Summary
Human netthinnen består av funksjonelt og molecularly atskilte områder, inkludert fovea, macula og eksterne netthinnen. Her beskriver vi en metode som bruker punch biopsier og manuell fjerning av vev lag fra en øyet å dissekere og samle disse forskjellige retinal regioner for nedstrøms proteomic analyse.
Abstract
Human netthinnen består av sensorisk neuroretina og underliggende retinal pigmentert epitel (RPE), som er fast kompleksbundet på vaskulær choroid laget. Ulike regioner av netthinnen er anatomisk og molecularly tydelig, tilrettelegge unike funksjoner og demonstrere differensial mottakelighet for sykdom. Proteomic analyse av hver av disse regionene og lag kan gi viktig innsikt i molekylær prosessen med mange sykdommer, inkludert Age-Related Macular degenerasjon (AMD), diabetes mellitus og glaukom. Separasjon av netthinnen regioner og lag er imidlertid avgjørende før kvantitative proteomic analyse kan oppnås. Her beskriver vi en metode for disseksjon og samling av foveal, flekker og eksterne retinal regioner og underliggende RPE-akkord kompleks, regionale punch biopsier og manuell fjerning av vev lag fra en øyet. Endimensjonal SDS-side i tillegg til nedstrøms proteomic analyse, som flytende kromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS), kan brukes til å identifisere proteiner i hvert dissekert retinal lag, avslører molekylær biomarkers for retinal sykdom.
Introduction
Netthinnen, RPE, og akkord er komplekse vev som viser viktige regionale forskjeller i protein uttrykk, fysiologisk funksjon og patologisk mottakelighet1,2. For eksempel demonstrere sykdommer som Age-Related Macular degenerasjon (AMD), retinitis pigmentosa og sentrale serous retinopati hver karakteristiske lokalisering i den fovea, macula eller netthinnen periferi1,3, 4,6. Her presenterer vi en metode demonstrere hvordan forskjellige retinal regioner kan prøves uavhengig. Det overordnede målet med denne metoden er å gi en samling av fra foveal, flekker og eksterne regioner av human netthinnen og RPE-akkord for proteomic analyse. Begrunnelsen for utvikling og bruk av denne teknikken er gjennom proteomic analyse av disse spesifikke netthinnen regioner, viktig molekylær innsikt kan oppnås i fysiologiske og patofysiologiske funksjonene i disse regionene.
Denne tilnærmingen lover å avsløre proteomic grunnlaget for relativ regionale sykdom mottakelighet, og å lette identifisering av nye konkrete terapeutiske mål. Faktisk har proteomic undersøkelser av linsen og dens interaksjon med netthinnen gitt innblikk i molekylær komposisjon og funksjon av friske og syke vev5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. imidlertid klart komparative proteomic analyser av forskjellige retinal regioner mangler. Teknikken hjelper for å støtte disse sårt tiltrengte studier, gir fordeler over andre metoder ved å demonstrere en pålitelig og reproduserbar vev samling tilnærming. Mer så, tilnærmingen er lett tilgjengelig, utnytter standardstørrelse og lett tilgjengelig vev punch biopsi verktøy. Våre teknikk understreker riktig innsamling og lagring av vev for proteomic behandling, noe som gjør viktige hensyn for protein stabilitet og fornedrelse. Dermed er denne metoden best egnet for etterforskere vurderer nedstrøms molekylær analyse av proteomic faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
denne studien ble godkjent av University of Iowa ' s institusjonelle Review Board og følger prinsippene fastsatt i erklæringen i Helsinki.
1. Foveal og macula biopsi Punch
- åpne og butterfly menneskelige øyet, slik at det består av 4 separate flaps av vev, som beskrevet i en tidligere publikasjon. 5
- fra og med en butterflied øyet i en Petriskål kan midtstille et 4 mm punch biopsi verktøy over fovea, trykk ned og rulle forsiktig til et snitt er gjort rundt fovea.
- Deretter generere et snitt rundt makula ved sentrering og trykke ned en 8 mm huden punch biopsi verktøyet i arkadene av makula, bruke lett trykk og rulle. Dette vil gi en andre, ytre ring av vevet rundt første.
