Summary
La falta de herramientas para medir las propiedades del material y parámetros tensional en vivo impide validar sus papeles durante el desarrollo. Se emplean microscopía de fuerza atómica (AFM) y nanopartículas de seguimiento para cuantificar características mecánicas en la célula de yema de embrión intacto de pez cebra durante epiboly. Estos métodos son fiables y ampliamente aplicables evitando intervenciones intrusivas.
Abstract
Dilucidar los factores que dirigen la organización espacio-temporal de la evolución de los tejidos es uno de los objetivos primordiales en el estudio del desarrollo. Varias proposiciones afirman han sido contribuciones importantes a la comprensión de las propiedades mecánicas de las células y tejidos en su organización espacio-temporal en los diferentes procesos morfogenéticos y de desarrollo. Sin embargo, debido a la falta de herramientas fiables y accesibles para medir las propiedades del material y parámetros tensional en vivo, validación de estas hipótesis ha sido difícil. Aquí presentamos métodos empleando microscopía de fuerza atómica (AFM) y rastreo con el fin de cuantificar las propiedades mecánicas de la célula de yema de embrión de pez cebra intacto durante epiboly de partículas. Epiboly es un proceso conservado principios cuyo estudio es facilitada por la transparencia del embrión. Estos métodos son fáciles de implementar, fiable y ampliamente aplicable ya que superan las intervenciones intrusivas que pueden afectar la mecánica del tejido. Se aplicó una estrategia simple para el montaje de especímenes, grabación de AFM e inyecciones de nanopartículas y seguimiento. Este enfoque hace que estos métodos fácilmente adaptable a otras épocas del desarrollo u organismos.
Introduction
Los principios físicos subyacentes el control biomecánico de procesos morfogenéticos son en gran parte indefinidos. Mientras que estudios biomecánicos en el nivel molecular y celular están cobrando impulso considerable, la exploración de los parámetros biomecánicos en el nivel de tejido/organismo está en su infancia. Hidrodinámica de la regresión1 o Video microscopia de la fuerza2 permiten a los investigadores distinguir fuerzas activas y pasivas, mientras que el láser microcirugía3, o el menos intrusiva microscopía de fuerza atómica (AFM) de células disociadas4 o en vivo 5 o nanopartículas microrheology6 permite la anticipación de respuestas y propiedades mecánicas de los tejidos.
AFM es una técnica topográfica tridimensional de alta resolución atómica resolución de rugosidad de la superficie y el cumplimiento de la desviación de consejos de voladizo al entrar en contacto con una superficie sondeado7. Se han desarrollado diferentes metodologías con AFM para investigar propiedades de superficie, incluyendo medición de fricción, fuerzas de adhesión y propiedades viscoelásticas de materiales diversos. Recientemente, AFM ha emergido como una potente herramienta para recuperar información sobre las propiedades mecánicas de muestras biológicas. En particular, AFM puede extraer forma no invasiva el módulo de corte complejo de las células aplicando sangrías oscilatorias con una punta micro conectada a un voladizo de la constante flexión conocido8. Esto nos permite inferir las fuerzas resultantes. Sin embargo, AFM no es único y diferentes metodologías permiten extraer datos de reología y propiedades mecánicas de las células individuales (p. ej., micropipeta aspiración9, magnético de torsión citometría (MTC)10o uniaxial extensible prueba11).
Sin embargo, la aplicación de estas metodologías novedosas en complejos procesos morfogenéticos no es sencilla. Los principales desafíos que enfrentan al determinar las propiedades mecánicas de los tejidos embrionarios son los pequeños (μm a mm), suave (en el 102 - 104 gama de Pa) y la naturaleza visco-elástica (dando lugar a fenómenos dependientes del tiempo) de los materiales12. Por lo tanto, es importante adaptar los métodos empleados para la determinación de propiedades mecánicas (rigidez, viscosidad, adherencia) para el caso concreto de los embriones y organismos en desarrollo. Dos cuestiones importantes deben tenerse en cuenta al analizar los métodos reológicos para el estudio de desarrollo: para evitar interferencia intrusa y proporcionar accesibilidad. En este escenario, aspiración de la micropipeta, MTC y ensayos de tracción presentan limitaciones. En el primer caso, la alta deformación que sufre una célula podría alterar sus propiedades fisiológicas y mecánicas9. En el segundo caso, la necesidad de adherirse firmemente el tejido experimental a un sustrato para que las tensiones aplicadas deforman el citoesqueleto localmente también puede introducir efectos en el estado de activación de las células y, por lo tanto, en sus características mecánicas10 . Últimos enfoques extensibles uniaxiales están limitados por la geometría de desarrollar organismos y accesibilidad11.
