網膜を取り外した後まま
。

5。中心窩と黄斑網膜色素上皮-脈絡膜コレクション

1. 使用、0.12 コリブリ鉗子削除された黄斑部の下にある暗い網膜色素上皮-脈絡膜組織の端を把握します。慎重に強膜や収集この組織から分離します
。
2. 同じ鉗子を使用して削除された黄斑領域の基礎となる暗い網膜色素上皮-脈絡膜組織の外側のリングの端を把握します。慎重に、リングの周りの別のポイントでエッジをつかんで軽く引っ張る強膜からこの組織を分離します。最終的には、網膜色素上皮-脈絡膜組織のリングは外れが、収集されることがあります
   。 注: 反対の手でセカンダリ鉗子除去時の網膜色素上皮-脈絡膜組織の操作に役立つできます。ない完全に切開パンチ ツールを使用して組織を除去を支援する網膜の組織同様・ ウェスコットはさみを使用できます
。

6。周辺網膜網膜色素上皮-脈絡膜コレクション

1. 8 末梢パンチ エリアの網膜色素上皮-脈絡膜をはがすに 0.12 のコリブリ鉗子を使用します
。
2. 以前に、網膜色素上皮-脈絡膜組織の microfuge の管で置き、凍結する液体窒素を使用してダウン ストリーム処理のため。使用率まで-80 ° C ですべてのサンプルを保持します
。

7。郭清をはさみ

注: パンチ生検ブレードが鈍い場合、パンチ生検のツールは十分に懸命にプッシュされませんができない場合があります、組織を取り巻くカット

。

1. 組織を離れて引っ張るこれらのケースで, 可能な限りウェストコットはさみを使用してトリミングし、別のと

。

Representative Results

網膜と網膜色素上皮-脈絡膜組織は、個々 の調査に合わせてさまざまな方法で処理できます。コレクションの後、研究者は網膜と網膜色素上皮-脈絡膜組織斑部、外側黄斑および周辺網膜 (図 1) からのサンプルを所有しています。具体的には、隣接する様相の少量、反対色、黄斑部中心窩領域パンチが含まれます。黄斑のパンチには、隣接する周辺機器に近い領域の少量と同様、perifoveal 地域の残りの部分が含まれています。最後に、末梢のパンチは中間周辺と遠周辺地域をサンプルします。代表的な実験組織サンプルはトリプシン消化され、蛋白質内容 (図 2 a) を視覚化する一次元の SDS-PAGE を用いています。この分析の結果は、網膜の異なる地域間で異なる蛋白質をお勧めします。液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析法 (MS/LCMS)⁶による解析は、ロドプシン、非常に豊かな、ユニークな網膜のタンパク質からペプチドを正しく識別。黄斑部から得られる代表的なロドプシン スペクトルを図 2 bに示します。タンパク質含有量の詳細な分析は、網膜の解剖学的に異なる領域の分子機能への洞察を提供します。郭清を慎重に行わないし、網膜色素上皮-脈絡膜から網膜が正しく分離されていませんが場合は、これらの 2 つの組織のタンパク質含量の違いが認識されません。

図 1.網膜領域。健康な人間の網膜の代表的なイメージ。異なる網膜領域が点線の円でハイライトされ、パンチ生検によってサンプリングされた領域は黒丸で示されます。点線の円斑部、中心窩、反対色、黄色実線の円間の様相 (外側から旅行センター) などを表す黄色は、4 mm の中心窩パンチを表します。青の点線の円は解剖学的黄斑領域を表し、青の実線の円は 8 mm 黄斑パンチを表します。最後に、ピンクの点線の円は、網膜周辺地域 (半ば P) とまで周辺地域 (P まで) 半ば近い網膜周辺領域 (近く P) を表します。ピンクの実線の円は、半ば P と P までの領域を含める 4 mm 周辺部網膜のパンチを表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2.レチナール蛋白質の同定します。周辺部網膜、黄斑の中心窩領域が生検とプロテオーム解析のために使用されます。(A)一次元 SDS-PAGE と銀染色各網膜領域の蛋白質を可視化。(B)網膜組織サンプルは液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法 (MS/LCMS) 分析の対象としました。示されている代表的なスペクトルは、黄斑部で識別されたロドプシン蛋白です。このスペクトルは黄斑 5 ユニークなロドプシン ペプチドの 1 つを表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Discussion