2. Eksterne Retinal biopsi Punch
- Bruk 4 mm huden punsj biopsi verktøy for å lage en rekke slag i eksterne netthinnen, like utenfor arkaden. Her, lage to slag for hver kvadrant klaff.
Merk: Etter at alle slag er laget, øyet vil ha to konsentriske slag i midten, som representerer fovea og macula, og to slag på bunnen av hver klaff-totalt 8 slag i eksterne netthinnen.
3. Fovea og Macula biopsi samling
- vev er nå klar for innsamling, samle alle vev biopsier i separate microfuge rør og fryse med flytende nitrogen for nedstrøms behandling. Lagre alle prøver-80 ° c før utnyttelse.
- Bruker en buet 0,12 Colibri tang for å ta kanten av gjennomskinnelig vev av netthinnen fovea. For å samle, heve og skille foveal vev fra den underliggende RPE-akkord.
- Bruke tilsvarende 0,12 Colibri tang for å forstå den ytre ringen av gjennomskinnelig macula vev. Hvis vevet er fortsatt knyttet til underliggende eller tilstøtende vev, bruke et par Westcott saks til å klippe nøye kanten, fange bare komponenten netthinnen og dissekere bort noen synsnerven vev i slag.
4. Eksterne netthinnen samling
- bruke buede 0,12 Colibri tang forsiktig skille perifere netthinnen vev plater fra de underliggende RPE-akkord og plass i individuelle microfuge rør.
- Ved gjenværende glasslegemet gel, bruk tang til å løfte og skille gel unna som mulig før samling av netthinnen vev. Når netthinnen er fjernet, det pigmenterte RPE-akkord fortsatt under.
5. Foveal og Macula RPE-akkord samling
- Bruk 0,12 Colibri tang å ta tak i kantene av mørke RPE-akkord vev som ligger under området fjernet fovea. Forsiktig skille dette vevet fra sclera og samle.
- Bruker samme tang, ta tak i kantene av den ytre ringen av mørke RPE-akkord vev underliggende fjernet macula området. Forsiktig skille dette vevet fra sclera ved gripe kantene på ulike punkter rundt ringen og lett trekke. Til slutt, ringen av RPE-akkord vev vil kobles og kan samles.
Merk: Sekundær tang i motsatt hånd kan være nyttig i å manipulere RPE-akkord vevet under fjerning. Som netthinnen vev, Wescott saks kan brukes å hjelpe fjerne alle vev som ikke var fullstendig avbildning ved hjelp av verktøyet punch.
6. Eksterne netthinnen RPE-akkord samling
- Bruk 0,12 Colibri tang til å skrelle bort RPE-akkord innen 8 perifere punch.
- Som tidligere sett RPE-akkord vevet i microfuge rør og fryse med flytende nitrogen for nedstrøms behandling. Holde alle prøver-80 ° c før utnyttelse.
7. Saks disseksjon
Merk: Hvis punch biopsi bladet er kjedelig eller verktøyet punch biopsi er ikke presset hardt nok, det er ikke en rene omkringliggende vev.
- i disse tilfellene trekke vevet bort så mye som mulig, og deretter bruke Westcott saks til å klippe og separate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Retinal og RPE-akkord vev kan behandles på ulike måter som passer personlige etterforskning. Etter samlingen, vil hun ha prøver av retinal og RPE-akkord vev fra foveal regionen, ytre macula og eksterne netthinnen (figur 1). Spesielt inkluderer foveal regionen punsj fovea, parafovea og en liten mengde av tilstøtende man. Macula punsj inkluderer resten av regionen perifoveal samt en liten mengde tilstøtende nær perifere regionen. Til slutt, perifere slag prøve regionene midt perifere og langt-tilleggsutstyr. I et representativt eksperiment, vevsprøver var trypsin fordøyd og analysert bruke endimensjonal SDS-siden til å visualisere proteininnhold (figur 2A). Resultatene av denne analysen foreslå forskjellige proteiner blant de ulike regionene i netthinnen. Analyse av flytende kromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS)6 identifisert riktig peptider fra rhodopsin, et svært rikt og unike netthinnen protein. En representant rhodopsin spekteret fra regionen macular er vist i figur 2B. Videre analyse av proteininnholdet vil gi innsikt i molekylær funksjoner anatomisk forskjellige regioner i netthinnen. I tilfellet dissection utføres ikke nøye, og netthinnen er ikke riktig atskilt fra RPE-akkord vil forskjeller i proteininnhold mellom disse to vev ikke være synlig.