AFM parece ser más adecuado para el estudio de procesos de desarrollo ya que permite el estudio de muestras biológicas directamente en su ambiente natural sin ninguna preparación engorrosa. Por otra parte, como la disociación de los tejidos embrionarios es generalmente difícil, el reducido tamaño de sondas de AFM proporciona un alto grado de versatilidad sin limitación en la elección del tipo de medio (acuoso o no acuoso), temperatura de la muestra o producto químico composición de la muestra. AFM es suficientemente versátil para ser aplicada a grandes dominios y escalas de tiempo y se ha empleado para recuperar propiedades de los materiales de los tejidos en distintas etapas de desarrollo o en condiciones fisiológicas. Conjunto nativos tejidos como las arterias13 o huesos14 han sido estudiados desde un punto de vista topográfico y en algunos casos, como la esclerótica, propiedades mecánicas han sido obtenido15. Topografía se ha explorado también en embriones vivos permitiendo la visualización de, por ejemplo, cambio de celular durante la morfogénesis en Xenopus16. Protocolos de preparación de muestra última y completa se han desarrollado para determinar parámetros mecánicos durante diferentes procesos de desarrollo. Se han generado mapas de nanoindentación en secciones de tejido interpretaciones nativas para la chica tubo digestivo embrionario11; propiedades adhesivas y mecánicas obtenido por ectodermo, mesodermo y endodermo progenitoras células individuales aisladas de embriones de pez cebra gastrulating4; mediciones de rigidez para el epiblasto y la línea primitiva en explantes de embriones aviar17; y un patrón distinto de gradientes de rigidez definida directamente en el cerebro embrionario de Xenopus5.
Un salto cualitativo importante para la aplicación de AFM para explorar desarrollo embrionario puede provenir de acercarse a procesos morfogenéticos acceso sencillos. Pez cebra epiboly es un evento esencial y conservado, en el que diferentes tejidos coordinarán en un espacio esférico restringido para dirigir la expansión del blastoderm en pocas horas. En el inicio de pez cebra epiboly (etapa esférica), una capa superficial de células, la capa envolvente (EVL), cubre una tapa semiesférica de blastómeros centrado en el polo animal del embrión sentado en una célula sincicial yema masiva. Epiboly consiste en la expansión de la cortical ward vegetal de la Vet, las células profundas (DCs) del blastoderm y la capa externa de la célula sincicial yema (E YSL) alrededor de la yema. Epiboly termina con el cierre de la Vet y los controladores de dominio en el polo vegetal18,19,20. Cómo y donde las fuerzas se generan durante el epiboly y cómo se juntan a nivel mundial todavía no está claro de1,21.
Aquí describimos en detalle cómo aplicar AFM para inferir propiedades mecánicas pasivas del tejido durante la progresión del epiboly en la yema de huevo de pez cebra de la célula en vivo. Para ello, empleamos pequeñas microesferas atadas AFM voladizos como sondas. Esto permite la recuperación de información local precisa dentro de la superficie de la célula de yema no uniforme y gradientes tensionales y su dinámica en el tiempo. AFM alternativo enfoques tales como utilizando ménsulas de cuña22, serán datos locales no render que es bastante precisos. La técnica de cuña, que requiere habilidades de manipulación muy cuidadosa para pegar una cuña más grande que el tamaño de la muestra en el extremo del voladizo, no está bien adaptada para sondear el embrión (~ 2 más grande que la longitud del voladizo) mecánica.
Modelado y caracterización de las propiedades viscoelásticas de las células de manera cualitativa y cuantitativa permiten una mejor comprensión de su biomecánica. Desde un punto de vista biomecánico, es esencial entender epiboly y no sólo demanda conocimiento de las medidas corticales de tensión y dinámica, que puede ser extraído por AFM; por lo tanto hay necesidad de información sobre las propiedades biofísicas del tejido. Para extraer esta información, se han desarrollado una variedad de técnicas de reología celular durante los años para caracterizar diversos tipos celulares bajo diferentes condiciones fisiológicas23. Incluyen AFM, MTC y pinzas ópticas (OT). Estos métodos, sin embargo, se ha demostrado insuficientes para análisis mesoscópica en la escala de embriones o de los órganos. Como alternativa, nos hemos adaptado con éxito seguimiento de nanopartículas microrheology6 para en vivo las medidas reológicas. Esta técnica analiza los desplazamientos browniano de las partículas individuales y deduce propiedades locales micromechanical.
