Summary
ב פרוטוקול זה, שכותרתו fluorescently ט cruzi הוזרקו לזחלים דג זברה שקוף, טפיל תנועתיות נצפתה ויוו באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון זריחה.
Abstract
Chagas המחלה היא מחלה טפילית הנגרמת על ידי Trypanosoma cruzi, תנועתיות של מי חשובה לא רק לשפות אחרות, אלא גם עבור איגוד הסלולר ואת הפלישה. הנוכחי חייתיים לצורך המחקר של cruzi טי מאפשרים התבוננות מוגבלת של טפילים ויוו, המייצג אתגר עבור הבנה טפיל התנהגות במהלך בשלבים הראשונים של זיהום אצל בני אדם. Protozoan הזה יש במה השוטוניים וקטור והן בתרבית של המארחים, אך אין מחקרים המתארים את תנועתיות ויוו. המטרה של הפרויקט הזה היה להקים מודל חי דג זברה חוליות להעריך cruzi ט תנועתיות מערכת כלי הדם. דג זברה שקוף הזחלים הוזרקו fluorescently הנקרא trypomastigotes, שנמדדו באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון קרינה פלואורסצנטית (LSFM), שיטה לא פולשנית להמחיש אורגניזמים החיים עם רזולוציה אופטית גבוהה. הטפילים יכול להיות דמיינו לתקופות ממושכות של זמן עקב סיכון נמוך יחסית של טכניקה זו נזקי בהשוואה קונאפוקלית או מיקרוסקופ epifluorescence. ט cruzi טפילים נצפו שנסע מערכת הדם של חי דג זברה בגדלים שונים כלי הדם ואת החלמון. הם גם ניתן היה לראות מצורפים לקיר שק חלמון ולא לשסתום atrioventricular למרות הכוחות החזק הקשורים התכווצויות הלב. LSFM של cruzi טי-דג זברה חוסנו הזחלים היא שיטה יקר זה יכול לשמש כדי להמחיש במחזור טפילים ולהעריך שלהם tropism, דפוסי ההגירה, תנועתיות בסביבה דינאמית של מערכת הלב וכלי הדם של-חיים.
Introduction
Chagas המחלה נגרמת על ידי טפילים protozoan ט cruzi. כ 6-7 מיליון אנשים ברחבי העולם נגועים ט cruzi. המחלה מועברת בעיקר באמריקה הלטינית, אך דווח ב ארצות הברית, קנדה, ו אירופאיות רבות, כמו גם בכמה מדינות במערב האוקיינוס השקט, בעיקר בשל הגירה של אנשים נגועים1. Chagas הוא בעיקר בעקיצות וקטור המועברות לבני אדם על ידי מגע עם הצואה של חרקים hematophagic של תת-משפחה Triatominae, הידוע בכינויו "באגים לנשק". עם זאת, ט cruzi יכול גם להיות מועבר באמצעות עירויי דם, העברה אנכי מאמא לילד, או בליעה של מזון מזוהם עם טפילים2. שלב אקוטי הזיהום בעיקר תסמינים או סימפטומטי צורונים ונמשך 6 עד 8 שבועות, לאחר מכן האירוסין של המערכת החיסונית שולט עומס הטפיל, אבל לא לבטל לחלוטין את זיהום3. רוב האנשים מכן הזן תקופה ללא תסמינים כרוניים; עם זאת, כמעט 30% מהחולים מפתחים שלב כרונית סימפטומטי, שבה את מערכת הלב בתדירות נמוכה יותר מערכת העיכול ומערכת העצבים הם פרוצים4. תרחיש זה מציג אתגר עבור טיפול למחלת ושליטה מאז ישנם חיסונים לא זמין, ויש רק שתי תרופות יעילות עבור Chagas: benznidazole ו- nifurtimox. שני הטיפולים דורשים ניהול ממושך ועל כן ייתכנו תופעות לוואי חמורות2.
גדל להבין אופן הפעולה של cruzi טי התנהגות ויוו היא המפתח לקביעת ההעברה טפילי, מצורף הסלולר ואת הפלישה בתוך המארח; חוסר מודלים ויוו מגביל את התפתחות רומן גישות טיפוליות. מחקרים במבחנה של זיהום cruzi ט הראו כי תנועתיות trypomastigotes חשוב עבור איגוד קרום התא המארח, הפלישה הסלולר עוקבות5. ירידת אנרגיה ב- trypomastigotes בתרבות שיתוף עם קו תא רגישים הוכח כדי להפחית את הפלישה הסלולר6. מעניין, ב trypanosomatids, תנועה השוטוניים גם מאפיין כמנגנון התחמקות נגד נוגדנים ספציפיים טפיל7.
תנועתיות השוטוניים כבר למדה בהרחבה במבחנה ב- Trypanosoma brucei, טפיל הקשורים קשר הדוק אשר גורמת מחלת8. מחקרים במבחנה של תנועתיות אלה trypanosomes הראה כי סימולציה של דם או נוזלים בגוף, כולל צמיגות ואת נוכחותם של מכשולים נציג של כדוריות הדם, תנאי חשוב לתנועה קדימה טפיל9 . כמו של עדיין זה לא היה אפשר לדמיין את התנועה של טפילים הדם ויוו.
דג זברה הזחלים הם במודל רב עוצמה ללמוד פתוגן-פונדקאי אינטראקציות בתוך vivo. הם קטנים, זול וקל יחסית לגדל כאשר לעומת דגמים אחרים חוליות הוקמה עבור Chagas המחלה. דג זברה יש מולדת מסתגלת החיסונית ומערכות דומים לבני האדם, אבל מערכת החיסון מסתגלת שלהם מתחיל לפתח ב 4 ימים שלאחר ההפריה (dpf) ואינה בוגרים עבור עוד שבועות מספר10. במהלך התפתחות מוקדמת, כאשר רק מקרופאגים קיימים, יש חלון גדול ללמוד התנהגות טפיל ללא הפרעות המערכת החיסונית מיידית10. עם זאת, היתרון הגדול ביותר של ניצול דג זברה הזחלים כמודל חוליות ללמוד התנהגות הפתוגן טמון שקיפות אופטית שלהם, הפיכתם לשכנוע11הקרנת והדמיה מיקרוסקופיים. בנוסף, ישנם מספר כלים לתמרן דגים גנטיקה. לדוגמה, המתח קספר הוא קו של דג זברה עם אין פיגמנטציה, שהופך את החיה לגמרי שקופים ושימושי עבור ויזואליזציה של איברים בודדים, מעקב בזמן אמת אחר תאים מוזרק12מוטנטים.