Figur 1 . Netthinnen regioner. Et representativt bilde av en sunn human netthinnen. Netthinnen regioner er markert med prikkede sirkler og regioner samplet ved punch biopsier angis med solid sirkler. Den gule prikket sirkler representerer foveal regionen, inkludert fovea, parafovea og man (reiser utover fra midten), mens gul solid sirkelen representerer 4 mm foveal slag. Blå stiplet sirkelen representerer anatomiske macula regionen, mens den blå solid sirkelen representerer 8 mm macula slag. Til slutt, rosa stiplede sirkler representerer retinal perifere regionen (nær P), midt retinal perifere region (midten av P) og langt perifere regionen (langt P). De rosa solid sirklene representerer 4 mm perifere netthinnen slag, som inneholder regionene midt P og langt P. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Identifikasjon av netthinnen proteiner. Eksterne netthinnen, macula og foveal områder var biopsied og brukt for proteomic analyse. (A) One-Dimensional SDS side og sølv flekker visualisert proteiner i hver retinal region. (B) netthinnen vevsprøver ble gjenstand for flytende kromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) analyse. Representant spekteret vist er rhodopsin protein identifisert i regionen macula. Dette spekteret representerer en av fem unike rhodopsin peptider i makula. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Etter vev er samling, prøve-håndtering og behandling avgjørende hensyn14. Bevaring i flytende nitrogen er foretrukket over kjemiske fiksering, som sistnevnte kan resultere i skade for proteinstruktur, som kan vri nedstrøms. I tillegg er flytende nitrogen bevaring foretrukket å metoder som ikke involverer frysing av prøver. Spesielt Ferrer et al. viste betydelige forskjeller i protein nivå mellom hjernen prøvene bevart på 4 ° C eller romtemperatur, sammenlignet med de lagret 0 ° C15. Videre er det viktig å være forsiktig når prosessering prøver, som bestemte kjemiske og fysiske behandling før frysing har potensial til å endre protein nivå og post-translasjonell modifikasjoner16,17. Dette punktet understreker betydningen av å vurdere beregnet nedstrøms analyse av eksempler. Separat, er post mortem timingen av vev høsting en annen faktor som kan påvirke nivåer og stabilitet av spesifikke proteiner. Fornedrelse kan oppstå for eksempel proteom avhengig av tid evaluering og lagring temperatur18,19,20. I tillegg er kontrollerer til gang obduksjon fornedrelse, som ved bruk av interne kontroller mellom sykdom vev og sunt vev, avgjørende. Hvis timing faktor ignoreres, kan degradering forskyve resultatene. Som regel, jo raskere er vevet analysert obduksjon, mindre risiko for fornedrelse å endre studere resultatene.
Flere fremgangsmåter for endringer gjøres til denne protokollen som bedre passer en bestemt problemstilling. Én endring er at ulike størrelse huden punch biopsi verktøy kan brukes å samle ulike mengder av vevsprøver. Mindre eller mer vev kan kreves for nedstrøms proteomic behandling avhengig av antall eller stabilitet av spesifikke proteiner av interesse. Videre er kan størrelsen på vev punch biopsi bestemme hvor grovt regioner av netthinnen eller RPE-akkord vil prøves. For eksempel hvis bestemt, fine regioner av patologisk vev, kan mindre huden punch biopsi verktøy være nødvendig. Videre, hvis en del er så fint at den faller under egenskapene til punsj biopsi verktøy, microdissection være nødvendig21. I tillegg kan bruk av visuelle hjelpemidler, for eksempel dissecting omfang eller forstørrelsesglass, hjelpe vev samlingen prosessen-spesielt i tilfeller av mindre verden størrelser, som med infantile okulær vev.
Endelig, er det viktig å merke seg at mens denne teknikken grupper RPE og choroid vev som et enkelt kompleks, disse vev forblir molecularly og funksjonelt forskjellig. Faktisk variere proteomes betydelig mellom disse to vev. Men knyttet til tross for disse forskjellene, RPE og akkord forblir anatomisk funksjonelt og klinisk2,6,7. Således bør nedstrøms proteomic analysen på RPE-akkord komplekset huske på dette viktige skillet.