Junto microrheology AFM y nanopartículas permiten la definición de cortical tensional dinámica y propiedades mecánicas internas de la yema durante epiboly. Esta información apoya plenamente un modelo en el que tensión anisotrópica se desarrolla como consecuencia de las diferencias en la respuesta de deformación de la Vet y la capa citoplasmática de yema de huevo (YCL) a la contracción isotrópica actomyosin de la corteza E YSL es esencial para el movimiento neto direccional del EVL y epiboly progresión1.
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Protocol
Todos los pasos del Protocolo se describen a continuación siguen las pautas de cuidado de los animales de nuestras instituciones.
1. pez cebra cultura
- Criar y mantener el pez cebra adulto en condiciones normales.
Nota: AB y TL tipo salvaje embriones se utilizaron para este estudio. - Recoger embriones y cultivarlas a 28,5 ° C en el E3 embrión media24. Etapa según la morfología descrita19.
2. microscopía de fuerza atómica
- Manualmente en dechorionate escena embriones de pez cebra (de diferentes edades según los intereses individuales). Quitar chorions con dos pinzas finas y afiladas (véase Tabla de materiales).
- El corion usando un fórceps de agarre y hacer un rasgón en ella con las otras pinzas. Luego, sosteniendo el corion en una región opuesta a la de la lágrima, empuje el embrión suavemente a través de la abertura.
- Realizar la dechorionation bajo un estereomicroscopio disección con un rango ajustable de aumento entre 8 X y 50 X.
- Montar los embriones para AFM
- Preparar una solución de agarosa al 2% en medio del embrión y llenar un plato de Petri de 35 mm con esto. Dejar solidificar. Hacer agujeros pequeños de 1.5 mm de diámetro (dos veces el tamaño del embrión) y aproximadamente 350 μm profundidad (la mitad del tamaño de embriones) con unas pinzas finas en la cama de agarosa.
- Coloque los embriones en las estocadas en la capa de agarosa y asegurar que derriten en lugar esparciendo alrededor de una solución de 0,5% bajo agarosa en medio embrión. Vierta esta solución alrededor de sólo los embriones para garantizar en los agujeros.
- Antes de la agarosa de bajo punto de fusión se solidifica a temperatura ambiente, gire los embriones de tal manera que la región de interés a ser sondeado por AFM hacia arriba (figura 1A).
- Examinar los embriones por AFM
- Localice y los embriones en la placa de Petri con un objetivo de 20 X en un microscopio de fuerza atómica invertida de la imagen (véase Tabla de materiales25) a temperatura ambiente (23-24 ° C).
Nota: Los embriones se mantienen vivos inmerso en medio del embrión y atado a la cama de agarosa. - Sonda de la superficie de la célula de yema de huevo de embriones casted empleando granos esféricos del poliestireno de 4,5 μm de diámetro conectado a un voladizo con una constante de resorte nominal 0,01 N/m. fijar la amplitud de pico a pico de la oscilación voladiza a 5 μm y su frecuencia de 1 Hz.
- Recopilar datos para cada región a probarse en diferentes posiciones y en varios embriones, como una rutina, para un promedio de datos.
Nota: Un buen punto de partida es sonda cinco posiciones situados en el centro y en las esquinas de un cuadrado de μm 10 μm x 10 controlando la posición de voladizo con los actuadores piezoeléctricos XY del microscopio AFM. Colección de imágenes y datos tomó alrededor de 20 min por embrión. Grabación de datos en diferentes regiones de la superficie de células de yema de embrión, por ejemplo, el polo vegetal o diferentes regiones cerca de la margen de las células EVL (figura 1B y 1C), sólo es posible mediante el empleo de distintas muestras orientadas de manera diferente.
- Localice y los embriones en la placa de Petri con un objetivo de 20 X en un microscopio de fuerza atómica invertida de la imagen (véase Tabla de materiales25) a temperatura ambiente (23-24 ° C).
- Calcular las fuerzas
- Medir el desplazamiento vertical de la micropalanca AFM (z) con sensores del calibrador de tensión acompañados a actuadores piezoeléctricos y su desviación (d) mediante un fotodiodo de cuadrante mediante el método de la palanca óptica con el software de control de microscopio (véase Tabla de materiales 25).
