I denne protokol, fluorescently mærket T. cruzi blev sprøjtet ind i gennemsigtige zebrafisk larver og parasit motilitet blev observeret i vivo ved hjælp af lys ark Fluorescens mikroskopi.
Chagas sygdom er en parasitisk infektion forårsaget af Trypanosoma cruzi, hvis motilitet ikke er kun vigtigt for lokalisering, men også for cellulære bindende og invasion. Nuværende dyremodeller til undersøgelse af T. cruzi tillader begrænset observation af parasitter in vivo, der repræsenterer en udfordring for forståelse parasit adfærd i de indledende faser af infektion hos mennesker. Denne protozo har en flagellaternes fase i både vektor- og pattedyr værter, men der er ingen undersøgelser, der beskriver dens motilitet i vivo. Formålet med dette projekt var at etablere en levende hvirveldyr zebrafisk model til at vurdere T. cruzi motilitet i det vaskulære system. Gennemsigtig zebrafisk larver blev sprøjtet med fluorescently mærket trypomastigotes og observeret ved hjælp af lys ark Fluorescens mikroskopi (LSFM), en invasiv metode til at visualisere levende organismer med høj optisk opløsning. Parasitter kan visualiseres for længere perioder på grund af denne teknik relativt lav risiko for solskader i forhold til Konfokal eller epifluorescensmikroskop mikroskopi. T. cruzi parasitter blev observeret rejser i kredsløbet af levende zebrafisk i forskellige størrelser blodkar og æggeblomme. De kunne også ses vedlagte blommesækken væg og atrioventrikulær ventilen trods de stærke kræfter tilknyttet hjerte sammentrækninger. LSFM af T. cruzi-podede zebrafisk larver er en værdifuld metode, der kan bruges til at visualisere parasitter i omløb og evaluere deres tropisme, migrationsmønstre og motilitet i den dynamiske miljø af hjerte-kar-systemet med et levende dyr.
Chagas sygdom er forårsaget af en protozo parasit T. cruzi. Ca 6 til 7 millioner mennesker verden over er smittet med T. grusom. Sygdommen overføres primært i Latinamerika, men er blevet rapporteret i USA, Canada, og mange europæiske såvel som nogle vestlige Stillehav lande, primært på grund af migration af smittede personer1. Chagas er i vid udstrækning vektorbårne og overføres til mennesker ved kontakt med afføring fra hematophagic insekter i Triatominae underfamilie, almindeligt kendt som “kysse bugs”. T. cruzi kan dog også sendes via blodtransfusioner, lodret overførslen fra mor til barn, eller indtagelse af mad forurenet med parasitter2. Den akutte fase af infektion er hovedsageligt asymptomatiske eller constitutively symptomatisk og varer fra 6 til 8 uger, hvorefter engagement i immunsystemet styrer parasit belastning, men helt fjerne ikke infektion3. De fleste individer derefter indtaste en kronisk asymptomatiske fase; dog udvikler næsten 30% af patienterne en symptomatisk, kronisk fase, hvor de hjerte system og mindre hyppigt fordøjelsessystemet og nervesystem er kompromitteret4. Dette scenario er en udfordring for sygdom behandling og kontrol, da der findes ingen vacciner, og der er kun to effektive lægemidler til Chagas: benznidazole og nifurtimox. Begge behandlinger kræver langvarig administration og kan have alvorlige bivirkninger2.
Øget forståelse af funktionsmåden for T. cruzi er adfærd i vivo afgørende for at parasitære migration, cellulære vedhæftet fil og invasion i værten; en mangel i vivo modeller begrænser udviklingen af nye terapeutiske tilgange. In vitro undersøgelser af T. cruzi infektion har vist, at motilitet af trypomastigotes er vigtigt for binding til vært cellemembraner og efterfølgende cellulære invasion5. Energi udtynding i trypomastigotes i fælles kultur med en modtagelige cellelinie har vist sig at reducere cellulær invasion6. Interessant, i trypanosomatids, har flagellaternes bevægelse også været karakteriseret som en unddragelse mekanisme mod parasit-specifikke antistoffer7.
