В настоящем Протоколе дневно обозначенных т. cruzi вводили в прозрачной данио рерио личинки, а паразит подвижности наблюдалось в естественных условиях с помощью микроскопии флуоресцирования света листа.
Болезнь Шагаса это паразитические инфекции, вызванные Trypanosoma cruzi, чьи моторики важно не только для локализации, но и для сотовых привязки и вторжения. Текущий животных моделей для исследования т. cruzi разрешить ограниченное наблюдение паразитов в естественных условиях, представляющий вызов для понимания поведения паразита на начальных этапах инфекции в организме человека. Этот простейших flagellar этап в вектор и млекопитающих хостов, но Есть никаких исследований, описывающих его подвижность в естественных условиях. Целью данного проекта было создать живой позвоночных zebrafish модель для оценки подвижности т. cruzi в сердечно-сосудистой системы. Прозрачные данио рерио, личинки вводили с дневно помечены trypomastigotes и наблюдается с помощью микроскопии флуоресцирования света листа (LSFM), неинвазивный метод визуализации живых организмов с высоким оптическим разрешением. Паразиты могут быть визуализированы для длительных периодов времени из-за этот метод относительно низкий риск по сравнению с конфокальный фотоповреждения или микроскопия помощью эпифлуоресцентного. Т. cruzi паразитов были замечены, путешествуя в системе кровообращения, живые рыбки данио рерио в разных размеров кровеносных сосудов и желток. Они могут также рассматриваться прилагаемый к стенке желточного мешка и предсердно клапан несмотря на мощные силы, связанные с сокращениями сердца. LSFM т. cruzi-привитых данио рерио личинок-это ценный метод, который может использоваться для визуализации, распространение паразитов и оценивать их тропизма, миграции и подвижности в динамической среде сердечно-сосудистой системы живых животных.
Болезнь Шагаса вызвано простейших паразитов т. cruzi. Примерно 6-7 миллионов человек во всем мире инфицированы т. cruzi. Заболевание передается главным образом в Латинской Америке, но уже сообщалось в Соединенные Штаты, Канада и многие европейские, а также некоторых стран Западной части Тихого океана, главным образом из-за миграции инфицированных лиц1. Шагаса в значительной степени трансмиссивных и переданы для людей контакта с калом hematophagic насекомых Триатомовые клопы подсемейства, широко известный как «целовать ошибок». Однако т. cruzi может также передаваться через переливание крови, вертикальная передача от матери ребенку, или употребление в пищу продуктов питания, загрязненных паразитов2. Острой фазе инфекции главным образом бессимптомно или конститутивно симптоматическая и длится от 6 до 8 недель, после чего участия иммунной системы контролирует паразита нагрузки, но не полностью устранить инфекции3. Большинство людей введите хронической бессимптомной фазы; Однако почти 30% больных разработать симптомом хронической фазы, в котором сердечно-сосудистой системы и реже пищеварительной и нервной систем, нарушенной4. Этот сценарий представляет собой проблему для лечения заболеваний и управления, поскольку Есть нет вакцины, и есть только два эффективных препаратов для Шагаса: benznidazole и нифуртимокс. Обе процедуры требуют длительного администрирования и может иметь серьезные побочные эффекты2.
Возросшее понимание поведения т. cruzi поведения в естественных условиях является ключом к определению паразитарные миграции, сотовой вложения и вторжения в пределах принимающей страны; отсутствие в vivo моделей ограничивает развитие новых терапевтических подходов. В vitro исследования т. cruzi инфекции показали, что подвижность trypomastigotes имеет важное значение для привязки к принимающей клеточных мембран и последующих клеточных вторжения5. Энергии истощения в trypomastigotes в культуре совместно с линией клеток восприимчивых было показано, уменьшить сотовой вторжения6. Интересно, что в trypanosomatids, flagellar движение также характеризуется как уклонение механизм против паразитов специфические антитела7.