מגבלה מפתח של התבוננות האורך של טפילים נע במהירות דג זברה בשידור חי באמצעות וידאו או מיקרוסקופ epifluorescence טמון היעדר מוחלט של הדמיה-רכישה גבוהה ורזולוציה בעומק חדירה גדול עם איכות תמונה טובה, נמוך סיכון של נזקי. גיליון אור זריחה micsroscopy (LSFM) הוא המתעוררים הטכניקה הדמיה מתגבר על מגבלות אלה להתיר תצפיות אלה. באמצעות מטרה אחת כדי לזהות קרינה פלואורסצנטית מטרה תאורה אורתוגונלית השני רק המאיר במישור המוקד של המטרה זיהוי, זה אפשרי להשיג חלקים אופטיים ברזולוציה גבוהה כמו מיקרוסקופ קונפוקלי, אבל עם באופן משמעותי מופחתת נזקי, אפילו ביחס מיקרוסקופ epifluorescence13. הטכניקה LSFM המשמש כאן נקראת יחידה המטוס תאורה מיקרוסקופ (ספים), שבו סדין דק של אור המאיר מטוס בודד בתוך הזחלים דג זברה.
המטרה של מתודולוגיה זו היא ליצור דג זברה זחל כמודל-זיהום קיימא להבנת cruzi ט תנועתיות של התנהגות הקשורה ויוו. כדי לעשות זאת, אנחנו הזריק דג זברה שקוף הזחלים trypomastigotes fluorescently שכותרתו, הטופס הסלולר אחראי על זיהום של בני אדם, וזיהה את תנועת cruzi ט לב וכלי דם מחזור דג זברה שימוש LSFM.
Protocol
הפרוטוקולים הבאים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של לוס אנדס האוניברסיטה (CICUAL). אבטחה ברמה 2 (BSL-2) הנחיות צריכה להיות מלווה בקפדנות למניעת זיהום עם המחלה ט cruzi.
הערה: טיפול בבעלי חיים ותחזוקה: קספר דג זברה, זן מהונדס גנטית של דג זברה (Danio rerio) נמצא בשימוש פרוטוקול זה בשל שקיפותן אופטי יקר כל שלבים התפתחותיים. דגים הם מניפולציה באמצעות טיפול אופטימלי תנאים מינים 14, במחזור 14 h אור-10 h כהה, ב- 28 ± 1 ° C, ב- pH (7.0-7.4) מבוקר טנק רב צואה מים מערכת. חיות האכיל פעמיים ביום עם שרימפסים בשידור חי (Artemia salina), מועשר לגידול מזון. כל הפרוטוקולים אושרו על ידי CICUAL ב אוניברסיטת דה לוס אנדס (C.FUA_14-017).
1. הכנה של ביצת מים
- הכן 0.6 g/L אקווריום מלח הפוך אוסמוזה (RO) או יונים (DI) מים ולהוסיף 0.01 מ"ג/ליטר מתילן כחול הפתרון.
הערה: מוליכות נמדד צריך להיות של 400-500 µS/cm ו- pH ברמה-7.2-7.9. כדי להוריד את רמת ה-pH, לאוורר את המים ביצה לכמה שעות.
2. הכנה של פתרון מניות Tricaine
- הכן 0.4% tricaine פתרון מניות על ידי המסת 400 מ"ג tricaine (MS-222) במים mL 97.9 מזוקקים (ddH 2 O). לאחר האבקה יש התפרקה לחלוטין, להתאים את רמת ה-pH אל 7.0 באמצעות 2.1 מ ל 1 מ' טריס (pH 9.0), ומעבירים את הפתרון.
3. הכנה של 1.0% Agarose נקודת התכה נמוכה
מים- להמיס האבקה agarose נקודת ההיתוך נמוכה ב- egg ריכוז סופי של 1.0%. לחמם את התערובת במיקרוגל או על פלטה חמה עם ערבוב רציף להופעת הפתרון agarose הומוגנית.
- לאחסן את aliquots ב 4 ° C לא יותר משבוע.
4. ההזדווגות Assay ואוסף העובר
- שלושה ימים לפני זריקות להגדיר matings שימוש בריא זוגות של דגים זכריים ונקביים רביה טנקים. העשרה עם גולות זכוכית צמחים מלאכותיים משפר ההשרצה. Matings צריך להיות מוגדר במהלך אחר הצהריים והשאיר בן לילה.
- בבוקר שלמחרת, לאסוף את הביצים מכירותיו על ידי ניקוז המיכל דרך מסננת ולשטוף את הביצים עם המים ביצה. להסיר את כל הביצים על ידי היפוך של מסננת ולמזוג מים ביצה דרך מסננת לתוך צלחת פטרי. כדי לשמור את העוברים בריאים, לנקות להם את המים על-ידי הסרת כל פסולת ועל העוברים מת עם פיפטה פלסטיק העברת.
- העברת העוברים אינקובטור בטמפרטורה יציבה של 28.5 ° C כדי לאפשר התפתחות העוברים על פי דג זברה סטנדרטים הזמני 15. לבחון את העוברים שתי פעמים ביום, ולמחוק את הביצים inviable לשמור על המצמד בריא.
5. העובר Dechorionation
הערה: הליך זה יש צורך אם העוברים לא נמצאו בזמן ההזרקה. בהליך זה, " הזחלים " הם בעלי חיים מחוץ שלהם chorion מ- 48 שעות פוסט הפריה (hpf) ואילך-
- ביום של הניסוי, מניחים על צלחת פטרי המכילות את העוברים בריאים תחת סטריאוסקופ ויבתר.
- לתפוס קצוות מנוגדים של chorion עם שני חד מלקחיים (דומונט #5) ופתח בעדינות מדמיע ומשוך את chorion. כ 5-6 הזחלים מוזרקים במועד, בדרך כלל 3-4 הם צילמו.