Flagellaternes motilitet er blevet grundigt undersøgt i vitro i Trypanosoma brucei, et nært beslægtede parasitten, der forårsager afrikanske Trypanosomiasis8. In vitro undersøgelser af motilitet af disse trypanosomes viste at simulering af betingelserne for blod eller kropsvæsker, herunder viskositet og tilstedeværelsen af hindringer repræsentant af blodlegemer, er vigtigt for parasitten bevægelse fremad9 . Som af har endnu det ikke været muligt at visualisere bevægelse af parasitter i blodbanen i vivo.
Zebrafisk larver er en kraftfuld model til at studere vært-patogen interaktioner in vivo. De er små, billige og forholdsvis let at hæve sammenlignet med andre etablerede hvirveldyr modeller for Chagas sygdom. Zebrafisk har medfødte og adaptive immunforsvar ligner for mennesker, men deres adaptive immunsystem begynder at udvikle på 4 dage post befrugtning (dpf) og er ikke moden til en anden flere uger10. I den tidlige udvikling, når kun makrofager er til stede, er der et stort vindue for at studere parasit adfærd uden umiddelbar immun indblanding10. Men den største fordel af at udnytte zebrafisk larver som hvirveldyr model til at studere patogen opførsel ligger i deres optiske gennemsigtighed, hvilket gør dem modtagelig for mikroskopiske screening og imaging11. Derudover er der flere værktøjer til at manipulere fisk genetik. For eksempel, er Casper stamme en mutant linje af zebrafisk med ingen pigmentering, hvilket gør dyret fuldstændig gennemsigtig og nyttig for visualisering af individuelle organer og til real-time sporing af injicerede celler12.
En afgørende begrænsning af langsgående observation af hurtigt bevægende parasitter i live zebrafisk bruger Konfokal eller epifluorescensmikroskop mikroskopi ligger i er umuligheden billedbehandling på høje anskaffelses hastigheder og store penetration dybder med god billedkvalitet og lav risikoen for solskader. Lys ark fluorescens micsroscopy (LSFM) er en spirende billedbehandling teknik, der overvinder disse begrænsninger for at tillade disse observationer. Ved hjælp af en målsætning for at opdage fluorescens og en anden ortogonal belysning mål, der kun oplyser brændplanet af målet påvisning, er det muligt at opnå høj opløsning optisk sektioner i en Konfokal mikroskop, men med betydeligt reduceret solskader, selv hvad angår epifluorescensmikroskop mikroskopi13. LSFM teknik, der anvendes her er kaldet enkelt fly belysning mikroskopi (SPIM), hvor en tynd plade af lys oplyser et enkelt fly inden for zebrafisk larver.
Formålet med denne metode er at etablere larve zebrafisk som en levedygtig ikke-infektion model for forståelse T. cruzi motilitet og relaterede adfærd i vivo. For at opnå dette, vi injicerede gennemskuelige zebrafisk larver med fluorescently mærket trypomastigotes, cellulære form ansvarlig for infektion af mennesker, og identificeret bevægelighed for T. cruzi i hjerte-kar-omsætning af zebrafisk ved hjælp af LSFM.
Denne undersøgelse fremhæver fordelene ved zebrafisk som en dyremodel for at studere patogen adfærd i vivo. Især dette studie foreslår en metode til at visualisere patogen T. cruzi i dets naturlige miljø: hematic cirkulation. Miljøet i de kredsløbssygdomme mikromiljø i fisk er sammenlignelig med pattedyr, og trypanosomatids har udviklet mekanismer for rejser, undgåelse af immunsystemet, og knyttet til celler for infektion i dette miljø25. Denne protokol giver en beskrivelse af en optimal procedure for kultur af T. cruzi i en human cellelinie og efterfølgende isolation af flagellaternes former for fluorescerende mærkning. Den viser derefter de relevante indstillinger for vellykket injektion af parasitter i gennemsigtig zebrafisk for senere montering og visualisering ved hjælp af LSFM. Endelig, denne protokol giver forslag til effektive i vivo billeddannelse af parasitten placering og bevægelse i omløb ved hjælp af LSFM.