Dette manuskriptet demonstrerer en enkel, pålitelig og low-overhead tilnærming til prøvetaking for proteomic analyse av fovea, macula, og eksterne netthinnen og RPE-akkord vev i menneskelige øyne. Forgodtbefinnende etterforskeren, kan endringer gjøres enten samlingen prosessen eller vev håndtering, pre samling og etter samling, avhengig av tiltenkte nedstrøms proteomic analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
VBM er støttet av NIH tilskudd [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 og R21AG050437], Doris Duke veldedige Foundation Grant #: 2013103, og forskning å hindre blindhet (RPB), New York, NY. MT og GV støttes av NIH gi T32GM007337.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-34 | |
| 8-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-37 | |
| 0.12 Colibri Forceps | Stephens Instruments | S5-1145 | |
| Wescott Scissors | Sklar Surgical Instruments | 64-3146 | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | #022364111 | 1.5 mL |
| Liquid Nitrogen | Praxair, Inc. | 7727-37-9 [R] |
References
- Chirco, K. R., Sohn, E. H., Stone, E. M., Tucker, B. A., Mullins, R. F. Structural and molecular changes in the aging choroid: implications for age-related macular degeneration. Eye (Lond). , (2016).
- Zhang, P., et al. Defining the proteome of human iris, ciliary body, retinal pigment epithelium, and choroid. Proteomics. 16 (7), 1146-1153 (2016).
- Funke, S., et al. Glaucoma related Proteomic Alterations in Human Retina Samples. Sci Rep. 6, 29759 (2016).
- Decanini, A., et al. Human retinal pigment epithelium proteome changes in early diabetes. Diabetologia. 51 (6), 1051-1061 (2008).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of human vitreous body elements for proteomic analysis. J Vis Exp. (47), (2011).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic landscape of the human choroid-retinal pigment epithelial complex. JAMA Ophthalmol. 132 (11), 1271-1281 (2014).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. J Vis Exp. (50), (2011).
- Skeie, J. M., et al. Proteomic analysis of vitreous biopsy techniques. Retina. 32 (10), 2141-2149 (2012).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic interactions in the mouse vitreous-retina complex. PLoS One. 8 (11), e82140 (2013).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M. Translational vitreous proteomics. Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 204-208 (2014).
- Skeie, J. M., Roybal, C. N., Mahajan, V. B. Proteomic insight into the molecular function of the vitreous. PLoS One. 10 (5), e0127567 (2015).
- Velez, G., et al. Precision Medicine: Personalized Proteomics for the Diagnosis and Treatment of Idiopathic Inflammatory Disease. JAMA Ophthalmol. 134 (4), 444-448 (2016).
- Velez, G., et al. Proteomic analysis of elevated intraocular pressure with retinal detachment. Am J Ophthalmol Case Rep. 5, 107-110 (2017).
- Skeie, J. M., et al. A biorepository for ophthalmic surgical specimens. Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 209-217 (2014).
- Ferrer, I., et al. Brain protein preservation largely depends on the postmortem storage temperature: implications for study of proteins in human neurologic diseases and management of brain banks: a BrainNet Europe Study. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (1), 35-46 (2007).
- Ahmed, M. M., Gardiner, K. J. Preserving protein profiles in tissue samples: differing outcomes with and without heat stabilization. J Neurosci Methods. 196 (1), 99-106 (2011).
- Kanshin, E., Tyers, M., Thibault, P. Sample Collection Method Bias Effects in Quantitative Phosphoproteomics. J Proteome Res. 14 (7), 2998-3004 (2015).
- Crecelius, A., et al. Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE. Proteomics. 8 (6), 1276-1291 (2008).
- Oka, T., Tagawa, K., Ito, H., Okazawa, H. Dynamic changes of the phosphoproteome in postmortem mouse brains. PLoS One. 6 (6), e21405 (2011).
- Nagy, C., et al. Effects of postmortem interval on biomolecule integrity in the brain. J Neuropathol Exp Neurol. 74 (5), 459-469 (2015).
- Mukherjee, S., et al. Proteomic analysis of frozen tissue samples using laser capture microdissection. Methods Mol Biol. 1002, 71-83 (2013).
