Summary
Malzeme özellikleri ve tensional parametreleri içinde vivo ölçmek için Araçlar eksikliği onların rolleri geliştirme sırasında doğrulama engeller. Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) ve mekanik özellikleri bozulmamış Zebra balığı embriyo sarısı cep epiboly sırasında ölçmek için nanopartikül izleme çalıştırmaya başladık. Bu, güvenilir ve yaygın olarak uygulanabilir müdahaleci müdahaleler kaçınarak yöntemlerdir.
Abstract
Dokularda gelişen spatio-temporal organizasyon doğrudan faktörler elucidating birincil amacı kalkınma insan biridir. Çeşitli önermeler hücre ve dokuların farklı gelişim ve morfogenetik süreçlerde kronolojik zamanmekansal kuruluşlarındaki mekanik özelliklerinin anlayış önemli katkıları olmuştur iddiasında. Ancak, malzeme özellikleri ve tensional parametreleri içinde vivoölçmek için güvenilir ve erişilebilir araçları eksikliği nedeniyle, bu hipotez doğrulayarak zor olmuştur. Burada istihdam Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) ve parçacık sağlam Zebra balığı embriyo sarısı hücresinin mekanik özelliklerini epiboly sırasında miktarının amacı ile izleme yöntemleri mevcut. Epiboly olan çalışma embriyo şeffaflık tarafından yönetilir bir erken korunmuş gelişimsel bir süreçtir. Doku mekaniği etkileyebilecek müdahaleci müdahaleler üstesinden gelmek bu yana bu yöntemleri uygulamak basit, güvenilir ve yaygın olarak uygulanabilir. Basit ve bir strateji montaj örnekleri, AFM kayıt ve nanoparçacık enjeksiyonları ve izleme için uygulandı. Bu yaklaşım diğer gelişimsel kez veya organizmalar bu yöntemler kolayca uyarlanabilir yapar.
Introduction
Morfogenetik süreçleri biyomekanik kontrolünü altta yatan fiziksel ilkeleri büyük ölçüde tanımsızdır. Biyomekanik çalışmalar moleküler ve hücresel düzeyde önemli ivme toplanıyor, doku/organizma düzeyinde biyomekanik parametreleri keşfi onun bebeklik iken. Hidrodinamik regresyon1 veya Video kuvvet mikroskobu2 araştırmacılar lazer mikrocerrahi3veya daha az müdahaleci Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) Disosiye hücreleri4 aktif ve pasif Kuvvetleri ayırt etmek için izin ver veya vivo 5 veya nanopartikül microrheology6 mendil'ın mekanik özellikleri ve yanıtları beklentisiyle izin verir.
AFM yüzey pürüzlülüğü ve konsol ipuçları temas üzerine saptırma uyum Problu yüzey7ile çözme atomik yüksek çözünürlüklü üç boyutlu topografik bir tekniktir. AFM istihdam farklı yöntemleri yüzey özellikleri, sürtünme, yapışma kuvvetleri ve çeşitli malzemelerin visko elastik özellikleri ölçme de dahil olmak üzere araştırma için geliştirilmiştir. Son zamanlarda, AFM biyolojik örneklerin mekanik özellikleri hakkında bilgi almak için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle, AFM non-invaziv karmaşık kesme modülü tek hücreleri ile bilinen bükme sürekli8konsol için bağlı bir mikro uç salınım girintili yazımları uygulayarak ayıklayabilirsiniz. Bu ortaya çıkan Kuvvetleri sonucuna izin veriyor. Henüz, ve farklı yöntemleri izin rheological veri ve mekanik özellikleri tek tek hücreleri ayıklama AFM benzersiz değildir (Örneğin, Micropipette aspirasyon9, manyetik sitometresi (MTC)10büküm veya uniaxial çekme dayanımı «««test)11.
Henüz, bu roman metodolojileri uygulamaya karmaşık morfogenetik işlemleri basit değildir. Yumuşak küçük (µm mm), embriyonik dokuların mekanik özelliklerini belirlerken karşı karşıya ana sorunlar nelerdir (102 - 104 Pa aralığı) ve malzeme12doğası visko-elastik (Saat-bağımlı olayları veren artış). Bu nedenle mekanik özellikleri (sertlik, viskozite, yapışma) belirlenmesi için embriyo ve gelişmekte olan organizmalar belirli durumunda istihdam yöntemleri uyum önemlidir. İki önemli konu göz önüne geliştirme çalışmaya rheological yaklaşımlar analiz ederken alınması gerekir: müdahaleci bir girişimi engellemek için ve kolay erişilebilirlik sağlamak için. Bu senaryoda, micropipette aspirasyon, MTC ve gerilme test sınırlamalar sergi. İlk durumda, bir hücrenin muzdarip yüksek deformasyon onun fizyolojik ve mekanik özellikleri9değiştirebilir. İkinci durumda, sıkıca uygulanan stresleri sitoiskeleti yerel olarak deforme emin olmak için bir substrat için deneysel doku uygun gerek Ayrıca etkileri hücre harekete geçirmek durum ve, dolayısıyla, onların mekanik özellikleri10 tanıştırır mısın . Son, uniaxial gerilme yaklaşımlar gelişmekte olan organizmalar ve erişilebilirlik11geometri tarafından sınırlıdır.