- להסיר את chorions מן המים באמצעות פיפטה העברה של.
6. הכנת חומר הזרקה
- להכין 1.0 מ מ נידלס באמצעות קיר דק נימים זכוכית והתקן פולר micropipette עם ההגדרות הבאות: משקולות קלות 2 + 1 במשקל כבד, למשוך העליון 2 מ מ + 5 מ מ התחתון משיכה, 75.9 ° C (שלב 1) + (78.2 ° C שלב 2). לאחסן מחטים צלחת פטרי על רצועה של בפלסטלינה. המחט אידיאלי צריך טיפ צרים, כמו טי cruzi למדוד כ 20 x 1-3 מיקרומטר, יעברו המחט בקלות. האורך של הקצה יכול להשתנות: טיפ יותר שימושית להגיע עמוק יותר מבנים, אבל טיפ קצר יותר יהיה יותר נוקשה עושה הזרקת קלים עבור המשתמש.
הערה: גודל קצה המחט תלוי בטמפרטורה בשימוש: טמפרטורה גבוהה יותר עבור שלב 2 תוצאות בעצה עוד ועוד עדינה יותר. - להכין פתרון agarose 1.5% ב- ddH 2 O ויוצקים אותו לתוך 10 ס מ פטרי. לכסות לעומק של-1.0 ס מ.
- למקם תבנית microinjection טרומי מעל agarose ולאפשר שבמהלכו.
- הרם כייר טרומיים microinjection החוצה, להוסיף ביצה מים עבור אחסון ב 4 º C. פעולה זו מונעת את agarose ממנו להתייבש.
- הוסף מים ביצה כדי הפתרון מניות tricaine ריכוז סופי של 150 מ ג/ל' החנות ב-4 מעלות צלזיוס
7. תרבית תאים לצמיחה טפיל
- טפילים נשמרים קו תא אנושי אסטרוציטומה (CRL-1718) באמצעות השיטה המתוארת על ידי ורגס-Zambrano. et al. 16
- להתחיל את התרבות של תאים אנושיים מבחנות תרבות T25 (משטח אזור = 25 ס מ 2)-צפיפות של 2 x 10 5 או 4 x 10 5 תאים 4 מ של RPMI-1640 בינוני עם 10% של נסיוב עגל עוברית (FCS), בתוספת עם 2 מ מגלוטמין, גלוקוז 4.5 g/L, 10 מ מ HEPES, פירובט 1 מ"מ ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין (כאל " להשלים את המדיה "). דגירה התרבויות אסטרוציטומה ב 37 ° C בסביבת 2 CO 5%-
- לאחר טפט confluent, לנתק את התאים באמצעות 2 מ של 0.25% של טריפסין-EDTA המקננת בהם במשך 3 דקות ב 37 ° ג חזותית סימון תאים עבור ניתוק ולחסום את הפתרון טריפסין באמצעות 3 מ"ל של RPMI-1640 עם 10% FCS בשפופרת 15 mL-
- צנטריפוגה התליה תא עבור 5 דקות ב- g x 1,350...
- לרחוץ בגדר התאית הנוצרת DMEM בינוני 15-mL שפופרת, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב g x 1,350 בגיל 22 מעלות צלזיוס
- לספור את התאים באופן ידני הקאמרית נויבאואר ואבדוק את הכדאיות במיקרוסקופ אור בהגדלה X 40.
- בעדינות מחדש מושעה הסלולר הצניפה ב 4 מ"ל של התקשורת מלאה, להשתמש בו כדי ליצור תרביות תאים חדשים באמצעות 2 x 10 5 תאים לכל T25 תרבות הבקבוקון.
8- ט cruzi תרבות, Labeling
- טפילים הם זן במקור המתקבל בני אדם נגועים, כאנטי טי cruzi דה זן (MHOM/CO/01-DA), גנוטיפ TcI דיסקרטית הקלדת יחידה (סטו המורה הפרטי) 16. אחרי 3 או 4 ימים של culturing, לאסוף טפילים נע אסטרוציטומה האנושי תא תרבות תגובת שיקוע, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב ג x 1,350 למחוק את המדיום.
הערה: טפילים בינוני מלא ניתן להשתמש עבור מחדש תרבות על יחס 1:1 עם אסטרוציטומה בתאים T25 תרבות מבחנות. - בעדינות מחדש להשעות בגדר ב 10 מ"ל עקר 1 x מלוחים מאגר פוספט (PBS) עם 0.1% FCS, צנטריפוגה עבור 5 דקות ב- g x 1,350...
- למחוק את תגובת שיקוע והשהה מחדש ב 1 מ"ל ל- PBS. לקחת 10 µL לספירת טפילים free-swimming בתוך תא נויבאואר.
- לקחת את שאר טפילים מחדש על תנאי (990 µL) ולהוסיף 1 µL של Carboxyfluorescein Diacetate Succinimiדיל אסתר (CFSE), הריכוז הסופי 5.0 מיקרומטר. Incubate 10 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: CFSE מניות ב- 5 מ מ צריך להיות aliquoted, מתוחזק ב-20 מעלות צלזיוס - גלולה הטפילים (1,350 x g, 5 דקות). לשקם בגדר טפיל על ידי מצליף את הצינור ולשטוף ב 10 מ"ל של x 1 PBS-0.1% FCS ואחריו ספין עוקבות (1,350 x g, 5 דקות).
- למחוק את תגובת שיקוע, בעדינות מחדש להשהות בגדר טפיל שכותרתו ב- PBS X 1 עם אמצעי האחסון המתאים בריכוז הסופי של בערך 10-20 טפילים/nL להזרקה.
- השתמש אמצעי אחסון קטן (∼ 10 µL, כ 1 x 10 4-2 x 10 4 טפילים) של trypomastigotes להערכת הכדאיות ולקרוא. ניתן להשתמש במיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוך עבור פריט חזותי ישיר של הטפילים. במצב אור המשודרת, בדוק כי הטפילים להזיז. במצב פלורסצנטיות, השתמש במסנן Fluorescein Isothiocyanate (FITC) כדי להעריך את הטפיל תיוג.