Fimrehår i trypanosomes fremgår af dens posterior region, flyder fra cellen organ, og hænger gratis på den forreste del af organismen26. T. cruzi slynger sig af vinkede fimrehår foran kroppen, hvilket undulates den parasittens hele kroppen. Flagellaternes bevægelse er ikke kun nødvendig for parasitten motilitet, som i tilfælde af T. brucei27 (agens af afrikanske trypanosomiasis), men det bruges også til cellulære infektion, som er blevet påvist i T. cruzi5 ,28. Selvom zebrafisk ikke den naturlige vært for T. cruzi, kan den parasittens motilitet undersøges i en hjerte-kar-cirkulation system, der udvikles ved hjælp af de protokoller, der er beskrevet her. Derudover er der trypanosomes arter, der inficerer karpefisk, klasse i zebrafisk, som T. carassii og T. borreli25. Disse parasit arter kunne bruges til at studere i realtid, bevægelser og vedhæftet fil mekanismer af disse trypanosomatids; sådanne undersøgelser kan låne indsigt i pattedyr celle infektion proces.
I denne undersøgelse, injiceres motile T. cruzi parasitter blev observeret rejser gennem det kardiovaskulære omsætning af podede fisk, flytter sammen med uigennemsigtig erytrocytter og fastholdelsen af strukturer i hjertekarsystemet vægge. Vi brugte et hjem-bygget LSFM med en 10 X akromatisk længe arbejde afstand luft mål (17,6 mm) til belysning arm med en numerisk blænde på 0,25. Et 40 X apokromatiske vand fordybelse mål med en numerisk blænde på 0,8 og en arbejdende afstand af 3,5 mm blev brugt til registrering af armen. Påvisning mål var nedsænket i prøve salen, mens belysning mål var uden for mødesalen. En port i kammeret lukket med en coverslip og optiske limen tilladt for belysning stråle ind i salen, som afbildet i Lorenzo et al. 18 for belysning, brugte vi en 50 mW DPSS laser på 488 nm hvis magt blev moduleres af en akustisk optisk afstemmelige Filter. Registrering sti anvendes filtre kompatibel med grøn fluorescerende proteiner (NGL) eller FITC. En lys ark mikroskop udstyret med en kapillær prøveholderen (ideelt med automatiseret rotation) og temperaturregulering af prøve salen bør være egnede til dette program. Mikroskopet bør justeres og kalibreres i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger eller brugerens laboratorium standardprotokoller før erhvervelse, hvis nødvendigt. I denne protokol kontrollerede vi mikroskop ved hjælp af SPIM software19.
Det er vigtigt at bemærke, at i omløb af zebrafisk larver parasitære udlæg er effektiv. I kardinal venen forblev parasitter fastgjort til op til flere minutter; i hjertet holdt de ventiler og vægge, oscillerende med hjertet sammentrækninger. Yderligere undersøgelser er stadig for at belyse hvorvidt T. cruzi interagerer med de strømmende erytrocytter, der glider i retning af blodgennemstrømningen. Tidligere in vitro- undersøgelser har vist, at tilstedeværelsen af faste strukturer (dvs., blodlegemer) eller øgede viskositet af væske til at efterligne blod i vitro, har en betydelig effekt på motilitet og velocity med parasitten 9.
Der er mange spørgsmål om løbet af infektion af T. cruzi hos mennesker efter amastigotes undslippe fagocyterende celler, i første omgang inficerede celle type29. For eksempel, hvor de ankommer til deres målorganer? Hvad er mekanismerne for tropisme til de foretrukne organer, såsom hjerte, fordøjelseskanalen og centrale nervesystem? Interessant, i denne undersøgelse blev parasitter oprindeligt afbildet i hjertet fordi det var stedet for højeste tæthed af parasitter. Imidlertid CFSE signal efterfølgende akkumuleret i udviklingslandene tarmen ved 7 dage post injektion. Selv om anatomi af fisk og pattedyr er forskellige, viser resultaterne af denne undersøgelse en form for tropisme, da det blev konstateret, at parasitter udstillet tropisme mod kendte foretrukne målorganer trods kropsligt forskelle. En væsentlig begrænsning af denne undersøgelse vedrører temperatur anvendes i eksperimenter. Zebrafisk larver bør holdes omkring 28 °C under hele proceduren. Selvom denne temperatur kan være lignende til vektor vært (insekter af Triatominae underfamilie), er det helt forskellig fra de varmblodede pattedyr, der omfatter de endelige værter (omkring 37 ° C). T. cruzi er kendt for at have flagellaternes levende former i begge værter; Det er dog vigtigt at huske på, at denne faktor kan have en virkning i funktionsmåden for de animalske in vivo.