AFM doğal çevrenin hantal örnek herhangi bir hazırlık yapmadan doğrudan içinde biyolojik örnekler incelenmesi verdiğinden daha iyi gelişim süreçleri çalışma için uygun görünüyor. Ayrılma embriyonik dokuların genellikle zor olduğu için Ayrıca, AFM probları indirimli boyutu sınırlama olmaksızın orta (sulu veya sulu olmayan), örnek ısı veya kimyasal türünü seçiminde çok yönlü yüksek derecede sağlar kompozisyon örnek. AFM büyük etki alanlarına uygulanması ve ölçekler saat için çok yönlü ve farklı gelişim aşamalarında veya fizyolojik şartlarda dokuların malzeme özelliklerini almak için istihdam edilmiştir. Bütün yerel doku arterler13 ya da kemik14 topografik açıdan ve bazı durumlarda, sklera gibi okudu gibi mekanik özellikleri de erişim tarihi15olmuştur. Topografya ayrıca canlı embriyolar Xenopus16görselleştirme, örneğin, hücre düzenlenmesi sırasında morfogenez izin içinde keşfedilmeyi. En son ve kapsamlı örnek hazırlama protokoller farklı gelişim sürecinde mekanik parametreler belirlemek için geliştirilmiştir. Nanoindentation haritalar yerel sabitlenmemiş doku bölümlerinde piliç embriyonik sindirim sistemi11için oluşturulan; gastrulating Zebra balığı embriyo4den izole tek tek ektoderm, mesoderm ve endoderm progenitör hücreler için alınan ya da mekanik özellikleri; sertlik ölçümleri epiblast ve ilkel çizgi explants üzerinde kuş embriyo17için gerçekleştirilen; ve sertlik degradeleri doğrudan Xenopus5embriyonik beyinde tanımlanan farklı bir desen.
AFM embriyonik gelişim keşfetmek için uygulamak için önemli bir nitel sıçrama basit erişilebilir morfogenetik süreçleri yaklaşan gelebilir. Zebra balığı epiboly içinde sınırlı bir küresel alanda blastoderm genişleme birkaç saat içinde doğrudan farklı dokuların koordine bir temel ve korunmuş, olaydır. Zebra balığı epiboly (küresel sahne) başlangıcında, hücreleri, zarflama Katmanı (EVL), yüzeysel tabakası hayvan pole büyük sarısı sinsisyal cepten oturan embriyo merkezli blastomeres yarı küresel bir kap kapsar. Epiboly EVL, kortikal bitkisel ward genişlemesi derin hücreleri (DCs) blastoderm ve sarısının etrafında sinsisyal sarısı hücre (E-YSL) dış tabakası oluşur. Epiboly EVL ve DCs bitkisel pole18,19,20kapatılması ile sona erer. Nasıl ve nerede Kuvvetleri epiboly sırasında oluşturulur ve nasıl genel olarak birleştiğinde değil henüz1,21açıktır.
Burada ayrıntılı olarak nasıl pasif mekanik doku özellikleri Zebra balığı sarısı ilerlemesinde epiboly sırasında in vivohücre anlaması için AFM uygulanacağını açıklar. Bunu yapmak için küçük mikroküreler probları gibi AFM cantilevers bağlı çalıştırmaya başladık. Bu kesin yerel bilgi üniform olmayan sarısı hücre yüzeyine içinde ve tensional gradyanlar ve onların dynamics zaman içinde çalışmaya alınmasını sağlar. Alternatif AFM kama cantilevers22kullananların gibi yaklaşımlar, değil yeterince kesin yerel veri render olacaktır. Konsol sonundaki örnek boyutundan daha büyük bir kama yapıştırmak için çok dikkatli işleme beceri gerektirir, kama tekniği iyi embriyo problama için uygun değildir (~ konsol uzunluğu daha büyük 2'ye katlanmış) mekaniği.
Modelleme ve nitel ve nicel bir şekilde hücreleri visko elastik özelliklerini karakterize geliştirilmiş onların biyomekanik için anlayabileceksiniz. Biyomekanik açıdan epiboly ve kortikal gerilim ölçümleri ve AFM tarafından çıkarılan dynamics, sadece talep bilgi anlamak önemlidir; Böylece doku biyofiziksel özellikleri hakkında bilgi için gerek yoktur. Bu bilgileri ayıklamak için çeşitli hücre Reolojisi teknikler geliştirilmiştir yıllar içinde farklı hücre türleri farklı fizyolojik şartlarda23altında karakterize için. AFM, MTC ve optik cımbız (OT) içerir. Bu yöntemler, ancak, embriyo veya organları ölçekte mezoskopik analizleri için yetersiz kanıtlanmıştır. Alternatif olarak, başarıyla nanopartikül izleme microrheology6 in vivo rheological ölçümler için adapte edilmiştir. Bu teknik bireysel parçacıkların Brown talebiyle analiz eder ve yerel micromechanical özelliklerini tanır.