Flagellar подвижность был широко изучены в пробирке в Trypanosoma brucei, тесно связанных паразита, который вызывает Африканский трипаносомоз8. В vitro исследования моторики этих трипаносом показал, что моделирование условий кровью или жидкостями организма, в том числе вязкость и наличие препятствий, представитель клеток крови, имеет важное значение для паразита движение вперед9 . Как еще он не удалось визуализировать движение паразитов в крови в естественных условиях.
Данио рерио личинки являются мощной модели для изучения хост возбудитель взаимодействий в естественных условиях. Они являются небольшими, недорогой и относительно легко поднять по сравнению с другими установленными позвоночных моделями для болезни Шагаса. Данио рерио имеют врожденного и адаптивного иммунитета похожи на людей, но их адаптивной иммунной системы начинает развиваться на 4 дня пост оплодотворение (dpf) и не созрели для еще несколько недель10. Во время раннего развития когда присутствуют только макрофагов, есть большое окно для изучения поведения паразита без немедленного вмешательства иммунной10. Однако самое главное преимущество использования данио рерио личинки как позвоночных модель для изучения поведения возбудителя заключается в их оптической прозрачности, что делает их поддаются микроскопических скрининг и изображений11. Кроме того есть несколько инструментов для обработки рыбы генетики. К примеру Каспер штамм — мутант линия данио рерио с без пигментации, что делает животное полностью транспарентным и полезным для визуализации отдельных органов и для слежение в реальном времени вводили клетки12.
Основным ограничением продольных наблюдения быстро движущихся паразитов в живой данио рерио с помощью конфокальной или микроскопия помощью эпифлуоресцентного заключается в невозможности изображений на приобретение высокой скорости и глубины проникновения больших с хорошим качеством изображения и низкой риск повреждений. Легкие лист флуоресценции micsroscopy (LSFM) является формирующейся Тепловизионная техника, которая преодолевает эти ограничения разрешить эти замечания. С помощью одной цели для обнаружения флуоресценции и вторая цель ортогональных освещения, что только освещает фокальной плоскости обнаружения цели, это возможность получения высокого разрешения оптического разделы как Конфокальный микроскоп, но с значительно сниженным фотоповреждения, даже в том, что касается эпифлуоресцентного микроскопии13. LSFM техника, используемая здесь называют одной плоскости освещения микроскопии (SPIM), в которой тонкий лист света освещает одной плоскости в пределах данио рерио личинки.
Цель этой методологии является установить личиночной данио рерио как жизнеспособной модели-инфекции для понимания т. cruzi подвижности и связанное с ним поведение в естественных условиях. Для этого, мы вводили прозрачный данио рерио личинки дневно обозначенные trypomastigotes, сотовых форме ответственность за заражение людей и определили движение т. cruzi в сердечно-сосудистой системы циркуляции данио рерио с помощью LSFM.
Это исследование подчеркивает преимущества данио рерио, как животной модели для изучения возбудителя поведения в естественных условиях. В частности, это исследование предлагает метод для визуализации патогенный т. cruzi в своей естественной среде: кровяной циркуляции. Окружающей среды кровообращения микроокружения рыб сопоставима с млекопитающих, и trypanosomatids были разработаны механизмы для путешествий, уклонение от иммунной системы и присоединение к клеткам для инфекции в этой среде25. Этот протокол предоставляет описание оптимальные процедуры для культуры т. cruzi в линию клеток человека и последующая изоляция flagellar форм для люминесцентные маркировки. Затем он показывает соответствующие параметры для успешного введения паразитов в прозрачной данио рерио позднее монтажа и визуализация с помощью LSFM. Наконец этот протокол предложений для эффективной и действенной в vivo визуализации движения в обращении с помощью LSFM и расположение паразита.
Жгутика трипаносом вытекает из его задней региона, вытекающих из тела клетки, и висит бесплатно на передней части организма26. Т. cruzi продвигает себя, размахивая жгутика впереди тела, которое ползёт паразита всего тела. Flagellar движения необходима не только для подвижность паразит, как и в случае brucei т.27 (возбудитель Африканский трипаносомоз), но он также используется для сотовых инфекции, как было продемонстрировано в т. cruzi5 ,28. Хотя данио рерио не естественный принимающей страны т. cruzi, паразита сократительной способности могут быть изучены в развивающейся сердечно-сосудистой системы циркуляции системы, используя протоколы, описанные здесь. Кроме того существуют виды трипаносом, заразить карповые, класс данио рерио, например т. carassii и т. borreliв25. Эти виды паразитов могут быть использованы для изучения в режиме реального времени движения и механизмы крепления этих trypanosomatids; такие исследования могут оказать понимание процесса инфекции клеток млекопитающих.