9. הזרקת דג זברה הזחלים
- טפיל טעינת
- לקחת 10 µL של טפילים מן resuspension (100 µL) ולטעון אותן לתוך המחטים זכוכית אטום באמצעות טיפ פיפטה של 10 µL microloader.
- להכניס את המחט זכוכית בעל מחט micromanipulator דוכן מגנטי ושימוש למקם ליד סטריאוסקופ.
- באמצעות מלקחיים בסדר תחת סטריאוסקופ, לחתוך את המחט יצירת פתח בוטה של קץ ולמדוד את גודל טיפה כדי להשיג אמצעי הזרקה של 1 nL (זה שווה ערך ל קוטר חרוז של 0.12-0.13 מ"מ כאשר נמדד שמן מינרלי 17). טיפ יותר עדיף כך המחט יכולים להגיע מבנים עמוק בתוך הדג ללא פגיעה הרקמה. ב פרוטוקול זה, משמש מחט בוטה, אבל מחט משופע יכול לשמש גם.
- הרכבה
- עזים ומתנגד הזחלים של 48 hpf, עם tricaine 150 מ ג/ליטר. בדוק כי הם אינם מגיבים למגע, אבל לוודא כי הלב פועם.
- למקם את הזחלים כייר agarose microinjection במצב לרוחב.
- מקום בעל מחט ליד סטריאוסקופ ולהתאים את micromanipulator כך קצה המחט הוא במרכז שדה הראייה. להעביר הפטרי שהוכנו בשלבים 6.2 - ל 6.4 כך החלמון הזחל הוא קרוב מחט. לבדוק את מצב הזחל כדי לוודא שהלב ימשיך לפעום.
- להגדיר את ערכי microinjector כדלקמן: הזרקה בלחץ 9.6 פאונד לאינץ (psi); להחזיק לחץ: 20 psi; טווח 100 ms gating; ערך תקופה של 1.9 (מקביל 10.9 ms). עוצמת הזריקה צריך להיות בין 1-3 nL, עם 10-20 טפילים/nL-
10. הזרקה של הטפיל
- הכנס הדגים בחלק הקדמי-מעולה של החלמון-ההדבקה של Cuvier. שלב זה צריך להיות מתורגל כדי להבטיח הישרדות בעלי חיים לאחר ההזרקה. זה לוקח כ- 10 דקות כדי להזריק 5-6 הזחלים בהצלחה.
- כמו פקד, להזריק הזחלים 1-2 עם אותו הרכב נפח (1 x PBS).
- להעביר הזחל מים טריים ביצה מיד.
11. LSFM הרכבה של מוזרק הזחלים
- להעביר את הזחל הזריק טפילים על צלחת פטרי ריק, הסר בזהירות את המים שמסביב עם פיפטה פלסטיק, נייר סופג. מיד להוסיף 100 µL טרופה 1.0% נמוך agarose נקודת התכה (ראה שלב 3 להכנה agarose) כדי לכסות את הזחל. להבטיח agarose אינו מעל 40 מעלות צלזיוס
- להוסיף חוט ישר בתוך נימי זכוכית 1.0 מ מ ולהשתמש בו בתור פומפה להתחנף הזחל בצורה מאונכת. הקפד להשאיר כמות קטנה של agarose מעל הזחל. לחכות עד agarose עפור לפני חשיפת הזחל (זה ידרוש מספר דקות). במידת הצורך, לדחוף החוצה agarose עודף מתחת הזחל ונחתוך את זה הנהגים
- למקם את נימי בעל הדגימה במיקרוסקופ ודחף את הסוף המכיל הזחל עד זה חינם תולה נימי. תא הדגימה צריך להיות מלא פתרון tricaine (150 מ ג/ליטר), הטמפרטורה להגדיר ב- 28 מעלות צלזיוס
- הצב הזחל מול האישון של המטרה זיהוי באמצעות מערכת XYZ-micromanipulator. לשימוש סיבובים סביב הציר האנכי, שלב הסיבוב. מיקום של הזחל שצריך לעשות במצב אור המשודרת כדי לזהות בבירור מבנים זחל.
12. LSFM הדמיה של מוזרק טפילים
- שינוי על-ידי קרינה פלואורסצנטית מצב ולהתאים את עוצמת תאורה, כמו גם את זמן החשיפה כדי להקטין את נזקי ולמטב את הזמן רזולוציה. לניסויים אלה מסוים, אנחנו המשמשים כוח של 2.8-3.0 mW המדגם ונחשף לכל מסגרת עבור 200 ms בעזרת מצלמה עם פיקסלים מיקרומטר 6.45 ~ 70% נצילות קוונטית באורכי גל זיהוי. הגדרות אלה יביא תמונות בחשיפות שלמאחה-מסגרות כ-5/הקפד להשתמש אובייקטיבית עם הגבוה ביותר האפשרי מספרי הצמצם ס.
- להתחיל עם רכישת וידאו של האזור בעל עניין (ROI). במקרה שלנו, טפילים הם נצפו קשור שסתומים, נעה בחופשיות סביב אזור הלב. מומלץ לקחת סרטון של מטוס בודד לאורך זמן, או להשתמש במערכת micromanipulator או אלמנט פייזו-galvo למקד מטוסים שונים בזמן הטפיל נע.
הערה: ההליך זה שימושי עבור רכישת קצר פעמים של עד 2 שעות. עבור רכישת לטווח ארוך, הזחלים צריך להיות מותקן באמצעות שיטות אלטרנטיביות 20-
13. תמונה עיבוד, ניתוח של נתונים רכשה
הערה: עיבוד תמונה בוצעה על מחשב אישי עם מעבד 2.90 GHz, 8.00 GB של זיכרון הווידאו של 1.00 ג'יגה-בתים של זיכרון-
- פתוח רכשה הנתונים (dataset) בתמונה עיבוד תוכנה של בחירה. פתח פיג'י תוכנה מומלצת עבור עיבוד נתונים LSFM וניתוח 21.
- בתוכנה ניתוח התמונה, להתאים את רמות הבהירות והניגודיות כדי לשפר את התמונות.
הערה: ללא פרמטרים קבועים הם בשימוש במקרה הזה, אבל בחירת " אוטומטי " אפשרות יכול להיות שימושי להשיג שיפור הראשונית- - בחר רועי.