Birlikte AFM ve nanoparçacık microrheology epiboly sırasında kortikal tensional dynamics tanımı ve yumurtalı iç mekanik özellikleri sağlar. Bu bilgiler tamamen Anizotropik stres EVL deformasyon yanıt farklılıkları bir sonucu olarak gelişir ve E-YSL korteks izotropik actomyosin daralma için sarısı sitoplazmik Katmanı (GKB) için gerekli bir model onayladığı EVL ve epiboly ilerleme1yönlü net hareketi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıda açıklanan tüm iletişim kuralı adımları kurumlarımıza hayvan bakımı yönergeleri izleyin.
1. Zebra balığı kültür
- Doğurmak ve standart koşullar altında yetişkin Zebra balığı korumak.
Not: Bu çalışma için AB ve TL vahşi türü embriyo kullanılmıştır. - Embriyo toplamak ve onları E3 embriyo orta24' te 28.5 ° C'de büyümek. Onları Morfoloji göre yukarıda açıklanan19sahne.
2. Atomik kuvvet mikroskobu
- El ile dechorionate Zebra balığı embriyo (bireysel ilgi alanlarına göre farklı yaştan) düzenledi. Chorions iki ince ve keskin forseps ( Tablo malzemelerigörmek) kaldırın.
- Bir forseps kullanarak koryon kavrama ve gözyaşı içinde diğer Forseps ile yapmak. Daha sonra bu gözyaşı ters bir bölgede koryon holding, embriyo delikten hafifçe itin.
- Dechorionation büyütme 8 X ve 50 X arasında ayarlanabilir bir dizi ile bir diseksiyon stereomicroscope altında gerçekleştirin.
- Embriyo AFM için mount
- Embriyo orta % 2 özel bir çözüm hazırlamak ve 35 mm Petri kabına bu ile doldurun. Kuvvetlendirmek izin. Özel yatakta ince Forseps ile 1.5 mm çapında (iki embriyo katı) ve yaklaşık 350 µm derinlik (yarım embriyo boyutu) küçük delikler yapmak.
- Özel katmanda yapılan sokmak embriyoların yer ve onlar özel embriyo orta yerde etrafında % 0,5 düşük bir çözüm yayarak erime vardır sizi temin ederim. Sadece onları deliklere güvenli embriyo etrafında bu çözüm dökün.
- Düşük erime noktası özel oda sıcaklığında katılaşır önce embriyo tarafından AFM probed ilgi bölge yukarı doğru (şekil 1A) karşıya gelecek şekilde döndürün.
- AFM tarafından embriyo incelemek
- Bulun ve bir 20 X objektif bir ters Atomik kuvvet mikroskobu istihdam petri kabına embriyo resim (bkz. Tablo reçetesi25) oda sıcaklığında (23-24 ° C).
Not: Embriyo embriyo ortamda dalmış ve özel yatağa bağlı canlı tutulur. - Döküm embriyo bir konsol bir nominal bahar sabit 5 mikron ve 1 Hz için onun sık sık oluş olarak konsol salınım en yüksek zirve genliğini N/m. ayarlayın 0.01 ile bağlı çapı 4.5 µm küresel polistren boncuk istihdam sarısı hücre yüzeyine sonda.
- Farklı pozisyonlar ve birkaç embriyolar ortalama veri için bir rutin olarak test edilecek her bölge için veri toplamak.
Not: Beş pozisyonlar AFM mikroskop XY piezo-erişim düzenekleri ile prensibine göre konumunu kontrol ederek orta ve 10 µm x 10 µm kare köşelerinde bulunan soruşturma için iyi bir başlangıç noktası olduğunu. Görüntüleme ve veri toplama embriyo başına yaklaşık 20 dakika sürdü. Veri embriyo sarısı hücre yüzeyine farklı bölgelerinde kayıt, örneğin, bitkisel kutup veya farklı bölgeleri EVL hücre kenar boşluğu (şekil 1B ve 1 C), yakın sadece yapılabilir ayrı numuneler farklı yönelik istihdam ederek.
- Bulun ve bir 20 X objektif bir ters Atomik kuvvet mikroskobu istihdam petri kabına embriyo resim (bkz. Tablo reçetesi25) oda sıcaklığında (23-24 ° C).
- Kuvvetleri hesaplamak
- Piezo-aktüatörler ve çeyreği fotodiyot kullanma onun saptırma (d) optik kolu yöntemle mikroskop kontrol yazılımı ile birleştiğinde ağırlık ölçme esneklik detektörler sensörleri ile AFM konsol (z) dikey yerinden ölçmek ( Tablo malzemeleri görmek 25).
- Bir cam coverslip çıplak bir bölgeden toplanan verilerden elde edilen bir d-z eğrinin eğim fotodiyot sinyal ve konsol saptırma (d) arasındaki ilişkiyi ayarlamak için kullanın.