組織後コレクション、検体の取扱い、トリートメントが重要な考慮事項¹⁴です。後者は下流解析を傾けることができる蛋白質の構造に損傷の恐れがありますので、液体窒素中での保存は、化学固定法より優先されます。さらに、液体窒素保存サンプルの凍結を伴わない方法をお勧めします。特に、フェレールら4 ° C または 0 ° C¹⁵で保存されているものと比較して、室温で保存脳サンプル間タンパク質レベルで差異が認められました。さらに、蛋白質のレベルおよびポスト翻訳の修正^16,17を変更する可能性があります凍結前に特定の化学的および物理的治療としてサンプルを処理するときに注意することが重要です。この点では、サンプルの目的下流解析の検討の重要性を強調しています。別に、組織採取の事後タイミングは、レベルと特定の蛋白質の安定性に影響を与えることができるもう一つの要因です。劣化時間事後とストレージ温度^18,19,20によってサンプル プロテオームに発生します。さらに、疾患組織と健康な組織の内部統制の使用によって時間のポスト モーテムの劣化の制御は重要です。時間係数は無視され、劣化によって結果が変わってでした。一般的なルールとして、早ければ早いほど組織は分析された事後、研究結果を変更する劣化のリスクが少ないです。

いくつかの手続き型変更は特定の研究の質問に合わせてこのプロトコルさせることができます。1 つの変更は組織サンプルの異なった量を収集するためにサイズの異なる皮膚パンチ生検ツールが使えます。以下以上組織処理量や興味の特定の蛋白質の安定性によって下流のプロテオームの必要があります。また、網膜や網膜色素上皮-脈絡膜の特定の領域がサンプリングされますどのように著しく生検パンチのサイズがわかります。たとえば、病理組織の特定、微細領域が必要な場合、小さい皮膚パンチ生検ツールが必要かもしれない。さらに、セクションは結構パンチ生検ツールの機能を下回ること、レーザーマイクロダイ セクション²¹必要な可能性があります。さらに、解離性のスコープや、虫眼鏡などの視覚補助を使用可能性がありますの援助組織コレクション グローブ サイズの場合に特にプロセスなど小児の眼組織。

最後に、この方法では、網膜色素上皮と脈絡組織をグループ化、単一の複合体として、これらの組織まま分子と機能的に異なることに注意してくださいすることが重要です。確かに、これらの 2 つの組織の間、プロテオームが著しく異なります。にもかかわらず、これらの違い、網膜色素上皮と脈絡膜のまま解剖学的、機能的には、臨床的には、^2,6,7でリンクされます。このように網膜色素上皮-脈絡膜複合体の下流プロテオーム解析で、この重要な違いを心に留めてください。

本稿では、人間の目の網膜色素上皮-脈絡膜組織と周辺網膜黄斑の中心窩のプロテオーム解析のサンプル コレクションに簡単、信頼できる、オーバーヘッドの少ない方法を示します。捜査官の裁量では、変更は、コレクションのプロセスまたは前コレクションと意図した下流プロテオーム解析によって、後のコレクションを処理する組織に可能です。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-34
8-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-37
0.12 Colibri Forceps	Stephens Instruments	S5-1145
Wescott Scissors	Sklar Surgical Instruments	64-3146
Microfuge tubes	Eppendorf	#022364111	1.5 mL
Liquid Nitrogen	Praxair, Inc.	7727-37-9 [R]