הערה: עבור מעקב אחר טפילים בודדים, פיג'י יש שני תוספים מעקב ידני ואוטומטי זמין.
14. שחזור תמונה הזחלים
- הסר הזחל בקפידה מן agarose באמצעות מלקחיים בסדר וכלי לולאה שיער. להעביר את הדג בחזרה אל הביצה טרייה מים ובדוק שחזור לאחר 15 דקות לחזור הזחל חממה-± 0.5 28 מעלות צלזיוס. לחלופין,
- להמשיך המתת חסד הזחלים הדמיה עם מנת יתר של tricaine. לאחר מכן, להציג את הזחלים בפתרון של נתרן תת-כלורי (6.15% NaClO) למשך 5 דקות להרוג את הטפיל. תשליך על פי המוסד ' פרוטוקולים סטנדרטיים s.
Representative Results
תנאים אופטימליים הזרקה:
קבוצות של דג זברה הזחלים הוזרקו ב 24, 48, 72, 96 ו 120 hpf, באתרים אנטומי שונה, ועל ההישרדות שלהם נבדקה כל יום במשך 5 ימים. לאחר 5 ימים פוסט הזרקה, העוברים מוזרק 24 hpf היה 6.25% הישרדות (2/32), ואילו 95% (38/40) של הזחלים מוזרק ב 48 hpf שרד. כפקד, הזחלים הוזרק 1 x PBS כרכב. היו אין הבדל בין הישרדות בין הזחלים המוזרק הרכב, המוזרק טפיל, המציין אין תופעות תלויי-טפילי על שיעור ההישרדות של הדג (p = 0.08). הזחלים הזרקה בין 72-120 hpf היה שיעורי ההישרדות דומות רימות המוזרק hpf 48 עד נפח הזרקה קבועה. עבור כל ההליכים המובאים כאן, הזחלים hpf 48 שימשו הודות לקלות שלהם של מניפולציה, לאחר שפיתחה איברים והעור נחדרת בקלות ללא נזק ניכר לאחר ההזרקה.
הזחלים מוזרק ב 48 hpf היה מוזרק בחלל סביב הלב, זנב שריר החדר hindbrain, שלפוחית otic, מיתר הגב, צינור הלבלב Cuvier בתוך שק החלמון. היו אין הבדלים ההישרדות של הזחלים מוזרק באתרים אנטומי שונות. עם זאת, היה האזור הקלה והמהירה ביותר כדי להזריק שההדבקה של Cuvier ממוקם בחלק הקדמי של שק חלמון (איור 1, 1 סרט). זריקות באתר הזה מותר המבוא של אמצעי אחסון גבוהה עם סיכון נמוך יותר של פגיעה מבנים חיוניים. בנוסף, בין hpf 24-72, אזור זה הוא אתר של האופטימלית כדי לגשת ישירות להערכת המתפתח של הלב11.
ויזואליזציה טפיל שימוש LSFM:
תוך 8-10 דקות לאחר ההזרקה של cruzi טי לתוך ההדבקה של Cuvier, טפילים זוהו הזחלים דג זברה להשתמש LSFM בשל האות פלורסנט שלהם CFSE והשקיפות אופטי של הזחלים. לאחר חיסון, טפילים נצפו שגם דבקה קירות סביב מערכת הדם או לנסוע לכיוון של זרימת הדם (איור 2, איור 3). כאשר טפיל נשאר קשור מבנה הלב, כגון השסתום atrioventricular, זה מתנדנד עם התכווצויות הלב, המציין כי המנגנון המולקולרי של הדבקות של טפילים עשוי להיות יעיל במודל שלנו חוליות (2 הסרט, הסרט 3 הסרט משלים 1). ט cruzi גם דבקה דפנות שק החלמון זחל ( איור 2, סרט 2), מבנה אשר מאוחר יותר להיות נספג מחדש, להיות חלק במעי דג זברה22. זה יכול להיות בדומה למה שמתרחש בשלב מחלה כרונית בבני אדם נגוע, שבו נמצאים טפילים cardiomyocytes, את מערכת העצבים העיכול23,24. כשהוא לא מחובר, הטפילים נסחפה דרך זרם הדם באותו כיוון כמו אריתרוציטים ( איור 3, סרט 4). טפילים יכול להיות שנצפו בכלי בגדלים שונים של הדגים, אבל היו בשפע רב יותר בחלל הלב והן באזור הסמוך חלמון המכיל את זרימת הדם ( איור 2, איור 3, הסרט משלים 2).
זריקה פוסט 10 דקות, זה היה יותר קשה ספוט צורות יחיד של הטפיל עקב פריסתם לאורך את להערכת, וחוסר יכולת להבין במהירות מסך אנטומי אתרים שונים של הדג עקב שדה ראייה מוגבל של LSFM (בהגדלה 40 X ). לאחר 24 שעות פוסט הזרקת. מדד מחירי הבתים (. של), האות CFSE מתחיל לצבור באזור הקרוב המעי המתפתח (משלים איור 1).