Not: Konsol saptırma ölçülen dikey deplasman eşittir ve yamaç optik kolu26saptırma duyarlılığını temsil eder. - Termal dalgalanmaları gelen konsol bahar sabiti (k) daha önce27açıklandığı gibi algılayın.
- Örnek (h) girinti olarak hesaplamak:
h (z - zc) = -(d - dkapalı) (1)
Not: Burada zc temas noktası konumunu ve dkapalı fotodiyot uzaklık. - Kuvvet (F) konsol Hesapla:
F = k · d (2)
- Viskoz sıvı kapsayan kortikal gerginlik Tc elastik bir tabakanın oluşan bir sıvı-balon modeli açısından korteksin gerginlik hesaplayın. Bu modelde, (göre embriyo boyutu), küçük girintili yazımları için kuvvet orantılı olarak4,28 olarak artar:
F 4π Tc= [(Rb / Re) + 1)] h (3)
Not: Burada Rb boncuk yarıçapı ve Re embriyo yarıçapı. Embriyo (400 µm) RADIUS iki büyüklük boncuk (2,25 µm), daha büyük olduğu gibi Zebra balığı embriyo için olarak bu denklem yaklaşık:
F = 4π Tc h (4)- Gerilim kuvveti-girinti (F-h) hesaplamak Eğriler için beş farklı her embriyo sarısı hücre bölgedeki gelin ölçümleri.
- Tc hesaplamak için her F-h eğri doğrusal en uygun küçük kareler tarafından için. İstatistiksel analiz, kortikal gerginlik Tc hesaplanan farklı F-h eğrileri ortalama gerekir için.
- Korteksin visko elastik özellikleri (Reolojisi) düşük genlik uygulayarak ölçmek (100 nm) multifrekans salınım AFM sırasında değişik Frekanslar25sinüsoidal dalgalar oluşur.
- Frekans etki alanından kuvvet girinti eğrileri bir etkili karmaşık modülü g*(ƒ) hesaplamak:
g * (f) = [F(f) / h(f)]- IFB (5)
Burada hayali birimdir ve frekans (f) spectra kuvvet ve girinti F(f) ve h(f) vardır. b için yüzeye uygulanan salınım çıkarılan konsol üzerinde yapışkan sürükle düzeltmedir. - Gerçel ve sanal içine ayrı g*(ƒ) :
g * (F) = g' (f) + IG'' (f) (6)
em > g'(f) elastik modül ve elastik enerji ölçüsü depolanan ve salınım döngüsü kurtarıldı. g'' (f) olduğu için harcanmış enerji hesapları viskoz modülü. - Katı gibi bir dizinin sağlar kaybı tanjantı hesaplamak (< 1) veya sıvı benzeri (> 1) malzemenin, davranış olarak:
g'' (f) / g' (f) (7)
Not: Bu tür ölçüm, parametreleri ayıklamak mümkün mü nasıl viskoz gösteren ve nasıl elastik Problu malzemedir. B biraz yüzeye konsol sonu mesafe bağlı olsa da, çok düşük değerler gverilen ´´ sarısı tarafından sergilenen ( 2D rakam aşağıda görmek) hücre, b küçük değişimler ihmal edilebilir bir etkiye sahip ölçümleri29.
- Frekans etki alanından kuvvet girinti eğrileri bir etkili karmaşık modülü g*(ƒ) hesaplamak:
3. parçacık izleme Microrheology
-
Parçacık mikroenjeksiyon sarısı hücre içine gerçekleştirmek
- (Bkz. Tablo reçetesi) bir yatay micropipette puller ve kapiller borosilikat cam kullanarak özel microneedles imal.
- 1.00 mm, bir iç çapı 0,58 mm ve 10 çektirmenin ayarlar kullanılarak cm uzunluğunda bir dış çapı var microneedles hazırlamak: Basınç: 500; Isı: 510; Çekme: 65; Hız: 25; Zaman: 50.
- Bir enjeksiyon petri kabına plaka özel yapılmış kalıpları ( Tablo malzemelerigörmek) istihdam embriyo orta yatakta bir % 1'özel düz girinti şerit oluşturarak hazırlayın.
- Kalıpları ters çevirin ve sıvı özel jel üstüne koyup ve jel katılaşmış bir kez kalıpları çıkarın. Özel bir diseksiyon stereomicroscope 1.2 X büyütme, altında kalıp tarafından yapılan oluklar içine embriyo pipette.
Not: Genişlik ve tasarım kalıpları kendi kendini hizalamak embriyo etkinleştirin.
- Kalıpları ters çevirin ve sıvı özel jel üstüne koyup ve jel katılaşmış bir kez kalıpları çıkarın. Özel bir diseksiyon stereomicroscope 1.2 X büyütme, altında kalıp tarafından yapılan oluklar içine embriyo pipette.
- Önce enjeksiyon, enjeksiyon (yüzey gerilimi embriyo/koryon enjeksiyon sonra kaldırırken için iğne yapışmasını önler) kolaylaştırmak için orta neredeyse tamamen kaldırın.
- Floresan nano tanecikleri microinject (RADIUS bir = 100 nm, Tablo malzemelerigörmek) embriyo sarısı hücre (şekil 3A) bitkisel bölümünde (1:1, 000) suda seyreltilmiş.