В этом исследовании, вводят подвижные cruzi т. паразиты были наблюдаемых путешествие через сердечно-сосудистой системы циркуляции привитых рыбы, перемещаясь вместе с непрозрачной эритроцитов и придерживаясь структуры в стенах сердечно-сосудистой системы. Мы использовали LSFM построенный дом с 10 X ахроматические рабочим расстоянием воздуха цель (17,6 мм) для освещения руку с числовой апертуры 0.25. 40 X цель погружения apochromatic воды с числовой апертуры 0,8 и рабочее расстояние 3,5 мм был использован для обнаружения руку. Цель обнаружения был погружен в палате образец, в то время как цель освещения был вне камеры. Порт в камере, запечатанный с coverslip и оптические клея допускается для освещения пучка войти в камеру, как показано в Лоренцо et al. 18 для освещения, мы использовали 50 МВт DPSS лазера на 488 нм, мощность которого был модулированные Акусто оптический перестраиваемый фильтр. Обнаружения пути используются фильтры совместим с зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) или FITC. Микроскопом света лист с держатель образца капиллярной (в идеале с автоматической ротации) и контроля температуры образца камеры должны быть пригодны для этого приложения. Микроскоп следует согласовать и калибровать согласно инструкциям производителя или пользователя Лаборатория стандартные протоколы до приобретения, в случае необходимости. В этом протоколе мы под контролем микроскопа с помощью программного обеспечения SPIM19.
Важно отметить, что в обращении данио рерио, личинок паразитических вложений является эффективным. В кардинал Вен паразиты оставался прилагаемый для до нескольких минут; в сердце они провели клапаны и стены, колеблющимся с сокращениями сердца. Дальнейшие исследования остаются с целью выяснения ли т. cruzi взаимодействует с течет эритроцитов, которые дрейф в направлении потока крови. Предыдущий в vitro исследования показали, что наличие твердых структур (например, клетки крови), или увеличению вязкости жидкости для имитации крови в пробирке, имеет значительное влияние на подвижность и скорость паразита 9.
Есть много вопросов относительно курса инфекции T. cruzi в организме человека после amastigotes побег фагоцитирующих клеток, первоначально инфицированной клетки типа29. К примеру как они приходят, чтобы их органы-мишени? Какие существуют механизмы для тропизм к предпочтительным органов, таких как инфаркт, пищеварительной и центральной нервной системы? Интересно, что в этом исследовании паразиты были изначально отображаемого в самом сердце потому, что это был сайт наивысшую плотность паразитов. Однако CFSE сигнал впоследствии накопленных в развивающихся кишечника путем инъекций пост 7 дней. Хотя анатомии рыб и млекопитающих отличается, результаты этого исследования демонстрируют формы тропизма, как было отмечено, что паразиты выставлены тропизм к органов известно предпочитаемая несмотря на научные разногласия. Одно существенное ограничение этого исследования касается температуры, используемых в экспериментах. Данио рерио личинки должны храниться около 28 °C в течение всей процедуры. Хотя эта температура может быть похож на узел вектор (насекомые Триатомовые клопы подсемейства), это сильно отличается от теплокровных млекопитающих, которые составляют окончательный хостов (около 37 ° C). Т. cruzi , как известно, имеют flagellar живых форм в обоих узлов; Однако важно иметь в виду, что этот фактор может иметь эффект в поведении животных в естественных условиях.