איור 1: ההזרקה אופטימלית. (א) תמונה של זחל 48 hpf מציג אופטימלית ההזרקה-ההדבקה של Cuvier (חץ צהוב) באמצעות סטריאוסקופ רגיל. Magnified (B) להציג תיבת להראות ההדבקה של Cuvier (חץ צהוב). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר (א), 50 מיקרומטר (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: LSFM תמונות של טפיל סטטי בזחל hpf 48. הטפיל cruzi ט (חץ צהוב) נשאר מודבקת אל קירות שק החלמון, לאורך הרצף בצילום מואץ (7.2 s, 17.2 s, ו- 27.2 s), על ~ 15 דקות לאחר ההזרקה טפיל. אין שינוי במצב של הטפיל הוא ציין במהלך תקופת הרכישה לפחות 30 ס, אטריום; v, החדר. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: מסלול של טפיל נוסע בחלל הלב באמצעות LSFM. הטפיל cruzi ט ניתן לעקוב בזמן נסחפת בחלל הלב (PS), עם כיוון זרימת הדם (מסלול מוצגים בצבע אדום) כ ~ 15 דקות לאחר ההזרקה טפיל. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
סרט 1: עמק זרימת הדם של החלמון בזחל 48 hpf. סרט של זחל 48 hpf הצגת עמק זרימת דם או הדבקה של Cuvier באמצעות סטריאוסקופ רגיל של. אזורים שונים מתמקדים במהלך הוידאו ניתן להראות כדוריות דם אדומות ונע לאורך התעלה. חץ צהוב מראה ההזרקה אופטימלית. הסרט הוקלט בערך 10-15 דקות לאחר ההזרקה טפיל. אנא לחץ כאן כדי להוריד הוידאו-
הסרט 2: ט cruzi טפילים המצורפת דפנות שק החלמון. סרט LSFM של הצגה hpf זחל 48 כי טי cruzi טפילים יישארו מודבקת על שק החלמון בערך 10-15 דקות לאחר ההזרקה טפיל. אין שינוי במצב של הטפיל נצפתה במהלך תקופת הרכישה לפחות 30 ס, אטריום; v, החדר. אנא לחץ כאן כדי להוריד הוידאו-
הסרט 3: ט cruzi טפילים מחוברת לקירות הלב. סרט LSFM של זחל 48 hpf מציג את remai טפילים טי cruzi n דבקה הקיר לב וכלי דם, למרות הצירים הלב חזק בערך 10-15 דקות לאחר ההזרקה טפיל. יכול להיות שנצפו אריתרוציטים כצללים מעוגל שחור. אנא לחץ כאן כדי להוריד הוידאו-
סרט 4: טפילים נע בחלל הלב. סרט LSFM זחל 48 hpf בסה כ מציג טי cruzi טפילים מרחפים בחלל סביב הלב. טפילים שני יוכל להימצא בנקודות זמן שונות (1 מזהה, עיגול אדום, ו- 2 מזהה במעגל צהוב), בעקבות מסלול דומה. הסרט הוקלט בערך 10-15 דקות לאחר ההזרקה טפיל. אנא לחץ כאן כדי להוריד הוידאו-
משלימה איור 1: הצטברות של CFSE האות פלורסנט החלמון. סטריאוסקופ תמונות של זחל wildtype מוזרק ב 48 hpf-ההדבקה של Cuvier. אות ניאון CFSE מצטבר בהדרגה בהחלמון, לאחר יומיים לפרסם הזרקה (48 מדד מחירי הבתים של). סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.
משלימה סרט 1: טפילים המצורפת קירות ושסתומים במערכת הדם. סטריאוסקופ זמן סדרת תמונות של זחל פראי סוג מוזרק ב 48 hpf. תמונות נלקחות במרווחי 0.2 s, לכידת טפילים cruzi ט נע בסנכרון עם התכווצויות שריר הלב-atrioventricular המסתם. הסרט הוקלט בערך 30 דקות לאחר ההזרקה טפיל. אנא לחץ כאן כדי להוריד הוידאו-
משלימה את הסרט 2: טפילים נע, מודבקת periventricular החלל ואת החלמון. סרט LSFM זחל 48 hpf בסה כ מציג טי cruzi טפילים נסחף או דבקה המרחב סביב הלב או החלמון. תצוגה אור המשודרת נצפתה עבור הראשון 5 s. הנוף פלורסצנטיות נצפתה מ- 5.2-25.8 s. הסרט הוקלט בערך 10-15 דקות לאחר ההזרקה טפיל. אנא לחץ כאן כדי להוריד הוידאו-
Discussion
מחקר זה מדגיש את היתרונות של דג זברה כמודל בעלי חיים לימוד הפתוגן התנהגות ויוו. בפרט, המחקר הזה מציעה שיטה כדי להמחיש את הפתוגן ט cruzi ב. הסביבה הטבעית שלו: מחזור בדרגות. הסביבה של microenvironment הדם הדג דומה לזו של יונקים, trypanosomatids התפתחו מנגנונים בנסיעות, התחמקות המערכת החיסונית של הצמדת תאים עבור זיהום הסביבה הזה25. פרוטוקול זה מציע תיאור של הליך אופטימלית עבור התרבות של cruzi טי בקו התא האנושי ובידוד עוקבות של צורות השוטוניים עבור תיוג פלורסנט. אז זה מראה את ההגדרות המתאימות עבור הזרקה מוצלחת של הטפילים לתוך דג זברה שקוף עבור מאוחר יותר הרכבה והדמיה באמצעות LSFM. לבסוף, פרוטוקול זה מציע הצעות עבור יעיל ואפקטיבי ויוו הדמיה של טפיל מיקום ותנועת במחזור באמצעות LSFM.
שוטון של trypanosomes מגיח שלה אחורי, הנובעים בגוף התא, וחופשית נתקע בחלקו הקדמי של האורגניזם26. ט cruzi דוחף את עצמו מנפנפת את שוטון לפני הגוף, אשר מתגלין כל הגוף של הטפיל. השוטוניים תנועה היא לא רק הכרחית עבור תנועתיות טפיל, כמו במקרה של brucei ט27 (סוכן סיבתי של מחלת השינה), אך הוא משמש גם עבור זיהום הסלולר, כפי הוכח ב ט cruzi5 ,28. למרות דג זברה אינם המארחת טבעית של cruzi טי, תנועתיות של הטפיל יכול להילמד במערכת הלב וכלי הדם במחזור המתפתח באמצעות פרוטוקולים המתואר כאן. בנוסף, ישנם מינים trypanosomes להדביק cyprinids, הכיתה של דג זברה, כגון carassii ט וט borreli25. המינים הללו הטפיל יכול לשמש כדי ללמוד בזמן אמת את התנועות ואת קובץ מצורף מנגנונים של אלה trypanosomatids; מחקרים כאלה יכול להלוות תובנה תהליך דלקת בתרבית של תאים.