- Utilizar la pendiente de una curva de d z obtenida de los datos recogidos de una región pelada de un cubreobjetos de vidrio para calibrar la correlación entre la señal del fotodiodo y la deflexión del cantilever (d).
Nota: El desplazamiento vertical medido es igual a la deflexión del cantilever y la pendiente representa la sensibilidad de deflexión de la palanca óptica26. - Deducir que la constante de resorte voladizo (k) de las fluctuaciones térmicas como se ha descrito27.
- Calcular la muesca de la muestra (h) como:
h = (z - zc) -(d - dde) (1)
Nota: Aquí zc es la posición del punto de contacto y dfuera es el desplazamiento del fotodiodo. - Calcule la fuerza (F) en el voladizo como:
F = k · d (2)
- Calcular la tensión de la corteza en términos de un modelo de globo de líquido compuesto por una capa cortical tensión Tc que encierra un líquido viscoso. En este modelo, para marcas pequeñas (en comparación con el tamaño del embrión), fuerza aumenta proporcionalmente4,28 como:
F = 4π Tc[(Rb / Re) + 1)] h (3)
Nota: Aquí Rb es el radio del talón y e de la R es el radio del embrión. Para el embrión de pez cebra, como el radio del embrión (400 μm) es dos órdenes de magnitud más grandes que el del grano (2,25 μm), esta ecuación se puede aproximar como:
F = 4π Tc h (4)- Calcular la fuerza de tensión-sangría (F-h) punto de curvas en cada región de célula de yema de embrión para cinco diferentes medidas.
- Calcular la Tc para cada F-h curva por mínimos cuadrados no lineal apropiado. Para el análisis estadístico, la tensión de la cortical Tc computada debe un promedio de las diferentes F-h curvas.
- Medir las propiedades viscoelásticas (reología) de la corteza mediante la aplicación de baja amplitud (100 nm) oscilaciones de multifrecuencia en AFM compuesto de ondas sinusoidales de diferentes frecuencias25.
- Calcular un módulo complejo efectivo g*(ƒ) en el dominio de la frecuencia de las curvas de indentación de fuerza como:
g * (f) = [F(f) / h(f)]- ifb (5)
aquí i es la unidad imaginaria y F(f) y h(f) son los espectros de frecuencia (f) de la fuerza y sangría. b es la corrección para el arrastre viscoso en el voladizo extraído de las oscilaciones que se aplica sobre la superficie. - Separado g*(ƒ) en partes real e imaginarias como:
g * (Ƒ) = g' (f) + ig'' (f) (6)
em > g'(f) es el módulo elástico y es una medida de la energía elástica almacenada y recuperada por ciclo de oscilación. g'' (f) es el módulo viscoso que representa la energía disipada. - Calcular la tangente de la pérdida, que proporciona un índice del sólido-como (< 1) o líquido (> 1) comportamiento del material, como:
g'' (f) / g' (f) (7)
Nota: Con este tipo de medición, es posible extraer parámetros indicando cómo viscoso y elástico como es el material sondeado. Aunque b un poco depende de la distancia del extremo del voladizo a la superficie, dados los muy bajos valores de g´´ exhibida por la yema de la célula (véase más abajo la Figura 2D ), pequeñas variaciones en b tienen un impacto insignificante en medidas29.
- Calcular un módulo complejo efectivo g*(ƒ) en el dominio de la frecuencia de las curvas de indentación de fuerza como:
3. partículas seguimiento Microrheology
-
Realizar la microinyección de partículas en la célula de yema de huevo
- Fabricar a medida microneedles usando un extractor de micropipeta horizontal y del borosilicate capilar (véase Tabla de materiales).
- Preparar microneedles que tienen un diámetro exterior de 1,00 mm, un diámetro interno de 0,58 mm y una longitud de 10 cm tirador parámetros: presión: 500; Calor: 510; Pull: 65; Velocidad: 25; Tiempo: 50.
- Preparar una placa de Petri de inyección mediante la creación de carriles de hendidura recta en una agarosa al 1% en la cama medio embrión empleando moldes hechos personalizados (véase Tabla de materiales).
- Ponga los moldes boca abajo y coloque en la parte superior del gel de agarosa líquida y retirar los moldes una vez que el gel se ha solidificado. Pipetear los embriones en los surcos hechos por el molde en la agarosa bajo un estereomicroscopio disección con 1,2 aumentos.
Nota: El ancho y el diseño de los moldes permiten los embriones alinear el auto.