Selvom fish´s adaptive immunsystem ikke er moden, indtil 4 uger post befrugtning, er den medfødte immunsystem active tidligt i udviklingen10. Så tidligt som 48 eller 96 hpf blev fagocyterende celler observeret at have opslugt mærket trypanosomes (data ikke vist). Dette begrænser vindue af tid for visualisering af parasitten. Men, hvis en undersøgelse skulle fokusere på evaluering fish´s immunrespons, kan indsprøjtning i senere faser anbefales. Også kan indsprøjtning af parasitter i transgene fisk linjer med mærket makrofager eller andre celler i immunsystemet være nyttige i at studere parasit vedhæftet fil og mulige endocytose mekanismer. Det er vigtigt at bemærke, at hvis parasitterne er mærket med CFSE, transgene celle etiketter bør ikke være normal god landbrugspraksis og en markør i den gule eller røde ende af spektret er påkrævet.
For at vurdere den detaljerede bevægelsesretning parasit, kan det være nyttigt at følge deres bane i 3 dimensioner (3D). 3D-visualisering og genopbygning af processen er en højhastigheds-systemet nødvendigt. Med det udstyr, der anvendes i denne protokol, er det kun muligt at visualisere parasitter i ét plan. I dette tilfælde prioriteret vi opretholdelse brændplanet stabilitet under parasitten transporten, og optager sin bane i et plan.
Den metode, der foreslås her baner vejen for yderligere at undersøge parasit adfærd i hjerte-kar-omsætning. I sammendrag er de væsentlige skridt til imaging live fluorescerende parasitter inde zebrafisk larver:(i) brug af tidlige skraverede embryoner (24-48 hpf) eller larver eller dyr mellem 72-96 hpf med ingen pigmentering således at de er gennemsigtige og let at injicere; (ii) billede larver hurtigst muligt efter injektion til at undgå parasitten clearance af fagocyterende celler; og (iii) fokuserer LSFM på webstedet af interesse (f.eks., perikardial region) og fastholde fokus. Denne nye procedure tillader visualisering af trypomastigotes i et miljø svarende til dens naturlige infektion niche, giver for første gang mulighed for at studere T. cruzi i en levende organisme.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Convocatoria Interfacultades fra Vicerrectoría de Investigaciones de la Universidad de los Andes, og USAID forskning og Innovation Fellowship program. Vi takker Juan Rafael Buitrago og Yeferzon Ardila for fisk vedligeholdelse og bistand.
0.5-10 μL Micropipette | Fisherbrand | 21-377-815 | |
Agarose RA | Amresco | N605 | Regular |
Agarose SFR | Amresco | J234 | Low Melting point |
Aquarium salt | Instant ocean | SS15-10 | |
Cell Count chamber | Boeco | Neubauer | |
Cell culture flasks | Corning | 430639 | |
Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
CFSE | ThermoFisher | C34554 | |
Detection objective | Nikon 40x 0.8NA | 40x CFI APO NIR | |
DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5648 | |
Dumont #5 fine forceps | World precision Instruments | ||
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
Fetal calf serum (FCS) | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
Filter | Chroma | ET-525/50M | |
Glass capillaries for embryo mounting | Vitrez Medical | 160215 | |
Glass capillaries for pulling needles | World precision instruments | TW100-4 | |
Glucose | Gibco | A2494001 | |
HEPES | Gibco | 156300-80 | |
Incubator | Thermo Corporation | Revco | |
Larval microinjection mold | Adaptive Science Tools | I-34 | |
Laser | Crystalaser | DL488-050 | |
L-glutamine | Gibco | 250300-81 | |
Methylene blue | Albor Químicos | 12223 | |
Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
Micromanipulator system | Sutter Instrument | MP-200 | For LSFM |
Micropipette puller device | Narishige | PC-10 | |
Microscope | Olympus | CX31 | |
Microscope (inverted) | Olympus | CKX41 | |
Multipurpose microscope | Nikon | AZ100M | |
Neubauer counting chamber | Boeco Germany | ||
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-163 | |
Petri dish 94×16 | Greiner bio-one | 633181 | |
Plastic pasteur pipette | Fisherbrand | 11577722 | |
Rotation stage | Newport | CONEX-PR50CC | |
RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R4130 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Stereoscope | Nikon | C-LEDS | |
Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | |
TRIS | Amresco | M151 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | R-001-100 | |
Tubes 15 ml | Corning | 05-527-90 |