- Micropipette hassas micromanipulators ile ayarlamak ve zaman ve basınç kontrol eder (bkz. Tablo reçetesi) ile otomatik bir microinjector boncuk enjekte. Arasında 10 ve 20 psi basınç ayarlı.
- Boncuk çözüm enjekte önce enjekte etmek için birim kalibre (0,5 nL) 1 x 0,01 mm sahne mikrometre ile teslim tarafından microinjector damlacık boyutu ölçerek ( Tablo reçetesigörmek).
- Oda sıcaklığında yapılan enjeksiyonlar sırasında embriyolar görselleştirmek için diseksiyon stereomicroscope 1.6 X büyütme istihdam.
- (Bkz. Tablo reçetesi) bir yatay micropipette puller ve kapiller borosilikat cam kullanarak özel microneedles imal.
-
Termal dalgalanmaları kaydederek sarısı viskoelastik davranışını değerlendirmek
- Dechorionate olarak microinjected embriyo adım 2.1 ve % 0,5 düşük erime noktası özel 30 ° C'de embriyo orta çözümde katıştırmanız Daha sonra onları ( Tablo malzemelerigörmek) cam alt tabakaları bana aktarın ve yönlendirmek ve özel hala sıvı olduğunda onları coverslip doğru itin.
Not: özel oda sıcaklığında katılaşır, embriyo yansıması için hazır olduğunda. - Cam alt levha confocal ters mikroskop 2 h sahnede mikroenjeksiyon sonra monte embriyo yerleştirin. Nano tanecikleri 26 görüntülerini yakalamak bir ters confocal mikroskop Standart ticari mikroskop bilgisayar yazılımı istihdam içinde oda sıcaklığında 63 X amacı ile 25 Hz örnekleme hızında s (piksel boyutunu 166 = nm, her 40 ms yakalanan görüntüleri).
- Parçacıklar cisimlerin konumunu hesaplamak ve açık kaynak ImageJ yazılım (şekil 3B) TrackMate eklentisi ile zaman içinde onların yörüngeleri tanımlayın.
- Her bir parçacık özel yazılım6,30 ile iki boyutlu ortalama kare deplasman (MSD) hesaplamak:
< Δr2 (τ) > = < [x(t + τ) - x(t)]2 + [y(t + τ) - y(t)]2> (8)
Not: Burada t geçen süre ve gecikme süresi. Bir saf viskoz sıvı viskozitesi (ν) göre Stokes-Einstein ilişki MSD ters artar:
< Δr2 (τ) > = 4kB Tτ/ 6πνa, (9)
T mutlak sıcaklık nerede.
- Dechorionate olarak microinjected embriyo adım 2.1 ve % 0,5 düşük erime noktası özel 30 ° C'de embriyo orta çözümde katıştırmanız Daha sonra onları ( Tablo malzemelerigörmek) cam alt tabakaları bana aktarın ve yönlendirmek ve özel hala sıvı olduğunda onları coverslip doğru itin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kortikal gerilim ölçümleri
Her ölçüm noktası için beş kuvvet-deplasman (F-z) eğrileri AFM tarafından 1 Hz değerinde 5 mikron tepe tepe genliği ile konsol ramping tarafından satın alınan (hız = 10 µm/s) ~ 2 µm maksimum bir girinti kadar. Bu yordam az 20 dk alıyordu ve epiboly ilerleme tarafından etkilenmez. Deneysel her koşul en az 5 embriyo test edildi.
Embriyo sarısı cepten kaydedilen kuvvet-deplasman eğrileri aksine bu yumuşak çevreleyen özel karşılık gelen, sergi orantılı doğrusal bir ilişki (R2 > 0.999) (şekil 2A). Biz ek F-z 3 µm/s ve 30 µm/s eğriler ve kortikal gerginlik Tc potansiyel bir bağımlılık prensibine göre hızı üzerine atılan denetim kümesi gerçekleştirilen. Tc sadece 13 oranında artış (p < 0.01, t-Testi) ne zaman hız 10 3 µm/s düşürüldü ve 10 ila 30 µm/s için arttı zaman herhangi bir önemli değişiklik yoktu.
Adlı bir konsol hızı 10 µm/s sarısı hücre üzerinde kuvvet-girinti (F-h) eğrileri hemen hemen doğrusal ve sıvı-balon model (şekil 2B)1donatılmıştır. Bu uygun izin farklı epiboly aşamaları ve farklı pozisyonlarda (iletilen ışık altında tanımlanan) EVL öncü göre ortalama yüzey gerilimi (pN/µm) mutlak değerler hesaplanması (Tablo 1).
Korteksin Reolojisi
Girinti ve retraksiyon kuvvet-deplasman (F-z) eğrileri (şekil 2C) arasındaki farklar embriyo sarısı hücre korteks viskoelastik davranışını gösterir. Düşük genlik (100 nm) multifrekans salınım ölçümleri (bkz. yukarıdaki iletişim kuralı) yumurta sarısı hücre yüzeyine ve elastik ve yapışkan parçalarının etkili karmaşık modül g*(f) hesaplamak için bilgi sağlar.