- Ponga los moldes boca abajo y coloque en la parte superior del gel de agarosa líquida y retirar los moldes una vez que el gel se ha solidificado. Pipetear los embriones en los surcos hechos por el molde en la agarosa bajo un estereomicroscopio disección con 1,2 aumentos.
- Antes de la inyección, eliminar casi completamente el medio para facilitar la inyección (la tensión superficial impide que el embrión/corion pegado a la aguja al retirar después de la inyección).
- Microinject de nanopartículas fluorescentes (radio a = 100 nm, véase Tabla de materiales) diluido en agua (1:1, 000) en la parte vegetal de la célula de yema de embrión (Figura 3A).
- Ajustar la micropipeta con micromanipuladores precisión e inyecte los granos con una microinyectora automática con controles de tiempo y presión (véase Tabla de materiales). Ajustar la presión entre 10 y 20 psi.
- Antes de inyectar la solución grano, calibrar el volumen a inyectar (0,5 nL) midiendo el tamaño de la gotita entregado por la microinyectora con un micrómetro de 1 x 0.01 m m (véase la Tabla de materiales).
- Emplear un aumento de 1.6 X en el estereomicroscopio disección para visualizar los embriones durante las inyecciones, que se realizan a temperatura ambiente.
- Fabricar a medida microneedles usando un extractor de micropipeta horizontal y del borosilicate capilar (véase Tabla de materiales).
-
Evaluar el comportamiento viscoelástico de la yema mediante el registro de las fluctuaciones térmicas
- Dechorionate los embriones microinyectados en paso 2.1 e incrustarlos en una baja de 0,5% derretir la agarosa de punto en la solución de medio de embrión a 30 ° C. Luego, transferirlos a las placas de fondo de cristal (véase Tabla de materiales) y Oriente y empujarlos hacia el cubreobjetos cuando la agarosa es líquido inmóvil.
Nota: Cuando la agarosa se solidifique a temperatura ambiente, los embriones están listos para ser reflejada. - Coloque los embriones montados en las placas de fondo de cristal en el escenario de un microscopio confocal invertido 2 h después de la microinyección. Capturar imágenes de las nanopartículas para 26 s a una frecuencia de muestreo de 25 Hz con un objetivo X 63 a temperatura ambiente en un microscopio confocal invertido empleando el software del microscopio comerciales estándar (tamaño de pixel = 166 nm, imágenes capturadas cada 40 ms).
- Calcular la posición de los centroides de las partículas y definir sus trayectorias en el tiempo con el plugin TrackMate de la open source software ImageJ (figura 3B).
- Calcular el desplazamiento de media cuadrada bidimensional (MSD) de cada partícula con software a la medida6,30 como:
< Δr2 (τ) > = < [x(t + τ) - x(t)]2 + [y(t + τ) - y(t)]2> (8)
Nota: Aquí t es el tiempo transcurrido y el desfase de tiempo. En un líquido viscoso puro, MSD aumenta inversamente con viscosidad (ν) según la relación de Stokes-Einstein:
< Δr2 (τ) > = 4kB Tτ/ 6πνa, (9)
donde T es la temperatura absoluta.
- Dechorionate los embriones microinyectados en paso 2.1 e incrustarlos en una baja de 0,5% derretir la agarosa de punto en la solución de medio de embrión a 30 ° C. Luego, transferirlos a las placas de fondo de cristal (véase Tabla de materiales) y Oriente y empujarlos hacia el cubreobjetos cuando la agarosa es líquido inmóvil.
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Representative Results
Mediciones de tensión cortical
Para cada punto de medición, cinco curvas de fuerza-desplazamiento (F-z) fueron adquiridas por AFM por rampa del cantilever en 1 Hz con una amplitud pico a pico de 5 μm (velocidad = 10 μm/s) hasta una muesca máxima de ~ 2 μm. Este procedimiento fue tomando menos de 20 minutos y no fue afectado por la progresión de epiboly. Cada condición experimental se probó en embriones de al menos 5.
Las curvas de fuerza-desplazamiento en la celda de yema de embrión, por el contrario a los correspondientes a la agarosa suave circundante, exhiben una relación lineal proporcional (R2 > 0.999) (figura 2A). Realizamos juegos adicionales de control F-z curvas a 3 μm/s y 30 μm/s y descarta una dependencia potencial de tensión cortical Tc de la velocidad del voladizo. Tc aumentó sólo en un 13% (p < 0.01, prueba de t) cuando la velocidad se redujo de 10 a 3 μm/s y no mostraron ningún cambio significativo cuando se incrementó de 10 a 30 μm/s.