במחקר זה, הזרקת תאי cruzi ט טפילים היו שנצפו נסיעה דרך מחזור הדם וכלי דם של דגים חוסנו, זז עם אריתרוציטים אטום, והקפדה על מבנים בקירות מערכת הלב וכלי דם. השתמשנו LSFM מתוצרת הבית עם 10 X אכרומטי זמן ומרחק עבודה אוויר המטרה (17.6 מ מ) עבור זרוע תאורה עם הפתח המספרי של 0.25. 40 X מים apochromatic המטרה טבילה עם הפתח המספרי של 0.8, מרחק עבודה של 3.5 מ מ שימשה זרוע זיהוי. זיהוי המטרה היה שקוע בבית הבליעה לדוגמה, בעוד המטרה תאורה היתה מחוץ לחדר. נמל תא אטום עם coverslip ואת דבק אופטי המותר עבור קרן תאורה להיכנס לחדר, כפי שהיא מתוארת לורנצו. et al. 18 עבור תאורה, השתמשנו לייזר DPSS 50 mW-488 ננומטר שהכוח שלו היה מווסת על ידי מסנן Tunable אקוסטו אופטי. להשתמש בנתיב זיהוי מסננים תואמים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או FITC. מיקרוסקופ אור גיליון מצויידים בעל נימי מדגם (רצוי תוך סיבוב אוטומטי), בקרת טמפרטורה החדר המדגם צריך להיות מתאים עבור יישום זה. המיקרוסקופ צריך להיות מיושרים, מכויל בהתאם להוראות היצרן או פרוטוקולים סטנדרטיים מעבדה של המשתמש לפני הרכישה, במידת הצורך. ב פרוטוקול זה, שאנחנו שולטים המיקרוסקופ באמצעות תוכנה ספים19.
חשוב לציין כי מחזור דג זברה, הזחלים מההחזקה הטפילית הוא יעיל. בווריד קרדינל, טפילים נשאר צמוד עבור עד מספר דקות; בלב, הם קיימו שסתומים, קירות, נדנוד עם התכווצויות הלב. מחקרים נוספים נותרו כדי להבהיר אם טי cruzi אינטראקציה עם אריתרוציטים זורמים זה להיסחף לכיוון של זרימת הדם. מחקרים קודמים במבחנה הראו כי הנוכחות של מבנים מוצקים (קרי, תאי דם), או צמיגות מוגברת של הנוזל לחקות דם במבחנה, יש השפעה משמעותית על תנועתיות, מהירות של הטפיל 9.
ישנן שאלות רבות לגבי המסלול של זיהום של cruzi טי בבני אדם לאחר amastigotes להימלט תאים phagocytic, סוג התא הנגוע בתחילה29. לדוגמה, איך הם מגיעים לאיברים היעד שלהם? מה הם המנגנונים עבור tropism אל האברים מועדף, כגון דום לב, עיכול, מערכות העצבים המרכזית? מעניין, במחקר זה הטפילים היו בתחילה עם תמונה בלב כי זה היה האתר של צפיפות הגבוהה של טפילים. עם זאת, האות CFSE לאחר מכן שהצטברו במעי המתפתח על ידי זריקה פוסט 7 ימים. למרות האנטומיה של דגים, יונקים שונים, התוצאות של המחקר הזה מדגימים צורת tropism, כמו זה היה ציין כי טפילים הציג tropism לכיוון איברי המטרה המועדפת ידועה למרות ההבדלים organismal. מגבלה אחת משמעותית של מחקר זה נוגע הטמפרטורה המשמשים את הניסויים. דג זברה הזחלים צריך להישמר בסביבות 28 °C במהלך ההליך כולו. למרות החום הזה עשוי להיות דומה למחשב המארח וקטור (חרקים של תת משפחה Triatominae), זה שונה לגמרי היונקים האדם המרכיבים את המארחים הסופי (בסביבות 37 ° C). ט cruzi ידוע כי צורות חיים השוטוניים מארחים שני; עם זאת, חשוב לזכור כי גורם זה ייתכן שיהיה אפקט בהתנהגות של בעלי חיים בתוך vivo.
למרות מערכת החיסון מסתגלת fish´s אינה בשלה עד 4 שבועות פוסט הפריה, מערכת החיסון המולדת פעילה בתחילת פיתוח10. מוקדם ככל hpf 48 או 96, נצפו תאי phagocytic נתקל נבלע הנקרא trypanosomes (נתונים לא מוצג). זה מגביל את חלון זמן ויזואליזציה של הטפיל. עם זאת, אם מחקר כדי להתמקד על הערכת התגובה החיסונית fish´s, המומלצים הזרקה בשלבים מאוחרים יותר. כמו כן, זריקה של טפילים לקווי הטרנסגניים דגים עם מקרופאגים שכותרתו או תאים אחרים של מערכת החיסון יכולה להיות שימושית בלימוד טפיל מצורף ומנגנונים אנדוציטוזה אפשרי. חשוב לציין כי אם הטפילים מסומנות עם CFSE תא הטרנסגניים תוויות לא צריך להיות ה-GFP, סמן בסופו של צהוב או אדום של הספקטרום נדרש.
כדי להעריך את כיוון התנועה טפיל מפורט, זה עשוי להיות שימושי לעקוב אחר מסלולם 3 מימד (3D). לוויזואליזציה תלת-ממדית, שחזור של התהליך, הכרחי מערכת במהירות גבוהה. עם הציוד בשימוש פרוטוקול זה, אפשרי רק לדמיין הטפילים במישור אחד. במקרה זה, אנחנו עדיפות שמירה על היציבות במישור המוקד במהלך התנועה טפיל ולהקליט את המסלול שלו במישור אחד.