Korteks Reolojisi Zebra balığı embriyo sarısı hücredeki bir katı gibi davranış viskoz modülü ile 5 kere elastik modül1' den daha düşük hakimdir. Bu davranış Frekansa bağımlı, elastik için de değildir (ANOVA, p 0.123 =), ya da yapışkan mod için (ANOVA, p 0.719 =) (şekil 2B).
Yumurtalı Reolojisi
Sarısı viskozite nanopartikül (bkz: şekil 4A-B) izleme'den elde edilen MSD veriler (5) denkleme yaklaştırarak hesaplanmıştır. Floresan nano tanecikleri sarısı içinde gömülü termal dalgalanmalar MSD gecikme süresi τ, Newton bir sıvı davranışı ile tutarlı orantılı bir bağımlılığı sergiler. Nano tanecikleri toplu Difüzyon katsayıları için ters ilişkilidir, yumurtalı etkili kesme viskozite 129 mPa·s yapıldı.
Şekil 1: AFM Zebra balığı sarısı hücre içinde vivo. (A) Diyagram yukarı ayarlamak açıklayan Zebra balığı sarısı hücre korteks AFM tarafından soruşturma için istihdam. Dechorionated embriyo farklı yaş yarıya kadar özelleştirilmiş özel bloklar halinde oluşturulan, belli bir tercih döndürülmüş ve düşük erime noktası özel ile kenarlarında mühürlü deliğe sokmak. Sarısı hücreleri ile bir konsol (kırmızı) bağlı küresel polistren boncuk probed. (B) yarısı özel içinde gömülü % 50 epiboly, embriyo bitkisel Kutbu'nda bir konsol (kırmızı renkli yanlış) ile probed. (C) B, buna eşdeğer bir embriyo probed sarısı hücreden EVL hücre kenar boşluğu yakın bir bölgede. Ölçek çubukları 100 µm (B ve C) =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Zebra balığı embriyo sarısı hücre kortikal gerginlik ve Reolojisi. (A) kuvvet [saptırma (d)]-deplasman (z) eğriler elde için temsil edici bir embriyo olarak konsol ipucu yaklaşımlar ve örnek [özel yüzey (kontrol) Mavi] ve sarısı hücre yüzeyine kırmızı bağlantı kurar. (B) kuvvet girinti (F-h) eğrileri (n = 3 embriyo, embriyo birbirinden 10 µm olarak başına 3 ölçümleri. Her ölçüm 5 eğrileri ortalamasını temsil eder) ile bir sıvı-balon modelinden (referans1) uygun. Saptırma embriyo sarısı hücre yüzeyi ile temas üzerine doğrusal artış dikkat edin. Kesik çizgili siyah çizgi (hangi kortikal gerginlik çıkarılır) modeline uygun gösterir. (C) yaklaşım (kırmızı) ve retraksiyon (mor) kuvvet-deplasman eğrileri temsil edici bir embriyo için. Eğri kırmızı ve mor okları veri toplama geçici rejim için gelin. Çift başlı ok yaklaşan ve korteks viskoelastik karakterine işaret sapma değerleri geri çeker arasındaki farkı vurgular. (D) alakalıdır sarısı hücre korteksin (n = 5 embriyo). Etkili karmaşık modülü (g *) multifrekans salınım AFM ölçüleri ( 1) den ayıklanır. Kırmızı sembolleri temsil elastik modül (g'), ve mavi semboller tanımlamak viskoz modülü (g″), anılan sıraya göre. Demek ve standart hata (SE) görüntülenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Parçacık izleme microrheology. (A) floresan nano tanecikleri % 50 epiboly, Zebra balığı embriyo sarısı hücresine enjekte. (B) talebiyle rastgele sarısı içinde (solda) Dağıtılmış bireysel nano tanecikleri için takip. Zaman tabii ki nano tanecikleri (cisimlerin) tipik yörüngeleri viskoz Difüzyon karakteristik sergi random yürüyüşler sarısı (2 örnek) içinde gömülü. Ölçek çubuğu = 100 µm (A); 1 µm (B, sol); 200 nm (B, sağ). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Zebra balığı embriyo yumurta sarısı Microrheology. (A) MSDs, bireysel nano tanecikleri (n = 99) ile gecikme süresi yaklaşık doğrusal bir bağımlılık gösterir. (B) ± standart hata MSDs, nano tanecikleri ve viskozite yumurtalı demek. Ensemble MSDs (ortalama - kırmızı çizgi ± SE) nanopartikül nüfus sergiler ağırlıklı olarak viskoz karakter ortalama. İlişki doğrusal eğimi nano tanecikleri diffusive özelliklerini yansıtır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Gerilim (pN/mm) ortalama ± SE | % Epiboly | |||
| 40-50 | 60-70 | 80-90 | ||
| EVL kenar boşluğu Uzaklik | 20 mikron (E-YSL) | - | 60 ± 7 | - |
| 40 mikron (GKB) | 67 ± 11 | 72 ± 5 | 110 ± 7 | |
| Bitkisel kutup | - | 75 ± 3 | - | |
| n her koşul için 3 embriyo (her 5 girintileri) = | ||||
Tablo 1: Spatio-Temporal gerilim dağıtım sarısı hücre yüzeyinde Epiboly sırasında.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İşte malzeme özellikleri ve Zebra balığı sarısı hücre epiboly sırasında bazı biyomekanik parametreleri kolayca AFM ve nano tanecikleri microrheology tarafından tahmin edilebilir olduğunu göstermektedir.