Curvas de fuerza-sangría (F-h) grabadas a una velocidad de voladizo de 10 μm/s en la célula de la yema estaban casi lineal y con un modelo de globo de líquido (figura 2B)1. Este adaptador permite el cálculo de los valores absolutos de la tensión superficial media (pN/μm) en epiboly diferentes etapas y en diferentes posiciones en relación a la vanguardia EVL (identificado bajo luz transmitida) (tabla 1).
Reología de la corteza
Las diferencias entre la sangría y la retracción de las curvas de fuerza-desplazamiento (F-z) (figura 2) indican un comportamiento viscoelástico de la corteza de células de yema de embrión. Baja amplitud (100 nm) medidas de oscilación de multifrecuencia proporcionan la información para calcular el efectivo módulo complejo g*(ƒ) de la superficie de la célula de yema de huevo y sus componentes elásticos y viscosos (ver protocolo de arriba).
La reología de la corteza en la celda de yema de embrión de pez cebra predomina un comportamiento sólido-como con el módulo viscoso 5 veces menor que el módulo de elasticidad1. Este comportamiento no es frecuencia dependiente, ya sea para el elástico (ANOVA, p = 0.123), o para el módulo viscoso (ANOVA, p = 0.719) (Figura 2D).
Reología de la yema
La viscosidad de la yema se calculó ajustando la ecuación (5) a los datos MSD de nanopartículas de seguimiento (ver Figura 4A-B). El MSD de fluctuaciones termales de nanopartículas fluorescentes encajadas la yema de huevo presenta una dependencia proporcional en el intervalo de tiempo τ, consistente con el comportamiento de un líquido newtoniano. La viscosidad efectiva del esquileo de la yema, que es inversamente proporcional a los coeficientes de difusión masiva de las nanopartículas, fue 129 mPa·s.
Figura 1: AFM de pez cebra células de yema de huevo en vivo. (A) diagrama que describe el conjunto hasta empleadas para sondear la corteza de células de yema de huevo de pez cebra por AFM. Dechorionated embriones de diferentes edades fueron a mitad de camino insertado en los agujeros creados en bloques de agarosa modificado para requisitos particulares, girada en una orientación particular y sellado en los bordes con agarosa de bajo punto de fusión. Las células de la yema se sondeaba con granos del poliestireno esféricos Unidos a un voladizo (rojo). (B) embrión en epiboly 50% mitad incrustada en agarosa sondeado con un voladizo (falso coloreado en rojo) en el polo vegetal. (C) un embrión equivalente a en B, sondeado en la celda de yema de huevo en una región cerca de la margen de las células EVL. Barras de escala = 100 μm (B y C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Pez cebra embrión yema de la célula cortical tensión y reología. (A) fuerza [desviación (d)]-curvas de desplazamiento (z) obtienen para un embrión representativo como la punta del voladizo se acerca y entra en contacto con la muestra [la agarosa en la superficie (control) en azul] y la superficie de la célula de yema en rojo. (B) curvas de sangría (F-h) de la fuerza (n = 3 embriones, 3 mediciones por embrión a una distancia de 10 μm de uno a. Cada medición representa la media de 5 curvas) con un globo de líquido modelo (referencia1). Tenga en cuenta el aumento lineal de la desviación al contacto con la superficie de la célula de yema de embrión. La línea negra punteada muestra el ajuste al modelo (de la cual se infiere la tensión de la cortical). (C) aproximación (rojo) y retracción (púrpura) curvas de fuerza-desplazamiento de un embrión de representación. Flechas curvas de rojas y púrpura indican el régimen temporal de recogida de datos. La flecha de dos puntas destaca la diferencia entre la aproximación y retraer los valores de la desviación hacia el carácter viscoelástico de la corteza. Viscoelasticidad (D) de la corteza de la célula de yema de huevo (n = 5 embriones). Eficaz módulo complejo (g *) había extraída de las oscilaciones de multifrecuencia AFM las mediciones ( 1). Símbolos rojos representan el módulo elástico (g'), y azul símbolos definen el módulo viscoso (g″), respectivamente. Media y Error estándar (SE) se muestran. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Microrheology de seguimiento de partículas. Nanopartículas fluorescentes (A) se inyectan en la célula de la yema de los embriones de pez cebra en epiboly del 50%. (B) desplazamientos fueron seguidos de nanopartículas individuales distribuidas al azar dentro de la yema (izquierda). Curso temporal de las trayectorias típicas de nanopartículas (centroides) había encajado dentro de la yema de huevo (2 ejemplos) paseos de exhibición al azar que son características de la difusión viscosa. Barra de escala = 100 μm (A); 1 μm (B, izquierda); 200 nm (B, derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Microrheology de la yema de embrión de pez cebra. (A) MSDs de nanopartículas individuales (n = 99) exhiben una dependencia aproximadamente lineal con el tiempo. (B) promedio ± error estándar MSDs de las nanopartículas y la viscosidad de la yema. Conjunto un promedio de MSDs (media - línea roja ± SE) del carácter predominantemente viscoso nanopartículas población exhibe. La pendiente lineal de la relación refleja las propiedades de difusión de las nanopartículas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tensión (pN/mm) media ± SE | % de Epiboly | |||
| 40-50 | 60-70 | 80-90 | ||
| Distancia al margen EVL | 20 μm (E YSL) | - | 60 ± 7 | - |
| 40 μm (YCL) | 67 ± 11 | 72 ± 5 | 110 ± 7 | |
| Polo vegetal | - | 75 ± 3 | - | |
| n = 3 embriones (5 muescas en cada uno) para cada condición | ||||
Tabla 1: Distribución de Spatio-Temporal de la tensión en la superficie de células de la yema durante Epiboly.
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Discussion
Aquí nos muestran que las propiedades del material y algunos parámetros biomecánicos de la célula de yema de huevo de pez cebra durante epiboly pueden ser fácilmente estimadas por AFM y nanopartículas de microrheology.
Mientras que AFM se ha empleado para recuperar características reológicas de las células y tejidos en condiciones fisiológicas4,5,25,28, aquí hemos desarrollado un protocolo para la aplicación de AFM a desarrollar intacto embriones que emplean para probar la superficie de la célula de yema de embrión de pez cebra durante epiboly.
Para nuestras mediciones de AFM, la orientación de los embriones fue asegurada por medio incrustándolos en agarosa de fusión baja. Sin embargo, incrustación de agarosa no afectó a mediciones de AFM. La rigidez de la agarosa se midió mediante el análisis de su superficie con una punta esférica. Encontramos el módulo de Young (E) de 4,2 0,2 Pa este gel ajustando las curvas de fuerza-muesca con las Hertz en contacto con el modelo de una esfera aplicar sangría a una superficie plana de un cuerpo elástico. Dado que E 3g', la agarosa fue 50 veces más suave que la corteza de la célula de yema de huevo (Figura 2D). Por lo tanto, teniendo en cuenta su espesor limitado y muy baja rigidez, las medidas AFM sobre el embrión parecen ser extremadamente confiable.
Es importante tener en cuenta que recuperar valores absolutos para la tensión cortical de datos AFM exige mucho cuidado en con respecto a la conexión mecánica modelo. En el caso de la célula de yema de huevo de pez cebra, con su composición única con una rico en microtúbulos citoplásmicos la capa externa que comprende una masa de yema muy viscosos, eludir este problema empleando un modelo de globo de líquido compuesto por una corteza elástica que encierra una líquido viscoso. Este modelo se ha utilizado previamente para estimar la tensión de la cortical de leucocitos con micropipeta aspiración28, células progenitoras esférico de gastrulating embriones de pez cebra indentadas con esférico de puntas AFM4y las células HeLa con AFM usando la cuña voladizos22.
Calculamos la tensión de la cortical de la célula de yema por sangría su superficie con una punta esférica pequeña disponible en el mercado. Este pequeño sondeo nos permitió medir directamente las diferencias regionales en la tensión de la cortical. Como se describió anteriormente, datos de fuerza sangría fueron interpretados en términos de un modelo de globo de líquido mínimo (EQ. 2). Curvas de fuerza registran en la superficie del gel y las células con una punta esférica aumentan con la marca como una ley de potencia con un exponente 3/2. Por el contrario, encontramos una relación proporcional de indentación de fuerza muy bien equipada con 2 EQ (figura 2B). La dependencia poco de Tc a la velocidad del voladizo y la baja de g' /g' relación (Figura 2D) indica que la mecánica de la corteza está dominada por un comportamiento elástico.