המתודולוגיה המוצעת כאן סוללת את הדרך להמשיך לחקור התנהגות טפיל במחזור הלב וכלי הדם. לסיכום, השלבים החיוניים כדי הדמיה טפילים פלורסנט בשידור חי בתוך דג זברה הזחלים הם:(i) שימוש עוברי מוקדם המקווקו (24-48 hpf) או הזחלים, או חיות בין 72-96 hpf עם פיגמנטציה לא כך הם לשקופה וקלה להזריק; (ii) התמונה הזחלים בהקדם האפשרי לאחר ההזרקה להימנע סיווג טפיל על ידי תאים phagocytic; ו- (iii) למקד את LSFM באתר של הריבית (לדוגמא, באזור הלב) ולשמור על המוקד. הליך זה הרומן מאפשרת את החזיית trypomastigotes סביבה להשוות נישה זיהום טבעי, מתן בפעם הראשונה את האפשרות ללמוד טי cruzi אורגניזם חי.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי Convocatoria Interfacultades Vicerrectoría דה Investigaciones דה לה למד דה לוס אנדס, ואת התוכנית מלגת חדשנות ומחקר USAID. אנו מודים חואן רפאל Buitrago ו Yeferzon Ardila על דגים תחזוקה וסיוע.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5-10 μL Micropipette | Fisherbrand | 21-377-815 | |
| Agarose RA | Amresco | N605 | Regular |
| Agarose SFR | Amresco | J234 | Low Melting point |
| Aquarium salt | Instant ocean | SS15-10 | |
| Cell Count chamber | Boeco | Neubauer | |
| Cell culture flasks | Corning | 430639 | |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| CFSE | ThermoFisher | C34554 | |
| Detection objective | Nikon 40x 0.8NA | 40x CFI APO NIR | |
| DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Dumont #5 fine forceps | World precision Instruments | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
| Filter | Chroma | ET-525/50M | |
| Glass capillaries for embryo mounting | Vitrez Medical | 160215 | |
| Glass capillaries for pulling needles | World precision instruments | TW100-4 | |
| Glucose | Gibco | A2494001 | |
| HEPES | Gibco | 156300-80 | |
| Incubator | Thermo Corporation | Revco | |
| Larval microinjection mold | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| Laser | Crystalaser | DL488-050 | |
| L-glutamine | Gibco | 250300-81 | |
| Methylene blue | Albor Químicos | 12223 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| Micromanipulator system | Sutter Instrument | MP-200 | For LSFM |
| Micropipette puller device | Narishige | PC-10 | |
| Microscope | Olympus | CX31 | |
| Microscope (inverted) | Olympus | CKX41 | |
| Multipurpose microscope | Nikon | AZ100M | |
| Neubauer counting chamber | Boeco Germany | ||
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-163 | |
| Petri dish 94x16 | Greiner bio-one | 633181 | |
| Plastic pasteur pipette | Fisherbrand | 11577722 | |
| Rotation stage | Newport | CONEX-PR50CC | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R4130 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Stereoscope | Nikon | C-LEDS | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | |
| TRIS | Amresco | M151 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | R-001-100 | |
| Tubes 15 ml | Corning | 05-527-90 |
References
- WHO. Chagas disease (American trypanosomiasis). , http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/ (2017).
- Bern, C. Chagas's Disease. New England Journal of Medicine. 373 (5), 456-466 (2015).
- Sosa Estani, S., Segura, E. L., Ruiz, A. M., Velazquez, E., Porcel, B. M., Yampotis, C. Efficacy of chemotherapy with benznidazole in children in the indeterminate phase of Chagas’ disease. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 59 (4), 526-529 (1998).
- Rosas, F., Roa, N., Cucunuba, Z. M., Cuellar, A., Gonzalez, J. M., Puerta, J. C. Chagasic Cardiomyopathy. Cardiomyopathies - From Basic Research to Clinical Management. , (2012).
- Finkelsztein, E. J., et al. Altering the motility of Trypanosoma cruzi with rabbit polyclonal anti-peptide antibodies reduces infection to susceptible mammalian cells. Experimental Parasitology. 150, 36-43 (2015).
- Martins, R. M., Covarrubias, C., Rojas, R. G., Silber, A. M., Yoshida, N. Use of L-Proline and ATP Production by Trypanosoma cruzi Metacyclic Forms as Requirements for Host Cell Invasion. Infection and Immunity. 77 (7), 3023-3032 (2009).
- Engstler, M., et al. Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes. Cell. 131 (3), 505-515 (2007).
- Uppaluri, S., et al. Impact of Microscopic Motility on the Swimming Behavior of Parasites: Straighter Trypanosomes are More Directional. PLoS Computational Biology. 7 (6), e1002058 (2011).
- Heddergott, N., et al. Trypanosome Motion Represents an Adaptation to the Crowded Environment of the Vertebrate Bloodstream. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003023 (2012).
- Gratacap, R. L., Wheeler, R. T. Utilization of zebrafish for intravital study of eukaryotic pathogen–host interactions. Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 108-115 (2014).
- Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-Pathogen Interactions Made Transparent with the Zebrafish Model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
- White, R. M., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Huisken, J. Slicing embryos gently with laser light sheets. BioEssays. 34 (5), 406-411 (2012).
- Westerfield, M. The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene. http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Vargas-Zambrano, J. C., Lasso, P., Cuellar, A., Puerta, C. J., González, J. M. A human astrocytoma cell line is highly susceptible to infection with Trypanosoma cruzi. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 108 (2), 212-219 (2013).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (25), e1115-e1115 (2009).
- Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell Division. 6, 22 (2011).
- Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using μManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), e10 (2014).
- Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (84), (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ng, A. N. Y., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Developmental Biology. 286 (1), 114-135 (2005).
- Higuchi, M. D. L., et al. Correlation between Trypanosoma cruzi parasitism and myocardial inflammatory infiltrate in human chronic chagasic myocarditis: Light microscopy and immunohistochemical findings. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 2 (2), 101-106 (1993).
- Vago, A. R., Silva, D. M., Adad, S. J., Correa-Oliveira, R., d'Avila Reis, D. Chronic Chagas disease: presence of parasite DNA in the oesophagus of patients without megaoesophagus. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (3), 308-309 (2003).
- Wiegertjes, G. F., Forlenza, M., Joerink, M., Scharsack, J. P. Parasite infections revisited. Developmental & Comparative Immunology. 29 (9), 749-758 (2005).
- De Souza, W. Basic cell biology of Trypanosoma cruzi. Current Pharmaceutical Design. 8 (4), 269-285 (2002).
- Langousis, G., Hill, K. L. Motility and more: the flagellum of Trypanosoma brucei. Nature Reviews. Microbiology. 12 (7), 505-518 (2014).
- Johnson, C. A., et al. Cellular response to Trypanosoma cruzi infection induces secretion of defensin α-1, which damages the flagellum, neutralizes trypanosome motility, and inhibits infection. Infection and Immunity. 81 (11), 4139-4148 (2013).
- Magalhães, L. M. D., Viana, A., Chiari, E., Galvão, L. M. C., Gollob, K. J., Dutra, W. O. Differential Activation of Human Monocytes and Lymphocytes by Distinct Strains of Trypanosoma cruzi. PLoS neglected tropical diseases. 9 (7), e0003816 (2015).