AFM hücre ve dokularda fizyolojik şartlarda4,5,25,28rheological özelliklerini almak için ediyor sağlam geliştirmek için AFM uygulamak için bir protokol buraya geliştirdiğimiz Zebra balığı embriyo sarısı hücre yüzeyine epiboly sırasında test etmek için istihdam embriyo.
Bizim AFM ölçümleri için embriyo yönünü yanında yarı-düşük erime özel gömme ulaşamadılar. Henüz, özel gömme AFM ölçümleri etkilemedi. Özel sertliği yüzeyi küresel bir ipucu ile sondalama tarafından ölçüldü. Bir Young katsayısı (E) 4.2 0.2 bulduk kuvvet-girinti eğrileri Hertz ile uygun tarafından bu jel için Pa iletişim modeli elastik bir vücut düz bir yüzey girintileme bir küre. Verilen bu E 3g', özel 50-fold sarısı hücre korteks (şekil 2B) yumuşak. Bu nedenle, sınırlı kalınlığı ve çok düşük sertlik göz önüne alındığında, embriyo üzerinde kaydedilen AFM ölçümleri son derece güvenilir görünüyor.
Mutlak değerler kortikal gerginlik için AFM veri alınıyor aşırı bakım üzerinde mekanik modeli montaj ile ilgili talepleri olduğunu unutmamak gerekir. Biz bir elastik korteks kapsayan oluşan bir sıvı-balon model istihdam bu sorunu aşmak Zebra balığı sarısı hücresiyle bir çok viskoz sarısı kitle kapsayan bir dış mikrotübüller zengini sitoplazmik tabaka ile benzersiz kompozisyonunu durumunda bir viskoz sıvı. Bu model daha önce leucocytes micropipette aspirasyon28ile küresel AFM ipuçları4ve HeLa hücreleri AFM ile girintili gastrulating Zebra balığı embriyo küresel progenitör hücrelerin kortikal gerginliği tahmin etmek için kullanılan sıkışmış kullanarak22cantilevers.
Biz kortikal gerginlik sarısı hücre yüzeyi ile küçük bir ticari olarak mevcut küresel ipucu girintileme tarafından tahmin. Bu küçük sonda bize doğrudan kortikal gerginlik bölgesel farklılıkları ölçmek izin verdi. Yukarıda açıklandığı gibi kuvvet-girinti veri açısından bir çok az sıvı-balon model (EQ 2) yorumlanır. 3/2 üs ile bir güç yasa olarak girinti ile küresel bir ipucu içeren hücreleri artırmak ve kuvvet eğrileri jelleri yüzeyinde kaydedildi. Buna karşılık, çok iyi EQ 2 ile (şekil 2B) donatılmış bir orantılı güç-girinti ilişki bulduk. Küçük bağımlılığını prensibine göre hız ve düşük g Tc '' /g' oranı (şekil 2B) gösterir korteks mekanik bir elastik davranış tarafından hakimdir.
Sarısı mekaniği bağımsız olarak microparticle Reolojisi ile probed. Doğrusal artış gözlenen MSD, açıkça bir saf viskoz davranışı yansıtır. Bu polimer çözümleri viskozite sonda31boyutuna bağlıdır unutulmamalıdır. Bu nedenle, sarısı viskozite değeri 100 bir sonda ile ölçülen nm çapındaki moleküler üzerinden biraz farklı (örneğin, depolarizasyon bulabilsem) veya makroskopik ölçümleri. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar sıvı-balon model yeterliliği ve kortikal gerginlik ve sarısı viskozite ölçüm sağlamlık için güçlü bir destek sağlar.
Bu yaklaşım kolayca blastoderm mekaniği aynı embriyo veya diğer gelişimsel zaman Puan Zebra balığı ve, sonunda, diğer organizmalar ölçmek için genişletilmiş nedeni. Bu yaklaşım sadece uygun montaj prosedürleri (bkz: başvuru32) mühendislik bağlı olacaktır AFM erişim kolaylaştıran probları doğru yerlere doğru zamanda. Yine de, çoğu hücre ve dokuların geliştirme sırasında sürekli hareket diğer gelişimsel modeller için herhangi bir uygulamada dikkate alınmalıdır. Hücre hareketleri uygulama bu yöntemlerin çok daha zor hale getirecek.