Mecánica de yema fueron sondada independientemente con micropartículas de reología. El aumento lineal de MSD observado refleja claramente un comportamiento viscoso puro. Cabe señalar que la viscosidad de soluciones de polímeros depende del tamaño de la punta de prueba31. Por lo tanto, el valor de la viscosidad de la yema mide con una sonda de 100 nm de radio podría diferir un poco de molecular (por ejemplo, fluorescencia despolarización) o macroscópica. Tomados en conjunto, estos resultados proporcionan apoyo para la adecuación del modelo de globo de líquido y la robustez de las mediciones de viscosidad corticales de tensión y yema de huevo.
Razonamos que este enfoque podría ampliarse fácilmente para medir la mecánica blastoderm en los embriones de la misma o a otros puntos de tiempo de desarrollo en el pez cebra y, eventualmente, a otros organismos. Esta aproximación sólo dependerá de ingeniería procedimientos de montaje apropiado (véase la referencia32) facilitar el acceso de la AFM Sondas a los lugares correctos en el momento adecuado. Aún así, el movimiento continuo de la mayoría de las células y tejidos durante el desarrollo debe tenerse en cuenta en cualquier aplicación de otros modelos de desarrollo. Movimientos celulares hará que la aplicación de estos métodos mucho más difícil.
En algunos casos, AFM en vivo sería inaplicable si no pueden superarse los problemas de accesibilidad. Tanto en adultos y embriones en desarrollo, las células son en gran parte inaccesibles. Así, para probar propiedades biofísicas en situ, es imprescindible emplear métodos no requiriendo directa de contacto. Nanopartículas de seguimiento microrheology cumple con estos requisitos6. Esta técnica se basa en el análisis de alta resolución espacial y temporal de los desplazamientos browniano de las partículas individuales. Las propiedades de micromechanical local del fluido viscoelástico que rodea estas nanopartículas es un reflejo directo de la medida y tiempo dependencia de sus MSDs. Este enfoque ya ha sido aplicado al desarrollo de organismos y ha ayudado a determinar el carácter altamente viscoso de la C. elegans embriones citoplasma30. Hemos descubierto que una yema de huevo de pez cebra muestra propiedades equivalente con C. elegans embriones, aunque su viscosidad es dos órdenes de magnitud menor. Una dependencia de tiempo lineal de MSD con similares valores de viscosidad de yema a las de la yema de huevo de pez cebra se ha divulgado recientemente en Drosophila33.
Aunque no exploramos esta posibilidad nosotros, nanopartículas recubiertas y sin recubrimiento inyectadas han sido recientemente empleadas como blancos de pinzas ópticas en larvas de pez cebra34. Micromanipulación no invasiva dentro de un organismo conjunto puede dar ideas no sólo directos en las interacciones de la célula pero en propiedades mecánicas y las actividades no se puede acceder utilizando los enfoques existentes.
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Disclosures
Los autores declaran no intereses financieros que compiten u otros conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a Amayra Hernández-Vega y Philippe Alexandre Pouille por participar en la creación de la base de estos protocolos. También agradecemos a la plataforma de proyección de imagen Molecular IBMB-PCB, Xavier Esteban y los miembros del laboratorio de apoyo continuo. El programa de grupos consolidados de la Generalitat de Catalunya y DGI y becas Consolider del Ministerio de economía y competitividad de España OE y DN apoya esta labor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted optical microscope | Nikon | TE2000 | Visualization of the sample and AFM cantilever |
| Atomic force microscope (AFM) | Custom made | - | Any commercialized AFM could be employed |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Nanorheology data collection |
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | Casting embryos |
| Ultrapure LMP Agarose (low melting) | Invitrogen | 16520-100 | Securing embryos |
| Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds | World Precision Instruments | Z-MOLDS | Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter |
| Si3N4 cantilever | Novascan | PT.GS | Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 µm diameter and k=0.01 N/m |
| Fluorescent nanoparticles | Life Technologies | FluoSpheres F8811, | For tracking nanorheology |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | Fabricating tailored microneedles |
| Borosilicate capillary glass | Warner Instruments | G100TF-4 | Fabricating tailored microneedles |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | Manipulating the micropipette |
| Microinjector | Eppendorf | FemtoJet Express | Controlling injection time and pressure |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the embryos during injection |
| Analysis Software | MathWorks | Matlab | Analyzing AFM and particle tracking data |
| Zebrafish | AB and TL wild type | - | Strains employed for embryo collection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting embryos for nanorheology data collection |
| Stage micrometer | FST | 29025-02 | Measuring injection volume |
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