Хотя fish´s адаптивной иммунной системы не пожилые до 4 недель после оплодотворения, врожденная иммунная система активна в начале развития10. 48 или 96 hpf, в кратчайшие сроки фагоцитирующих клеток были замечены, что охватил помечены трипаносом (данные не показаны). Это ограничивает окно времени для визуализации паразита. Однако если исследование должно было сосредоточить внимание на оценке fish´s иммунный ответ, может быть рекомендовано инъекций на более поздних этапах. Кроме того инъекции паразитов в трансгенной рыбы строки с метками макрофаги или другие клетки иммунной системы может быть полезным при изучении паразита привязанность и эндоцитоз возможных механизмов. Важно отметить, что если паразитов помечены CFSE, трансгенными ячейку метки не должно быть GFP и маркер в желтого или красного конца спектра не требуется.
Для оценки подробных направление движения паразита, может быть полезно следовать их траектории в трех измерениях (3D). Для 3D визуализации и реконструкции процесса необходим высокоскоростной системы. С оборудование, используемое в настоящем Протоколе это возможно только для визуализации паразитов в одной плоскости. В этом случае мы и приоритетными для поддержания стабильности фокальной плоскости во время движения паразита, записи траектории в одной плоскости.
Методология, предложенная здесь прокладывает путь для дальнейшего расследования поведения паразита в сердечно-сосудистой системы циркуляции. Таким образом существенные шаги для визуализации живой флуоресцентный паразитов внутри данио рерио личинки являются:(i) использование раннего вылупившиеся эмбрионы (24-48 hpf) или личинок или животных между 72-96 hpf с без пигментации так, что они являются прозрачными и легко придать; (ii) изображения личинки как можно скорее после инъекции, чтобы избежать паразита фагоцитирующих клеток; и (iii) основное внимание LSFM на сайте интерес (например, перикарда район) и поддерживать фокус. Эта новая процедура позволяет визуализировать trypomastigotes в среде сопоставимы с ее природные инфекции нишу, обеспечивая для в первый раз возможность изучить т. cruzi в живом организме.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Convocatoria Interfacultades из Vicerrectoría de Investigaciones de la Универсидад де Лос Андеси программы USAID исследований и инноваций стипендий. Мы благодарим Хуан Рафаэль Буитраго и Yeferzon Ardila за рыба обслуживания и помощи.
0.5-10 μL Micropipette | Fisherbrand | 21-377-815 | |
Agarose RA | Amresco | N605 | Regular |
Agarose SFR | Amresco | J234 | Low Melting point |
Aquarium salt | Instant ocean | SS15-10 | |
Cell Count chamber | Boeco | Neubauer | |
Cell culture flasks | Corning | 430639 | |
Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
CFSE | ThermoFisher | C34554 | |
Detection objective | Nikon 40x 0.8NA | 40x CFI APO NIR | |
DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5648 | |
Dumont #5 fine forceps | World precision Instruments | ||
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
Fetal calf serum (FCS) | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
Filter | Chroma | ET-525/50M | |
Glass capillaries for embryo mounting | Vitrez Medical | 160215 | |
Glass capillaries for pulling needles | World precision instruments | TW100-4 | |
Glucose | Gibco | A2494001 | |
HEPES | Gibco | 156300-80 | |
Incubator | Thermo Corporation | Revco | |
Larval microinjection mold | Adaptive Science Tools | I-34 | |
Laser | Crystalaser | DL488-050 | |
L-glutamine | Gibco | 250300-81 | |
Methylene blue | Albor Químicos | 12223 | |
Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
Micromanipulator system | Sutter Instrument | MP-200 | For LSFM |
Micropipette puller device | Narishige | PC-10 | |
Microscope | Olympus | CX31 | |
Microscope (inverted) | Olympus | CKX41 | |
Multipurpose microscope | Nikon | AZ100M | |
Neubauer counting chamber | Boeco Germany | ||
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-163 | |
Petri dish 94×16 | Greiner bio-one | 633181 | |
Plastic pasteur pipette | Fisherbrand | 11577722 | |
Rotation stage | Newport | CONEX-PR50CC | |
RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R4130 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Stereoscope | Nikon | C-LEDS | |
Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | |
TRIS | Amresco | M151 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | R-001-100 | |
Tubes 15 ml | Corning | 05-527-90 |