Bazı durumlarda, AFM vivo içinde erişilebilirlik sorunlarını aşmak durumunda geçerli olacaktır. Hem de gelişmekte olan embriyo ve yetişkin, hücreler büyük ölçüde erişilmezdir. Böylece, biyofiziksel özellikleri in situtest etmek için yöntemler istihdam değil bir zorunluluk doğrudan gerektiren olduğunu başvurun. Microrheology izleme nanopartikül bu gereksinimleri6yerine getirir. Bu teknik analiz bireysel parçacıkların Brown talebiyle yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük ile temel alır. Bu nano tanecikleri çevreleyen visko elastik sıvı yerel micromechanical özelliklerini ölçüde doğrudan bir yansımasıdır ve gecikme süresi-bağımlılık onların MSDs. Bu yaklaşım organizmalar geliştirmek için zaten uygulanmış ve C. elegans embriyo sitoplazma30yüksek viskoz karakterini belirlemek için yardımcı oldu. İki büyüklük daha düşük viskozite olmasına rağmen bir Zebra balığı sarısı eşdeğer özelliklere sahip C. elegans embriyolar, görüntüler ortaya çıkardı. MSK bir doğrusal zaman bağımlılığı sarısı viskozite o Zebra balığı yumurtalı benzer değerleri ile son zamanlarda Drosophila33olarak bildirilmiştir.
Her ne kadar biz kendimizi bu olasılığı keşfetmek, enjekte kaplanmamış ve kaplamalı nano tanecikleri son zamanlarda optik cımbız hedef olarak Zebra balığı larva34istihdam edilmiştir. Bütün organizma içinde non-invaziv Embriyolardan sadece doğrudan anlayışlar içine hücre etkileşimleri ama mekanik özellikleri ve faaliyetleri mevcut yaklaşımları kullanarak erişilebilir değil verebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının veya diğer çatışmaları bildirin.
Acknowledgments
Biz Amayra Hernández-Vega ve Philippe-Alexandre Pouille bu protokoller için temel ayarlamak için katıldığınız için teşekkür ederiz. Ayrıca moleküler görüntüleme platformu IBMB-PCB, Xavier Esteban ve üyeleri, laboratuvar sürekli destek için teşekkür ederiz. Generalitat de Catalunya ve DGI ve Ekonomi Bakanlığı ve günümüzde İspanya'dan gelen Consolider hibe EMB ve DN konsolide grupları programı bu çalışmaları destekledi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted optical microscope | Nikon | TE2000 | Visualization of the sample and AFM cantilever |
| Atomic force microscope (AFM) | Custom made | - | Any commercialized AFM could be employed |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Nanorheology data collection |
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | Casting embryos |
| Ultrapure LMP Agarose (low melting) | Invitrogen | 16520-100 | Securing embryos |
| Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds | World Precision Instruments | Z-MOLDS | Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter |
| Si3N4 cantilever | Novascan | PT.GS | Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 µm diameter and k=0.01 N/m |
| Fluorescent nanoparticles | Life Technologies | FluoSpheres F8811, | For tracking nanorheology |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | Fabricating tailored microneedles |
| Borosilicate capillary glass | Warner Instruments | G100TF-4 | Fabricating tailored microneedles |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | Manipulating the micropipette |
| Microinjector | Eppendorf | FemtoJet Express | Controlling injection time and pressure |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the embryos during injection |
| Analysis Software | MathWorks | Matlab | Analyzing AFM and particle tracking data |
| Zebrafish | AB and TL wild type | - | Strains employed for embryo collection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting embryos for nanorheology data collection |
| Stage micrometer | FST | 29025-02 | Measuring injection volume |
References
- Hernandez-Vega, A., et al. Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements. EMBO J. 36, 25-41 (2017).
- Brodland, G. W., et al. Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).
- Grill, S. W. Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis. Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).
- Koser, D. E., et al. Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain. Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).
- Wirtz, D. Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- de Pablo, P. J., Carrión-Vázquez, M. Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).
- Roca-Cusachs, P., et al. Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy. Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophys J. 56, 151-160 (1989).
- Fabry, B., et al. Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914 (2003).
- Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Dev Biol. 401, 165-174 (2015).
- Chevalier, N. R., et al. Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues. Methods. 94, 120-128 (2016).
- Reichlin, T., et al. Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy. J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).
- Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation. J Biomech. 31, 21 (1998).
- Grant, C. A., et al. Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy. J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).
- Efremov, Y. M., et al. Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos. Micron. 42, 840-852 (2011).
- Henkels, J., et al. Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis. Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).
- Solnica-Krezel, L. Gastrulation in zebrafish -- all just about adhesion? Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).
- Kimmel, C. B., et al.
- Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms. Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).
- Campinho, P., et al. Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly. Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).
- Fischer-Friedrich, E., et al. Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells. Sci Rep. 4, 6213 (2014).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).
- Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).
- Jorba, I., et al. Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy. J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).
- Lomakina, E. B., et al. Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation. Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).
- Alcaraz, J., et al. Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever. Langmuir. 18, 716-721 (2002).
- Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos. Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).
- Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).
- Soroldoni, D., et al. Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation. Science. 345, 222-225 (2014).
- He, B., et al. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508, 392-396 (2014).
- Johansen, P. L., et al. Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish. Nat Commun. 7, 10974 (2016).
